Un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote

Résumé

Cet article présente une méthode unique d’analyse des interactions hôte-microbiome à l’aide d’un nouveau système de culture d’organes intestinaux pour des expériences ex vivo.

Résumé

La structure du tissu intestinal facilite les interactions étroites et mutualistes entre l’hôte et le microbiote intestinal. Ces pourparlers croisés sont cruciaux pour maintenir l’homéostasie locale et systémique; les modifications de la composition du microbiote intestinal (dysbiose) sont associées à un large éventail de maladies humaines. Les méthodes de dissection des interactions hôte-microbiote englobent un compromis inhérent entre la préservation de la structure physiologique des tissus (lors de l’utilisation de modèles animaux in vivo) et le niveau de contrôle des facteurs expérimentaux (comme dans les systèmes de culture cellulaire in vitro simples). Pour remédier à ce compromis, Yissachar et al. ont récemment développé un système de culture d’organes intestinaux. Le système préserve une construction naïve du tissu du côlon et des mécanismes cellulaires et il permet également un contrôle expérimental serré, facilitant les expérimentations qui ne peuvent pas être facilement effectuées in vivo. Il est optimal pour disséquer les réponses à court terme de divers composants intestinaux (tels que les éléments épithéliaux, immunologiques et neuronaux) aux perturbations luminales (y compris les microbes anaérobies ou aérobies, les échantillons de microbiote entier de souris ou d’humains, les médicaments et les métabolites). Ici, nous présentons une description détaillée d’un protocole optimisé pour la culture d’organes de plusieurs fragments intestinaux à l’aide d’un dispositif de culture intestinale sur mesure. Les réponses de l’hôte aux perturbations luminales peuvent être visualisées par coloration par immunofluorescence de coupes de tissus ou de fragments de tissus à monture entière, hybridation in situ par fluorescence (FISH) ou imagerie accélérée. Ce système prend en charge un large éventail de lectures, y compris le séquençage de nouvelle génération, la cytométrie en flux et divers tests cellulaires et biochimiques. Dans l’ensemble, ce système de culture d’organes tridimensionnel prend en charge la culture de tissus intestinaux volumineux et intacts et a de vastes applications pour l’analyse à haute résolution et la visualisation des interactions hôte-microbiote dans l’environnement intestinal local.

Introduction

L’intestin est un organe très complexe contenant un large éventail de types cellulaires (cellules épithéliales, cellules du système immunitaire, neurones, etc.) organisés dans une structure particulière qui permet aux cellules d’interagir et de communiquer entre elles et avec le contenu luminal (microbiote, nourriture, etc.) ¹. Actuellement, la boîte à outils de recherche disponible pour l’analyse des interactions hôte-microbiote comprend des cultures cellulaires in vitro et des modèles animaux in vivo ². Les modèles animaux in vivo fournissent une construction tissulaire physiologique³ mais avec un mauvais contrôle expérimental et une capacité limitée à manipuler les conditions expérimentales. Les systèmes de culture in vitro, d’autre part, utilisent des cellules primaires ou des lignées cellulaires qui peuvent être complétées par des microbes^4,offrant un contrôle étroit sur les paramètres de l’expérience mais dépourvus de complexité cellulaire et d’architecture tissulaire. Les essais in vitro modernes permettent l’utilisation avancée d’échantillons de tissus humains sains et pathologiques, comme les organoïdes épithéliaux dérivés de sources souris ou humaines^5,6, et des échantillons qui imitent le microenvironnement muqueux⁷. Un autre exemple est le test « intestin sur puce », qui comprend la lignée cellulaire épithéliale du côlon humain (Caco2), la matrice extracellulaire et les canaux microfluidiques pour imiter l’état physiologique de l’invariant intestinal⁸. Cependant, aussi avancés et innovants que puissent être les échantillons in vitro, ils ne maintiennent pas une architecture tissulaire normale ou une composition cellulaire naïve.

Pour y remédier, Yissachar et al. ont récemment mis au point un système de culture d’organes ex vivo ⁹ (Figure 1)qui maintient des fragments intestinaux intacts ex vivo,bénéficiant des avantages des modèles in vivo et in vitro. Ce système de culture d’organes intestinaux ex vivo est basé sur un dispositif de culture sur mesure qui prend en charge une culture multiplexée de six tissus du côlon, permettant d’examiner les entrées expérimentales dans des conditions comparables tout en contrôlant les entrées et les sorties du système. Des travaux récents ont démontré que ce système est précieux pour analyser les réponses intestinales aux bactéries intestinales individuelles^9,aux échantillons de microbiote humain entier¹⁰ et aux métabolites microbiens^11. Ce système permet, pour la première fois, l’étude de ces interactions précoces hôte-microbiote avec un haut niveau de contrôle sur l’hôte, les composants microbiens et environnementaux. De plus, il permet de surveiller et de manipuler le système tout au long de l’expérience, en temps réel.

