Method Article

Culture microbienne automatisée et évolution adaptative à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit comment utiliser le système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC) pour effectuer une culture microbienne automatisée et une évolution adaptative. MMC peut cultiver et sous-cultiver des micro-organismes automatiquement et en continu et surveiller en ligne leur croissance avec un débit relativement élevé et une bonne parallélisation, réduisant ainsi la consommation de main-d’œuvre et de réactifs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les méthodes de culture microbienne conventionnelles ont généralement des opérations lourdes, un faible débit, une faible efficacité et une grande consommation de main-d’œuvre et de réactifs. De plus, les méthodes de culture à haut débit à base de microplaques développées ces dernières années ont un faible statut de croissance microbienne et une parallélisation expérimentale en raison de leur faible teneur en oxygène dissous, de leur mauvais mélange et de leur effet d’évaporation et thermique sévères. En raison de nombreux avantages des micro-gouttelettes, tels qu’un petit volume, un débit élevé et une forte contrôlabilité, la technologie microfluidique à base de gouttelettes peut surmonter ces problèmes, qui a été utilisée dans de nombreux types de recherche sur la culture, le criblage et l’évolution microbiens à haut débit. Cependant, la plupart des études antérieures restent au stade de la construction et de l’application du laboratoire. Certains problèmes clés, tels que les exigences opérationnelles élevées, la difficulté de construction élevée et l’absence de technologie d’intégration automatisée, limitent l’application généralisée de la technologie microfluidique des gouttelettes dans la recherche microbienne. Ici, un système automatisé de culture microbienne de microgouttelettes (MMC) a été développé avec succès sur la base de la technologie microfluidique des gouttelettes, permettant l’intégration de fonctions telles que l’inoculation, la culture, la surveillance en ligne, la sous-culture, le tri et l’échantillonnage requis par le processus de culture de gouttelettes microbiennes. Dans ce protocole, Escherichia coli (E. coli) MG1655 de type sauvage et une souche d’E. coli essentielle au méthanol (MeSV2.2) ont été prises comme exemples pour présenter comment utiliser le MMC pour effectuer une culture microbienne automatisée et à débit relativement élevé et une évolution adaptative en détail. Cette méthode est facile à utiliser, consomme moins de main-d’œuvre et de réactifs, et a un débit expérimental élevé et une bonne parallélisation des données, ce qui présente de grands avantages par rapport aux méthodes de culture conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et fiable en termes de résultats pour permettre aux chercheurs scientifiques de mener des recherches microbiennes connexes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La culture microbienne est une base importante pour la recherche scientifique microbiologique et les applications industrielles, qui est largement utilisée dans l’isolement, l’identification, la reconstruction, le criblage et l’évolution des micro-organismes 1,2,3. Les méthodes de culture microbienne conventionnelles utilisent principalement des tubes à essai, des flacons à agiter et des plaques solides comme récipients de culture, combinés à des incubateurs à secouer, des spectrophotomètres, des lecteurs de microplaques et d’autres équipements pour la culture, la détection et le dépistage microbiens. Cependant, ces méthodes présentent de nombreux problèmes, tels que des opérations fastidieuses, un faible débit, une faible efficacité et une grande consommation de main-d’œuvre et de réactifs. Les méthodes de culture à haut débit développées ces dernières années sont principalement basées sur la microplaque. Mais la microplaque a un faible niveau d’oxygène dissous, une mauvaise propriété de mélange et une évaporation et un effet thermique sévères, ce qui conduit souvent à un mauvais état de croissance et à une parallélisation expérimentale des micro-organismes 4,5,6,7; d’autre part, il doit être équipé d’équipements coûteux, tels que des postes de travail de manipulation de liquides et des lecteurs de microplaques, pour réaliser une culture automatisée et une détection de processus 8,9.

