Article de méthode

Fonctionnalisation des vésicules extracellulaires dérivées de plaquettes des implants Ti

DOI :

10.3791/62781

⸱

5 août 2021

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1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB), 4Department of Fundamental Biology and Health Sciences, University of the Balearic Islands

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici une méthode d’isolement des vésicules extracellulaires (VE) dérivées des lysats plaquettaires (PL) et leur utilisation pour le revêtement des surfaces implantaires en titane (Ti). Nous décrivons la méthode de revêtement par coulée goutte, le profil de libération des VE des surfaces et la biocompatibilité in vitro des surfaces Ti revêtues de VE.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanovésicules biologiques qui jouent un rôle clé dans la communication cellulaire. Leur contenu comprend des biomolécules actives telles que des protéines et des acides nucléiques, qui présentent un grand potentiel en médecine régénérative. Plus récemment, les VÉHICULES dérivés du lysat plaquettaire (PL) ont montré une capacité ostéogénique comparable à la PL. En outre, les biomatériaux sont fréquemment utilisés en orthopédie ou en restauration dentaire. Ici, nous fournissons une méthode pour fonctionnaliser les surfaces Ti avec des véhicules électriques dérivés de PL afin d’améliorer leurs propriétés ostéogéniques.

Les VE sont isolés du PL par chromatographie d’exclusion de taille, puis les surfaces Ti sont fonctionnalisées avec des PL-EV par coulée goutte. La fonctionnalisation est prouvée par la libération des VE et sa biocompatibilité par le test de libération de lactate déshydrogénase (LDH).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les VE sont des vésicules membranaires (30-200 nm) sécrétées par n’importe quelle cellule et jouent un rôle clé dans la communication de cellule à cellule en livrant leur cargaison. Ils contiennent une variété de biomolécules actives qui peuvent inclure des acides nucléiques, des facteurs de croissance ou des lipides bioactifs1. Pour ces raisons, les VE ont été évalués pour leur utilisation potentielle dans les thérapies. En termes d’orthopédie et de régénération osseuse, des véhicules électriques de différentes sources ont été testés. Parmi eux, il a été démontré que les VE dérivés de plaquettes induisent un effet de différenciation sur les cellules souches tout en maintenant un faible profil cytotoxique2,3. Par conséquent, d’autres recherches sont nécessaires pour explorer la possibilité de combiner les VE avec des biomatériaux afin de les utiliser dans la pratique clinique quotidienne.

Les biomatériaux à base de titane sont largement utilisés comme échafaudages pour les interventions cliniques de guérison osseuse en raison de leurs propriétés mécaniques, de leur biocompatibilité élevée et de leur durabilité à long terme4. Néanmoins, les implants Ti sont un matériau bioinerte et, par conséquent, présentent une faible capacité de liaison avec le tissu osseux environnant5. Pour cette raison, des modifications du titane sont à l’étude afin d’améliorer leurs performances en réalisant un microenvironnement plus fonctionnel à sa surface4,6,7. En ce sens, les véhicules électriques peuvent être ancrés au titane par des interactions chimiques8 ou physiques9,10. Les VE immobilisés dérivés de cellules souches ou de macrophages améliorent la bioactivité du Ti en favorisant l’adhésion et la prolifération cellulaires, induisant ainsi un effet ostéogénique8,9,10.

Cet article se concentrera sur une stratégie de coulée goutte à goutte pour le revêtement des surfaces Ti avec des véhicules électriques dérivés de PL en détail. De plus, nous évaluerons le profil de libération des VE de la surface revêtue au fil du temps et confirmerons sa biocompatibilité cellulaire in vitro.

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Protocole

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Le lysat plaquettaire (PL) est obtenu comme décrit précédemment conformément aux directives institutionnelles3 en utilisant des manteaux bouffants frais fournis par la biobanque IdISBa comme matériau de départ. Leur utilisation pour le projet actuel a été approuvée par son comité d’éthique (IB 1995/12 BIO).