Figure 1: Schémas du dispositif de culture intestinale. Un fragment entier de tissu intestinal est attaché aux orifices de sortie et d’entrée de la chambre (en haut), avec des pompes régulant le flux de fluide à l’intérieur de la lumière et dans la chambre de milieu externe. L’ensemble de l’appareil (en bas) contient 6 chambres de ce type. Ce chiffre a été modifié à partir de Yissachar et al. 2017. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices en matière de soins aux animaux approuvées par le comité d’éthique pour le bien-être des animaux.

1. Préparation de l’expérience

1. Fabrication du dispositif de culture d’organes intestinaux (3 jours)
   1. À l’aide d’une imprimante 3D, imprimez les moules en plastique réutilisables pour le dispositif de culture d’organes (l’appareil a 6 puits, avec 24 petits et grands trous, et pour le couvercle du couvercle de l’appareil) (fichiers 3D joints).
      REMARQUE: Ces moules en plastique peuvent être utilisés pour la fabrication de nombreux appareils.
   2. Insérez les aiguilles à extrémité émoussée (22 G et 18 G) à la position appropriée dans le moule de l’appareil et coulez environ 20 g de mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS) (rapport poids 1:10, base/catalyseur) pour un ensemble de l’appareil et du couvercle.
   3. Placez les moules dans une chambre à vide pendant 30 min, pour éliminer les bulles d’air du mélange PDMS.
   4. Incuber les moules à 55 °C pendant la nuit, pour compléter la polymérisation PDMS.
   5. Lorsque le PDMS est réglé, retirez les aiguilles du moule et libérez soigneusement le dispositif de culture et le couvercle des moules en plastique.
   6. Retirez les résidus de PDMS du contour du puits à l’aide d’une lame chirurgicale. Fixez le dispositif PDMS et le couvercle de l’appareil sur un verre de couverture (micro-lames de 75 mm x 50 mm) à l’aide d’un adhésif au silicium non toxique et laissez les pièces se fixer pendant la nuit (appliquez la colle sur le côté lisse de l’appareil).
   7. Insérez douze aiguilles de 22 G pour la lumière et douze aiguilles de 18 G pour le puits. Fixez toutes les aiguilles en place à l’aide de silicone et laissez-les se fixer pendant la nuit. Insérez deux aiguilles de 18 G dans le couvercle du couvercle pour une bonne circulation de l’air à l’intérieur et à l’extérieur du dispositif de culture d’organes intestinaux.
   8. Vérifiez toutes les aiguilles pour les fuites à l’aide d’une seringue remplie d’eau. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite des puits en remplissant les puits d’eau.
   9. Placez deux nœuds chirurgicaux sur chaque aiguille de 22 G qui sera reliée au côlon. Placez l’appareil et le couvercle dans un sac en papier autoclave et stérilisez-le dans un autoclave.
2. Milieu de culture (0,5 h)
   1. Dans une hotte biologique, mélanger les éléments suivants (dans un tube de 50 mL) : 37 mL de milieu de Dulbecco modifié (IMDM) d’Iscove, 10 mL de remplacement sérique de KSR, 1 mL de supplément de B27, 0,5 mL de supplément de N2, 0,5 mL de tampon HEPES de 1 M et 0,5 mL d’acides aminés non essentiels.
   2. Filtrer et conserver le milieu complet à 4 °C.
3. Préparation des tubes et des outils chirurgicaux
   1. Coupez la longueur appropriée des tubes pour le lumen d’entrée, le puits d’entrée, le lumen de sortie et le puits de sortie (12 tubes courts et 12 tubes longs). Connectez un adaptateur approprié de chaque côté du tube.
   2. Préparez les outils chirurgicaux: ciseaux droits, 4x pinces minces et 2x pinces pointues.
   3. Placez les tubes et les outils chirurgicaux dans un sac en papier autoclave et stérilisez-les à l’aide d’un autoclave.
4. Préparer l’apport luminal (stimulation souhaitée - bactéries, selles, médicaments, etc.).
   1. Avant l’expérience, déterminer la charge bactérienne de la culture bactérienne, par dilutions en série¹², et la culture dans des conditions aérobies et/ou anaérobies.
   2. Après avoir calculé la charge bactérienne, diluer les cultures bactériennes dans un milieu de culture tissulaire stérile pour obtenir la concentration bactérienne requise. Pour les échantillons fécaux, filtrer à l’aide d’une passoire de 100 μm.
      REMARQUE: Pour la stimulation non bactérienne (médicaments, métabolites, etc.), diluer la substance à la concentration requise en utilisant le milieu de culture intestinal.