En tant que branche importante de la technologie microfluidique, la microfluidique des gouttelettes a été développée ces dernières années sur la base de systèmes microfluidiques traditionnels à flux continu. Il s’agit d’une technologie microfluidique à écoulement discret qui utilise deux phases liquides non miscibles (généralement huile-eau) pour générer des micro-gouttelettes dispersées et opérer sur elles10. Étant donné que les micro-gouttelettes présentent les caractéristiques d’un petit volume, d’une grande surface spécifique, d’un taux de transfert de masse interne élevé et d’aucune contamination croisée causée par la compartimentation, ainsi que les avantages d’une forte contrôlabilité et d’un débit élevé de gouttelettes, il existe de nombreux types de recherche appliquant la technologie microfluidique des gouttelettes dans la culture, le criblage et l’évolution à haut débit des micro-organismes11 . Cependant, il reste encore une série de questions clés pour rendre la technologie microfluidique des gouttelettes popularisée et largement appliquée. Tout d’abord, le fonctionnement de la microfluidique des gouttelettes est lourd et complexe, ce qui entraîne des exigences techniques élevées pour les opérateurs. Deuxièmement, la technologie microfluidique des gouttelettes combine des composants optiques, mécaniques et électriques et doit être associée à des scénarios d’application de la biotechnologie. Il est difficile pour un seul laboratoire ou une seule équipe de construire des systèmes efficaces de contrôle microfluidique des gouttelettes s’il n’y a pas de collaboration multidisciplinaire. Troisièmement, en raison du faible volume de micro-gouttelettes (du picoliter (pL) au microlitre (μL)), il faut beaucoup de difficulté pour réaliser le contrôle automatisé précis et la détection en ligne en temps réel des gouttelettes pour certaines opérations microbiennes de base telles que la sous-culture, le tri et l’échantillonnage, et il est également difficile de construire un système d’équipement intégré12.

Afin de résoudre les problèmes ci-dessus, un système automatique de culture microbienne de microgouttelettes (MMC) a été développé avec succès sur la base de la technologie microfluidique des gouttelettes13. La MMC se compose de quatre modules fonctionnels : un module de reconnaissance de gouttelettes, un module de détection de spectre de gouttelettes, un module de puce microfluidique et un module d’échantillonnage. Grâce à l’intégration du système et au contrôle de tous les modules, le système d’exploitation automatisé comprenant la génération, la culture, la mesure (densité optique (OD) et fluorescence), le fractionnement, la fusion, le tri des gouttelettes est établi avec précision, réalisant l’intégration de fonctions telles que l’inoculation, la culture, la surveillance, la sous-culture, le tri et l’échantillonnage requis par le processus de culture de gouttelettes microbiennes. MMC peut contenir jusqu’à 200 unités de culture de gouttelettes répliquées de 2 à 3 μL de volume, ce qui équivaut à 200 unités de culture de flacons agités. Le système de culture de micro-gouttelettes peut satisfaire aux exigences de non-contamination, d’oxygène dissous, de mélange et d’échange masse-énergie pendant la croissance des micro-organismes, et répondre aux divers besoins de la recherche microbienne grâce à de multiples fonctions intégrées, par exemple, la mesure de la courbe de croissance, l’évolution adaptative, l’analyse multi-niveaux à facteur unique et la recherche et l’analyse des métabolites (basées sur la détection de fluorescence)13,14.

Ici, le protocole présente en détail comment utiliser la MMC pour effectuer une culture automatisée et microbienne et une évolution adaptative (Figure 1). Nous avons pris comme exemple Escherichia coli (E. coli) MG1655 de type sauvage pour démontrer la mesure de la courbe de croissance et une souche d’E. coli essentielle au méthanol MeSV2.215 pour démontrer l’évolution adaptative de la MMC. Un logiciel d’exploitation pour MMC a été développé, ce qui rend l’opération très simple et claire. Dans l’ensemble du processus, l’utilisateur doit préparer la solution bactérienne initiale, définir les conditions de la MMC, puis injecter la solution bactérienne et les réactifs connexes dans la MMC. Par la suite, la MMC effectuera automatiquement des opérations telles que la génération de gouttelettes, la reconnaissance et la numérotation, la culture et l’évolution adaptative. Il effectuera également la détection en ligne (OD et fluorescence) des gouttelettes avec une résolution temporelle élevée et affichera les données associées (qui peuvent être exportées) dans le logiciel. L’opérateur peut arrêter le processus de culture à tout moment en fonction des résultats et extraire les gouttelettes cibles pour des expériences ultérieures. Le MMC est facile à utiliser, consomme moins de main-d’œuvre et de réactifs, et a un débit expérimental relativement élevé et une bonne parallélisation des données, ce qui présente des avantages significatifs par rapport aux méthodes de culture conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et robuste permettant aux chercheurs de mener des recherches microbiennes connexes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Installation de l’instrument et du logiciel