1. Isolation des véhicules électriques du PL

  1. Enlèvement des corps plus grands
    1. Décongeler le PL à température ambiante.
    2. Centrifuger PL à 1 500 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez la pastille car elle contient des débris cellulaires.
    3. Recueillir le surnageant et effectuer deux centrifugations consécutives à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
      REMARQUE: La pastille correspond à des véhicules électriques plus grands tels que des microvésicules, et dans ce cas, elle est jetée.
    4. Filtrer le surnageant d’abord à travers une membrane poreuse de 0,8 μm, puis à travers une membrane poreuse de 0,2 μm.
      REMARQUE: Ces étapes suppriment tous les véhicules électriques non souhaités.
    5. Mettre en commun le PL filtré et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
  2. Chromatographie d’exclusion de taille
    1. Équilibrez la colonne couplée à l’équipement de chromatographie au débit souhaité avec du PBS filtré.
      REMARQUE: Le débit utilisé dépend des caractéristiques de la colonne; dans ce cas, il est réglé sur 0,5 mL/min.
    2. Chargez le PL traité (5 mL) avec une seringue sur l’équipement.
    3. Injectez le PL dans la colonne et commencez à collecter des fractions de 5 mL dans des tubes de 15 mL.
    4. Collectez les fractions enrichies des VE et stockez-les à -80 °C jusqu’à leur utilisation.
      REMARQUE: Lorsque vous effectuez l’expérience pour la première fois, caractérisez toutes les fractions par quantification des protéines et immunodétection pour déterminer celle enrichie en VE3,11. Dans cette expérience, la 9ème fraction est collectée.
    5. Laver la colonne chromatographique avec 30 mL de solution de NaOH à 0,2 % et la stocker dans une solution d’éthanol à 20 % une fois qu’elle atteint l’équilibre.

figure-protocol-1
Figure 1 : Diagramme schématique de l’isolement des vésicules extracellulaires (VE) du lysat plaquettaire (PL). Le PL est d’abord centrifugé à 1 500 x g, puis à 10 000 x g pour éliminer les corps plus gros. Le surnageant est filtré à travers des filtres de 0,8 et 0,2 μm. Le PL traité est chargé sur la colonne et les VE sont séparés par chromatographie d’exclusion de taille. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Caractérisation des véhicules électriques

REMARQUE : La caractérisation des véhicules électriques est nécessaire pour effectuer des études fonctionnelles12. La microscopie électronique ou la caractérisation par transfert de Western ont déjà été rapportées13. Ce rapport se concentrera sur les techniques de caractérisation essentielles pour la fonctionnalisation de surface Ti.

  1. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
    1. Diluer les VE (1:1000) dans du PBS filtré de 0,2 μm.
      REMARQUE: Les échantillons trop concentrés ou trop dilués seront hors de portée pour la détermination de la NTA, et un ajustement sera nécessaire.
    2. Chargez 1 mL des véhicules électriques dilués avec une seringue dans l’équipement NTA et injectez-les dans l’équipement NTA.
    3. Suivez le protocole du fabricant pour la détermination de la concentration des particules et de la distribution granulométrique.
  2. Concentration en protéines
    1. Déterminer la concentration à l’aide de 1 μL de la solution des VE. Mesurez l’absorbance avec un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 280 nm.
      REMARQUE: Les VE doivent présenter de faibles niveaux de protéines par rapport au nombre de particules.
    2. Suivez les instructions du fabricant pour obtenir la lecture de l’absorbance à l’aide du spectrophotomètre.

3. Fonctionnalisation de la surface du titane

REMARQUE: Dans cette méthode, des disques en titane usinés, c.p. grade IV, 6,2 mm de diamètre et 2 mm de hauteur, sont utilisés. Les disques peuvent être manipulés avec une pince Ti, mais il est important de ne pas rayer la surface. De plus, le côté usiné doit être orienté vers le haut pendant tout le processus.