2. Préparation de la configuration de l’expérience

1. À l’intérieur de l’incubateur de culture d’organes, allumez l’unité de chauffage et réglez-la à 37 ° C.
2. Installez les pompes ainsi que les seringues d’entrée et de sortie.
3. Entrée de milieu de culture tissulaire
   1. Dans une hotte à écoulement biologique ou laminaire, remplissez les seringues du puits d’entrée avec un milieu de culture complet. Le volume final dépend de la durée de l’expérience et du débit ; habituellement 1 mL/h plus un milieu supplémentaire pour la purge.
   2. Connectez les tubes aux seringues à l’aide de l’adaptateur Luer-lock. Placez les seringues remplies dans les pompes à seringues.
   3. Purgez les seringues d’entrée. Assurez-vous que le milieu du puits s’écoule de tous les tubes dans un verre usagé.
4. Entrée luminale
   1. Remplissez les seringues d’entrée luminale avec un traitement de stimulation (bactéries, médicaments, etc.). Le volume dépend de la durée de l’expérience et du débit (généralement 30 μL/h plus milieu supplémentaire pour la purge).
   2. Connectez les tubes aux seringues à l’aide de l’adaptateur Luer-lock. Placez les seringues remplies dans les pompes à seringues.
   3. Purger les seringues d’entrée. Assurez-vous que la stimulation s’écoule de tous les tubes dans un verre usagé. Attention à ne pas contaminer les différentes stimulations.
5. Sorties
   1. Placez les seringues vides dans les pompes à seringues de sortie (réglez le mode pompe sur « retrait »).
6. Configuration de l’appareil
   1. Réglez le régulateur qui contrôle le débit du mélange de gaz (95% O₂ + 5% CO₂₎pour un débit doux et minimal.
   2. Examinez l’appareil dans une hotte laminaire.
   3. Rincez les aiguilles de l’appareil avec de l’IMDM stérile pour laver les aiguilles.
   4. Ajouter 500 μL de milieu de culture stérile dans chaque puits de l’appareil.
7. Préparation à la dissection tissulaire
   1. Placez les outils chirurgicaux stériles à l’intérieur de la hotte laminaire.
   2. Remplissez une seringue de 10 mL avec de l’IMDM stérile et connectez une aiguille stérile (autoclavée) à extrémité émoussée de 22 G pour le rinçage du côlon.

3. Cultures d’organes

1. Sacrifice de souris et dissection tissulaire
   1. Dans une hotte laminaire, sacrifiez des souris âgées de 12 à 14 jours par décapitation. Vaporisez les souris avec 70% d’éthanol et placez les souris sur une plaque en plastique.
   2. À l’aide de ciseaux et de pinces tranchants, disséquez la souris et retirez le tube digestif de l’estomac à l’anus en coupant toute la graisse et les tissus conjonctifs. Coupez le côlon et placez-le sur une nouvelle assiette.
      REMARQUE: Minimiser le contact avec le tissu du côlon. Ne touchez pas la partie centrale du tissu du côlon. Tenez le tissu doucement et seulement sur les bords du tissu.
2. Rinçage et lavage du côlon
   1. Sous un microscope à dissection, rincer doucement le contenu du côlon avec de l’IMDM stérile (dans le côté proximal) avec la seringue préparée de 10 mL (étape 2.7.2). Après avoir retiré les matières fécales du tissu intestinal, placez le côlon dans une nouvelle plaque de 6 puits remplie de 0,5 mL de DMI stérile.
3. Connexion du côlon à l’appareil
   1. Prenez le tissu et connectez-le soigneusement sur l’aiguille de 22 G et faites une cravate serrée avec les deux fils. À ce stade, il est impératif de maintenir l’orientation correcte du côlon par le flux lumineux (proximal = entrée, distal = sortie). Répétez les étapes 3.2 à 3.3 pour les 6 tissus.
   2. Vérifiez que les verrous Luer de l’aiguille d’entrée sont vides du support. Sinon, videz-les. Ajoutez des stimulations à l’aiguille d’entrée Luer lock (pour éviter l’entrée de bulles d’air dans la lumière). Répétez cette étape pour chaque côlon avec la stimulation appropriée.
   3. Vérifiez que tous les tissus sont connectés et placez le couvercle du couvercle sur le dessus de l’appareil.
4. Connexion du dispositif de culture d’organes aux pompes
   1. Placez l’appareil dans la chambre préchauffée à température contrôlée (37 °C).
5. Connecter le flux de gaz
   1. Connectez l’adaptateur de gaz au couvercle du couvercle à l’aide de l’aiguille d’entrée appropriée.
   2. Connectez les tubes d’entrée et de sortie à l’appareil.
      REMARQUE: Connectez le côté proximal du côlon aux bacs d’entrée.
6. Purgez la lumière avec les entrées de stimulation.
   1. Appliquez doucement la stimulation luminale à travers l’intestin et vérifiez l’écoulement du milieu dans les tubes de sortie.
   2. Laver le support externe.
   3. Lavez le milieu externe 3 fois (réglez les pompes à une vitesse de 600 μL/min pour bien entrer et sortir). Chaque lavage dure 1 min (en commençant par vider le puits).
7. Démarrez l’expérience.
   1. Démarrez les pompes aux taux suivants :
      Débit: lumen: entrée- 30 μL / h, sortie- 35 μL / h
      Milieu externe: entrée- 1000 μL / h, sortie - 950 μL / h
      REMARQUE: Le temps d’expérience peut varier entre 30 min et 24 h.
8. Fin de l’expérience (jusqu’à 24 h pour les cultures d’organes du côlon)
   1. Déconnectez tous les tubes de l’appareil.
   2. Débranchez les tissus des aiguilles et continuez jusqu’aux lectures souhaitées.

