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Cette étude a été approuvée par le National Institute for Medical Research Development et le Research Ethics Review Committee, No. 958680. Les lentivirus sont classés comme organismes BSL-2; par conséquent, toutes les procédures de culture en laboratoire de ce protocole ont été effectuées à l’aide de pratiques de laboratoire stériles et menées sous une hotte à écoulement laminaire conformément aux directives des NIH. La figure 1 illustre une présentation schématique du protocole d’étude pour les différents stades d’E. granulosus .
1. Collecte des kystes hydatiques
- Recueillir les kystes hydatiques hépatiques de moutons naturellement infectés régulièrement abattus dans un abattoir.
- Stériliser complètement la surface du kyste à l’aide de gaze stérile et d’alcool à 70% avant d’aspirer les protoscolacées (PSC).
- Aspirer 20 à 50 mL de liquide hydaside dans des tubes coniques stériles de 50 mL.
- Après le drainage, épongez le kyste avec une lame tranchante, transférez la couche germinale dans un tube conique stérile de 50 mL et secouez-le pendant une courte période (~ 2 min) pour augmenter la collecte de CSP. Transférez la couche germinale dans un nouveau tube de 1,5 mL pour la caractérisation moléculaire.
- Lavez les CSP 3-5x avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Observez les CSP dans 0,1 % d’éosine pendant 5 min pour déterminer la viabilité du CSP au microscope optique. Utilisez des CSP dont la viabilité pour la culture est d’au moins 95 %.
- Traiter le précipité de CSP avec 2 mL de pepsine (2 mg/mL, pH 2) pendant 15-20 min.
- Pour isoler les CSP individuels, remettez en suspension les sédiments de CSP dans le PBS et passez-les à travers deux couches de gaze stérile dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL.
REMARQUE : Calculer la moyenne de trois dénombrements sur 50 μL de sédiments PSC à l’aide d’un microscope optique. Pour les essais ultérieurs, utilisez la valeur estimée pour déterminer les CSP/μL. Chaque isolat de kyste hydatide doit être caractérisé sur la base de polymorphismes nucléotidiques par des méthodes moléculaires, telles que le séquençage par PCR17 ou l’analyse de la courbe de fusion à haute résolution18.
2. Culture biphasique de CSP d’E . granulosus pour obtenir des vers adultes
REMARQUE : Les CSP isolés doivent être cultivés dans des conditions stériles dans une armoire à flux laminaire de classe II. Préparer séparément les phases solide et liquide du milieu de culture biphasique avant de passer aux étapes suivantes19.
- Préparer le milieu de culture biphasique à se composer de deux phases.
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Pour la phase solide, ajouter 10 mL de sérum bovin dans une fiole de 25 mL et laisser coaguler à 76 °C pendant 20-30 min.
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Pour la phase liquide (CMRL modifié), mélanger 100 mL de sérum de veau fœtal (FCS) inactivé par la chaleur, 36 mL d’extrait de levure à 5 %, 5,6 mL de glucose à 30 % (dans de l’eau distillée), 1,4 mL de bile de chien à 5 % dans le PBS, 20 mM de tampon HEPES et 10 mM de NaHCO3 dans 260 mL de milieu CMRL-1066. Enfin, ajouter la pénicilline (100 UI/mL) et la streptomycine (100 mg/mL) au mélange.
- Ajouter 10 mL du milieu de phase liquide à chaque fiole de culturede 25 cm 2 .
- Ajouter environ 5 000 CSP à la fiole de culture et transférer la fiole dans l’incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2).
- Après 24-48 h, transférer les CSP dans une nouvelle fiole avec la phase solide (sérum bovin) et ajouter 1 mL du même milieu liquide frais par fiole. Transférer les flacons dans l’incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2).
- Tous les 5 à 7 jours, remplacez le milieu par un milieu liquide frais en fonction des changements de couleur du milieu de culture et de la proportion estimée de CSP différenciés.
REMARQUE: Les protoscoléces réagissent rapidement aux changements environnementaux après avoir été cultivées, et la plupart d’entre elles subissent une différenciation dans les 2-3 semaines. En raison de la consommation de nutriments et de la croissance et du développement des protoscolèces, le pH du milieu de culture change et sa couleur se déplace vers l’orange et le jaune.
3. Culture monophasique de CSP d’E. granulosus
- Assurez-vous que la culture monophasique est faite 24-48 h avant la transduction.
- Culture ~5 000 CSP dans une fiole de culture de 25 cm2 avec RPMI et 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
- Transférer les flacons dans l’incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2) jusqu’à utilisation.