  1. Ti disques lavage
    REMARQUE: Le volume de solutions utilisées pour le lavage Ti devrait être suffisant pour couvrir les disques Ti. Placez les disques Ti dans un bécher en verre et versez-y des solutions. Ensuite, retirez la solution par décantation.
    1. Lavez les implants Ti avec de l’eau désionisée (DI), puis jetez l’eau.
    2. Lavez les implants Ti avec de l’éthanol à 70%, puis décantez pour retirer la solution.
    3. Placez les implants dans de l’eau DI et soniquez à 50 °C pendant 5 min. Jetez l’eau.
    4. Incuber des implants Ti dans une solution de NaOH à 40% à 50 °C pendant 10 min avec agitation. Jetez la solution.
      ATTENTION: La solution de NaOH réchauffe pendant la préparation. La solution est corrosive et doit être utilisée à l’intérieur d’une hotte.
    5. Sonicer les implants dans de l’eau DI à 50 °C pendant 5 min, puis retirer l’eau.
    6. Effectuez plusieurs lavages avec de l’eau DI (au moins 5) jusqu’à ce qu’elle atteigne un pH neutre. Vérifiez le pH avec des indicateurs de pH.
    7. Sonicer les implants dans de l’eau DI à 50 °C pendant 5 min et retirer l’eau.
    8. Incuber les implants Ti dans une solution HNO3 à 50% à 50 °C pendant 10 min avec agitation. Supprimez la solution.
      ATTENTION: HNO3 est une substance corrosive et oxydante, et il doit être utilisé à l’intérieur d’une hotte.
    9. Sonicer les implants dans de l’eau DI à 50 °C pendant 5 min. Retirez l’eau.
    10. Effectuer plusieurs lavages à l’eau DI (au moins 5) jusqu’à l’obtention d’un pH neutre. Vérifiez le pH avec des indicateurs de pH.
    11. Sonicer les implants dans de l’eau DI à 50 °C pendant 5 min. Retirez l’eau.
      REMARQUE: À ce stade, l’expérience peut être arrêtée en stockant les implants Ti dans une solution d’éthanol à 70%.
  2. Ti passivation
    REMARQUE: Les étapes de passivation Ti sont effectuées en recouvrant complètement les disques Ti avec les différentes solutions dans l’ordre indiqué ci-dessous. Les disques Ti sont placés dans un bécher en verre et les solutions sont doucement versées dessus. Les volumes utilisés dans toutes les étapes de lavage doivent recouvrir complètement les implants et sont retirés par décantation.
    1. Incuber les implants Ti dans une solution HNO3 à 30 % pendant 30 min à température ambiante sous une légère agitation. Supprimez la solution.
    2. Effectuez plusieurs lavages avec de l’eau DI (au moins 5) jusqu’à ce qu’elle atteigne un pH neutre. Vérifiez le pH avec des indicateurs de pH.
    3. Incuber les implants Ti pendant la nuit à température ambiante dans de l’eau DI.
    4. Sécher les implants sous vide à 40 °C pendant 10 min.
  3. Rejet de vériaux de VE
    REMARQUE: Pour les études fonctionnelles cellulaires, il est important de travailler dans une armoire de culture cellulaire.
    1. Placez les implants Ti dans une plaque de 96 puits, avec le côté usiné vers le haut.
      REMARQUE: Si les implants sont retournés à l’envers, une aiguille peut être utilisée pour les remettre en place.
    2. Décongelez la solution des véhicules électriques et mélangez-les avec de l’agitation. Utilisez un vortex pour pulser pendant 3 s.
    3. Déposez les véhicules électriques sur la surface ti. Dans cette étude, des gouttes de 40 μL de solution de VE sont placées sur le Ti pour immobiliser un maximum de 4 x 1011 VE par implant selon la concentration déterminée par NTA.
    4. Placer les plaques contenant le Ti sous vide à 37 °C jusqu’à ce que les gouttes soient complètement sèches (~2 h).
      REMARQUE: Ajustez le temps en fonction du nombre d’implants et de l’eau présente dans la chambre à vide.

figure-protocol-2
Figure 2 : Schéma de la passivation ti et de la fonctionnalisation des VE par coulée de gouttes. Les implants Ti sont d’abord passivés par incubation pendant 30 min dans une solution HNO3 à 30% à température ambiante. Après plusieurs lavages à l’eau DI, le pH atteint le neutre. Ensuite, les implants Ti sont incubés pendant la nuit à température ambiante dans de l’eau DI. Après cela, les implants sont séchés dans des conditions de vide à 40 ° C. Pour l’immobilisation des VE, 40 μL de solution de VE sont déposés sur les implants Ti. Ensuite, les implants sont incubés sous vide pendant 2 h jusqu’à ce que les véhicules électriques soient physiquement liés à la surface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Caractérisation de la surface ti

  1. Étude de libération
    1. Incuber la surface ti avec 200 μL de PBS filtré à 37 °C.
      REMARQUE: PBS est filtré pour éviter les interférences avec la mesure NTA.
    2. Remplacez le PBS à différents points temporels et conservez-le à -80 °C.
      REMARQUE : Dans cette étude, des périodes de 2, 6, 10 et 14 jours ont été analysées.
    3. Analyser le PBS stocké pour les études de particules par NTA selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE: La concentration de particules dans le PBS à différents moments est une représentation du profil de libération des VE au fil du temps.
  2. Études de biocompatibilité
    REMARQUE: Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain (hUC-MSC) sont obtenues à partir de la biobanque IdISBa conformément aux directives institutionnelles.
    1. Maintenir hUC-MSC dans DMEM faible teneur en glucose complété par 20% FBS jusqu’à l’utilisation. Changez le support deux fois par semaine.
    2. Pour l’ensemencement cellulaire, lavez les cellules dans des flacons avec 5 mL de PBS deux fois.
    3. Trypsiniser hUC-MSC en ajoutant 1 mL de solution de trypsine. Assurez-vous qu’il recouvre complètement la monocouche de cellules. Retirer la solution de trypsine et placer la fiole de culture cellulaire à 37 °C pendant environ 2 min. Visualisez le détachement des cellules au microscope. Les cellules détachées apparaîtront de forme ronde et seront en suspension.
    4. Remettre en suspension des cellules dans le DMEM à faible teneur en glucose avec 1% de VE épuisé FBS.
      REMARQUE: Préparez un média complété par 1% de FBS, puis une ultracentrifugeuse à 120 000 x g pendant 18 h pour éliminer les FBS-EV. Il est important d’enlever les VE pour éviter les interférences avec les VE plaquettaires.
    5. Déterminer la concentration cellulaire en comptant le nombre de cellules avec une chambre de Neubauer14.
    6. Porter hUC-MSC à une concentration de 50 000 cellules/mL.
    7. Ensemencez 200 μL de la solution cellulaire sur les implants Ti.
    8. Après 48 h, prélever 50 μL de milieu et effectuer la détermination cytotoxique à l’aide du kit d’activité lactate déshydrogénase (LDH), conformément au protocole du fabricant.