Résultats

Le système de culture d’organes intestinaux maintient la viabilité des tissus ex vivo. L’évaluation de la viabilité des tissus a été effectuée tout au long de la période de culture. Des fragments de tissu du côlon ont été incubés dans le système de culture d’organes intestinaux et fixés après une culture de 2/12/24 h. L’intégrité de la couche de cellules épithéliales intestinales (CEI) a été validée par coloration par immunofluorescence à l’aide d’anticorps E-cadhérine et cytokératine-18. De même, des cellules d...

Discussion

Cet article décrit un protocole optimisé pour les cultures d’organes intestinaux ex vivo que Yissachar et al. ont récemment développé (publié⁹ et données non publiées). Le système de culture d’organes intestinaux prend en charge la culture multiplexée de fragments intestinaux intacts tout en maintenant le flux luminal. Il offre un contrôle total sur l’environnement intra et extra-luminal (y compris la dose de stimulation, le temps d’exposition et le débit) et préserve la structure naïve d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
device
18 Aiguille émoussée	Mcmaster	75165a754
Aiguille émoussée de calibre 22	Mcmaster	75165a758
Adhésif tout usage Selant 100 % silicone	DAP	688
Dessiccateur cubique sous vide VDC-21+ 2 étagères		AAAD4021
Diapositive en verre 1 mm d’épaisseur	Corning	2947-75X50
Mini incubateur im-10		AAH24315K
MPC 301E POMPE		VI-412711
Bouchons d’accouplement de tube à rotation rapide en plastique	Mcmaster	51525k121
Douilles d’accouplement de tube à rotation rapide en plastique	Mcmaster	52525k211
Sylgard 184 Élastomère de silicone	Dow		Polydiméthylsiloxane, Tube PDMS
	Mcmaster	6516T11
Zortrax M200	Zortrax		Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Matériaux : z-ultrat	Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Sans sérum	Thermo Fisher Scientific
Tampon 17504044 HEPES (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630056
Milieu Dulbecco’s modifié d’Iscove avec rouge de phénol (1x)	Thermo Fisher Scientific	12440061
Knock-Out Serum	Thermo Fisher Scientific	10828028 Supplément N2
(100x)	Thermo Fisher Scientific	A1370701
Non Acide aminé essentiel (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140035
Surgical Tools
Large Scissors	Aseltech	11-00-10
Sharp Forceps	F.S.T	11297-10
Fil chirurgical tressé en soie	SMI	8010G
Ciseaux droits	F.S.T	14091-09
Pince mince	F.S.T	11051-10
Organ System
0.1 & micro ; m Filtre			de la vie
0.22 µ ; m Filter	Life Gene
5 mL Seringue Luer Lock	B-D	309649
Microscope stéréoscopique Greenough	ZEISS	Stemi 305
Réchauffeur d’air de précision à recirculation « CUBE"CUBE-2-LIS
Seringue Pompe	New Era Pump Systems inc	nep-ne-1600-em

à vide Gène