Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM

Summary

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à des températures aussi élevées que 70 °C, avant la congélation pour les expériences cryo-EM.

Abstract

Les grilles d’échantillons pour les expériences de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) sont généralement préparées à une température optimale pour le stockage d’échantillons biologiques, principalement à 4 °C et parfois à température ambiante. Récemment, nous avons découvert que la structure protéique résolue à basse température peut ne pas être fonctionnellement pertinente, en particulier pour les protéines d’archées thermophiles. Une procédure a été développée pour préparer des échantillons de protéines à des températures plus élevées (jusqu’à 70 ° C) pour l’analyse cryo-EM. Nous avons montré que les structures provenant d’échantillons préparés à des températures plus élevées sont fonctionnellement pertinentes et dépendent de la température. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à haute température, en utilisant 55 °C comme exemple. L’expérience a utilisé un appareil de vitrification modifié à l’aide d’un tube de centrifugation supplémentaire, et les échantillons ont été incubés à 55 ° C. Les procédures détaillées ont été affinées pour minimiser la condensation de vapeur et obtenir une fine couche de glace sur la grille. Des exemples d’expériences réussies et infructueuses sont fournis.

Introduction

La technologie cryo-EM pour résoudre les structures des complexes protéiques a continué à s’améliorer, en particulier dans le sens de l’obtention de structures à haute résolution ^1,2. Entre-temps, le paysage de son application a également été élargi en variant les conditions d’échantillon telles que le pH ou les ligands avant le processus de vitrification³, qui implique la préparation de grilles d’échantillons suivie de la congélation^{plongeante 4,5}. Une autre condition importante est la température. Bien que les expériences cryo....

Protocol

NOTE: Ce protocole vise à utiliser un appareil de vitrification commerciale modifié pour préparer les échantillons de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à des températures spécifiques, en particulier supérieures à 37 ° C. La configuration expérimentale globale est illustrée à la figure 1. Le protocole utilise 55 °C comme exemple. Pour les conditions spécifiques à d’autres températures, veuillez vous référer au tableau supplémentaire 2 de la référence¹².

1. Préparation de l’appareil de vitrification

1. Faites un trou de 1 cm dans un tube centrifuge de 50 ml à son extrémité fe....

Results

La vue d’ensemble du faible grossissement est illustrée à la figure 5A,B. Le panneau A est un exemple de grille réussie. Il y a un gradient de glace du haut à gauche (plus épais) au bas à droite (plus mince ou vide). Une telle grille facilite la recherche d’une épaisseur appropriée de la couche de glace dans la zone médiane adaptée à la collecte de données, comme les cases bleue et verte. La grille B est trop sèche. Les carrés de la grille ont un contraste lumineux, ce qui s.......

Discussion

À l’étape 1 du protocole, assurez-vous que le tube de centrifugation a été bien installé et ne tombe pas lorsque l’expérience est en cours. En raison de l’accumulation d’un grand nombre de gouttelettes d’eau dans la chambre, ce qui pourrait modifier la capacité d’adsorption du papier filtre, il est recommandé de ne pas dépasser 30 minutes après que la chambre de l’appareil de vitrification ait atteint la température d’équilibre. Si le temps de fonctionnement dépasse 30 min, l’opérateur doit remplacer le papier filtre et .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube	Falcon Falcon	352070	format : 50 mL
Papier filtre	Ted Pella	47000-100	Ø ; 55/20mm, Grade 595
HI1210	Bain-marie	Leica
K100X	Microscopie électronique Sciences		décharge luminescente
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu	grid Ted Pella	658-200-CU-100
Titan Krios G3	Thermo Fisher Scientific	1063996	imagerie à faible dose
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	1086439
Pince à épiler	Vitrobot Ted Pella	47000-500