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Résultats

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La méthode présentée dans cet article permet d’obtenir des disques de titane fonctionnalisés par VE. Les véhicules électriques sont physiquement liés à la surface, ce qui permet une libération prolongée au fil du temps. La quantité de VE libérés peut être mesurée par NTA les jours 2, 6, 10 et 14. Les premières mesures, le jour 2, montrent qu’environ 109 véhicules électriques sont libérés, suivis d’une libération prolongée le jour 6 (~ 108 véhicules électriques); jour 10 (~107 VE) et jour ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole vise à fournir des instructions claires pour la fonctionnalisation des véhicules électriques sur les surfaces Ti. La méthode présentée est basée sur une stratégie de coulée de goutte, qui est un type de fonctionnalisation de type physisorption. Il existe une mauvaise bibliographie concernant la fonctionnalisation des VE sur les surfaces Ti, bien qu’il existe peu d’études montrant des avantages différents en immobilisant les VE sur Ti10. Quoi qu’il en soit, certaines des stratégies exp...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par l’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinancée par le Fonds social européen du FSE et le Fonds européen de développement régional du FEDER (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), et PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financés par la taxe de tourisme durable des îles Baléares.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,8 et micro ; Filtre à seringueSartorius16592K
1,5 mL Tube à centrifugerSPL sciences de la viePLC60015
Seringue de 1 mlBD303174
plaque de culture à 96 puitsSPL sciencesde
Éthanol absolutScharlauET0006005PUtilisé pour préparer de l’éthanol à 20 % avec de l’eau Milli-Q® ;
AKTA système de purificationGE Healthcare8149-30-0014
Centrifugeuse Allegra X-15RBeckman Coutler392934SX4750A rotor oscillant
Centrifuge 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11
Tube conique, fond conique, 50mlSPLPLC50050
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)Roche11644793001
Seringues jetables 10 mlBecton DickinsonBDH307736
DMEM Low Glucose GlutamaxGIBCO21885025
Dulbecco’s PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
Sérum fœtal bovin (FBS) Embrionic CertifiéGIBCO16000044
Filtropur S 0.2 µ ; m filtre à seringueSarstedt83.1826.001
HiPrep  ; 16/60 Sephacryl  ; S-400 HRGE Healthcare28-9356-04Colonnes préfabriquées
Cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain (hUC-MSC)IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 spectrophotomètreThermoFisherND-2000
NanoSight NS300 Analyse de suivi des nanoparticulesMalvernNS300Dispositif avec laser intégré à &lambda ;= 532 nm et caméra sCMOS
AiguilleTerumo946077135
Acide nitrique 69,5 %ScharlauAC16071000
Optima L-100 XP UltracentrifugeuseBeckman Coulter8043-30-1124SW-32Ti Rotor
Pénicilline-Streptomycine Solution 100XBiowestL0022
Bandelettes de test de pH 4.5-10.0SigmaP-4536
Lysat de plaquettes (PL)IdISBa BiobankObtenu à partir de couches leucocytaires jetées après un don de sang
Bacs de centrifugeuse en polypropylèneBeckman Coutler326823
Power wave HTBioTek 10340763
Tube à bouchon à vis, 15 ml, (LxØ ;) : 120 x 17 mm, PP, avec impressionSarstedt62554502
Sodium hidroxideSharlauSO04251000
Implants en titane répliques Implantmedia, SANATitane grade IV. Diamètre : 6,2 mm. Hauteur : 1,95 mm
Trypsine-EDTA 1 xBiowestL0930
Tryton X100SigmaT8787
la vie PLC30096

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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