Transduction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus

Summary

Nous décrivons une technique de transduction transitoire rapide à différents stades de développement d’Echinococcus granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération.

Abstract

L’échinococcose kystique ou maladie hydatide est l’une des maladies parasitaires zoonotiques les plus importantes causées par Echinococcus granulosus, un petit ténia hébergé dans l’intestin des chiens. Il est urgent de mener des recherches en génétique appliquée pour comprendre les mécanismes de la pathogenèse et du contrôle et de la prévention des maladies. Cependant, l’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes entrave l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris l’espèce Echinococcus . La présente étude démontre le potentiel de transduction transitoire du gène lentiviral dans les formes métacestode et strobilée d’E. granulosus. Les protoscoléces (CSP) ont été isolées à partir de kystes hydatides et transférées dans des milieux de culture biphasiques spécifiques pour se développer en vers strobilés. Les vers ont été transfectés avec le lentivirus de troisième génération récolté, ainsi que des cellules HEK293T comme contrôle du processus de transduction. Une fluorescence prononcée a été détectée chez les vers strobilés sur 24 h et 48 h, indiquant une transduction lentivirale transitoire chez E. granulosus. Ce travail présente la première tentative de transduction transitoire à base de lentivirus chez les ténias et démontre les résultats prometteurs avec des implications potentielles dans des études expérimentales sur la biologie des vers plats.

Introduction

L’échinococcose kystique (EC) est l’une des plus importantes maladies helminthes causées par Echinococcus granulosus, un petit ténia de la famille des Taeniidae ^1,2. Des études approfondies sur le développement d’immunodiagnostics et de vaccins contre E. granulosus ont été réalisées. Cependant, une connaissance insuffisante de la base moléculaire de la biologie parasitaire pose des limites majeures dans le diagnostic, la gestion et la prévention de la maladie hydatide 3,4,5,6.

Protocol

Cette étude a été approuvée par le National Institute for Medical Research Development et le Research Ethics Review Committee, No. 958680. Les lentivirus sont classés comme organismes BSL-2; par conséquent, toutes les procédures de culture en laboratoire de ce protocole ont été effectuées à l’aide de pratiques de laboratoire stériles et menées sous une hotte à écoulement laminaire conformément aux directives des NIH. La figure 1 illustre une présentation schématique du protocole d’étude pour les différents stades d’E. granulosus .

1. Collecte des kystes hydatiques

1. Recueillir ....

Results

Nous décrivons ici une technique de transduction transitoire rapide et efficace chez E. granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération. Nous avons cultivé des CSP dans un milieu de culture biphasique pour obtenir des vers strobilés, comme décrit précédemment^25,26. Les protoscolèces se développent en vers strobilés après 6 semaines in vitro. Différents stades d’E. granulosus ont été observés dans le milieu de cu.......

Discussion

Comprendre la base moléculaire des nématodes et la biologie de Platyhelminthes est crucial pour comprendre la pathogénicité des parasites zoonotiques²⁷. L’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes est un obstacle majeur à l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris les espèces d’Echinococcus ^12,27. La présente étude démontre l’excellent potentiel du lentivirus dans la transdu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaques de culture 12 puits	SPL Life Sciences	30012
25 cm2 Flacon de culture	SPL Life Sciences	70325
Plaques de culture 6 puits	SPL Life Sciences	30006
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	C4901-500G	Concentration de travail : 2,5 mM
CMRL 1066 moyen	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2 incubateur	memmert	ICO150
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Life Technology	12100046
Bile de			Isolé d’un chien euthanasié et stérilisé par 0,2 &mu ; Filtre à seringue
m Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	préparer 0,1 % d’Eosin pour le test d’exclusion de travail
Sérum de veau fœtal (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Inactivation thermique  ; de  ; FBS (30 min à 40 ° ; C)
Sérum de veau fœtal (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Inactivation thermique  ; de  ; FCS (30 min à 40 ° ; C)
HEK293T cellules	BONbiotech	BN_0012.1.14	Rein embryonnaire humain 293T
HEPES solution saline tamponnée (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x concentré
Microscope à fluorescence inversée	OLYMPUS	IX51
Pénicilline	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	Concentration de travail : 100 UI/mL
Pepsin	Roche	10108057001	Concentration de travail : 2 mg/mL, pH 2
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	DNAbiotech	DB0011	Ce réactif se résout en moins de 1 min dans D.W
Polybrene (réactif de transfection)	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RPMI medium	BioIdea	BI-1006-05
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Streptomycine	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Concentration de travail : 100 &mu ; g/mL
Plasmide lentiviral de troisième génération (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Vecteur de transfert (obtenu commercialement du Département de recherche en médecine moléculaire du Centre universitaire iranien pour l’éducation, la culture et la recherche (ACECR), Mashhad, Iran)
Plasmide lentiviral de troisième génération (pLPI et pLPII)	Invitrogen (Life Technologies)	K4975-00	Vecteur auxiliaire (obtenu commercialement auprès du Département de recherche en médecine moléculaire du Centre universitaire iranien pour l’éducation, la culture et la recherche (ACECR), Mashhad, Iran)
Plasmide lentiviral de troisième génération (pMD2G)	Addgene	Plasmid 12259	Vecteur auxiliaire (obtenu commercialement du Département de recherche en médecine moléculaire du Centre universitaire iranien pour l’éducation, la culture et la recherche (ACECR), Mashhad, Iran)
Tampon Tris/EDTA (TE)	DNAbiotech	DB9713-100ml
Trypsine	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x solutions de travail (pH 7.4&ndash ; 7.6)