4. Culture cellulaire pour la production et la préparation de virus
REMARQUE: Des cellules 293T (HEK293T) embryonnaires humaines ont été obtenues pour la production de vecteurs au centre de recherche sur la pathologie et les cellules souches de l’Université des sciences médicales de Kerman.
- Transférer 5 × 10 cellules HEK293T dans une fiole de 25 cm2 contenant 5 mL de DMEM avec 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
- Incuber les cellules HEK293T à 37 °C dans 5 % de CO2 et les passer dans le milieu de culture complet toutes les 48 h. Enfin, utilisez des cellules HEK293T à faible passage pour la transduction20.
5. Production et préparation du virus avec les vecteurs lentiviraux de troisième génération
REMARQUE: Le vecteur lentivirus pCDH513b (vecteur de transfert) et PLPII, PLPI et PMD2G (vecteurs auxiliaires) ont été utilisés pour exprimer le gène rapporteur GFP. Voir le tableau des matériaux et la figure supplémentaire S1.
- Jour 1 :
- Après avoir trypsinisé les cellules HEK293T21 dans des plaques de culture à 6 puits, ensemencez 7 × 104 cellules par puits avec du DMEM frais sans antibiotique contenant 10% de FBS.
- Utilisez des cellules à une confluence de 50% à 60% pour la transduction par la méthode du phosphate de calcium.
- Jour 2:
- Remplacez le milieu de culture cellulaire 2-3 h avant l’expérience avec du DMEM frais sans antibiotique contenant 2% de FBS.
- Dans un tube de 1,5 mL, mélanger les plasmides lentiviraux de troisième génération, y compris 7 μg/μL pCDH513b (vecteur de transfert), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI et 2 μg/μL PMD2G (vecteurs auxiliaires).
- Ajouter le tampon HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES et 1,5 mM Na2HPO4; plage de pH optimale, 7,00-7,28) au mélange à un volume de 422 μL.
- Ajouter 16 μL de tampon Tris-EDTA (TE) à 1 % au mélange.
- Ajouter 62 μL de chlorure de calcium de 2,5 mM aux tubes et bien mélanger.
- Ajouter 500 μL de 2x solution saline tamponnée HEPES (HBS) au mélange, goutte à goutte, dans les 1-2 minutes à l’aide d’une pipette Pasteur. Mélanger doucement jusqu’à l’obtention d’une solution semi-opaque et incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange à chaque plaque lentement et le répartir avec des mouvements circulaires lents.
- Incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et remplacer le milieu après 4-6 h par du DMEM sans antibiotique contenant 10 % de FBS.
- Jour 3:
- Confirmer la transduction transitoire réussie et la viabilité cellulaire à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.
- Jour 4:
- Récoltez les virus du milieu de culture en collectant le surnageant de chaque puits et conservez-les à -70 °C jusqu’à leur utilisation.
REMARQUE: Les lentivirus récoltés pourraient être concentrés et titrés pour une transfection précise22.
6. Transduction transitoire de différents stades d’E. granulosus avec le virus
- Jour 1 :
- Utilisez une plaque de culture à 12 puits pour le transfert de gènes. Culture 5 × 103-5 × 104 cellules HEK293T en triple, avec un milieu DMEM complet comme référence interne.
- Culture 150 PSC frais en triple exemplaire en RPMI et 10% FBS.
- Culture 30 vers strobilés en triple exemplaire dans du DMEM contenant 10% de FBS inactivés par la chaleur.
REMARQUE: Tous les milieux de transduction doivent être sans antibiotiques. Conservez trois puits témoins non traités pour les cellules HEK293T, les CSP et les vers strobilés dans le processus.
- Préparer un mélange de 1 × 106 virus avec un réactif de transfection de 4 μg/mL (voir la Table des matériaux) pour transduire les cellules HEK293T et les différents stades du ver.
- Ajouter le mélange à chaque plaque lentement et le répartir avec des mouvements circulaires lents. Incuber les plaques pendant 4-6 h dans un incubateur à CO2 (37 °C, 5% co2). Remplacer le milieu de chaque échantillon par le même milieu de culture complet afin de minimiser les effets toxiques du réactif de transfection.
- Jour 2:
- Répétez les étapes 6.1.4 à 6.1.5 pour augmenter l’efficacité de la transduction transitoire pour les cellules HEK293T, les PSC et les vers strobilés.
- Incuber toutes les plaques pendant 24-48 h dans un incubateur à CO2 avec les mêmes conditions de culture en fonction du type de milieu cellulaire.
- Jour 3:
- Vérifiez si la transduction réussit en utilisant la microscopie à fluorescence.
REMARQUE: Envisagez d’utiliser d’autres tests de confirmation comme la PCR / qPCR20,23 ou les techniques de transfert Western24 dans la procédure de transfert de gènes.