  1. Choisissez un environnement propre et stérile (comme un banc propre) comme espace permanent dédié à MMC. Installez la console MMC régulièrement dans l’espace.
    REMARQUE: Gardez la MMC à l’écart des interférences des champs électriques forts, des champs magnétiques et des sources de rayonnement thermique fortes. Évitez les vibrations sévères qui affectent les composants de détection optique. Fournissez l’alimentation de AC220 V, 50 HZ à la console MMC. Pour plus de détails sur MMC, reportez-vous à la Table des matériaux et au site Web de MMC16.
  2. Installez le logiciel d’exploitation à partir du fichier MMC.zip
    Remarque : Contactez les auteurs du fichier MMC.zip.
    1. Créez un dossier dédié et enregistrez-y le fichier zip.
    2. Créez un autre dossier dédié en tant que « Répertoire d’installation ». Décompressez la console MMC.zip et enregistrez les fichiers dans le nouveau dossier.
      REMARQUE: La configuration de l’ordinateur est préférable de répondre: (1) Système d’exploitation Windows 7 64 bits ou supérieur; (2) CPU: i5 ou supérieur; (3) mémoire: 4 Go ou plus; (4) disque dur : 300 Go ou plus (vitesse de rotation supérieure à 7200 tr/min ou disque SSD).

2. Préparatifs

  1. Connectez l’aiguille de la seringue (diamètre intérieur de 0,41 mm et diamètre extérieur de 0,71 mm), le connecteur rapide A et le flacon de réactif (Figure 2C) et autoclavez-les à 121 °C pendant 15 min.
    REMARQUE: Dévissez légèrement le bouchon du flacon de réactif pendant la stérilisation. Quelques bouteilles de réactif supplémentaires peuvent être préparées à chaque fois pour l’utilisation.
  2. Utilisez un filtre au fluorure de polyvinylidène (PVDF) de 0,22 μm pour filtrer l’huile MMC. Mettez la puce microfluidique (Figure 2B) et l’huile MMC dans le banc propre à l’avance et stérilisez-les par irradiation ultraviolette pendant 30 minutes avant utilisation.
    REMARQUE: Pour plus de détails sur le connecteur rapide A, la bouteille de réactif, l’huile MMC et la puce microfluidique, reportez-vous à la table des matériaux.
  3. Installez la puce microfluidique
    1. Ouvrez la porte de la chambre de commande (Figure 2A) et soulevez la sonde à fibre optique.
    2. Alignez les trous de champ électrique avec les aiguilles de champ électrique et placez doucement la puce sur le piédestal de la puce. Insérez ensuite les deux colonnes de positionnement dans les trous de positionnement et posez la sonde à fibre optique (Figure 2D).
    3. Connectez le connecteur rapide A de la puce au port correspondant du MMC en fonction du numéro de position (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Fermez ensuite la porte de la chambre d’opération.
  4. Reconstituez l’huile MMC (à environ 80 mL) dans la bouteille d’huile et videz le liquide résiduaire dans la bouteille de déchets avant utilisation.
    REMARQUE: Les déchets liquides sont généralement des déchets organiques. Veuillez vous référer à la législation et à la réglementation régionales lors de l’élimination, sous réserve de modifications en fonction de la configuration expérimentale.

3. Mesure de la courbe de croissance dans MMC

  1. Préparation de la solution bactérienne initiale
    1. Suivez les réglementations standard correspondantes pour préparer le milieu Luria-Bertani (LB) et l’autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
      REMARQUE: Composants du milieu LB: NaCl (10 g / L), extrait de levure (5 g / L) et tryptone (10 g / L).
    2. Retirez la souche E. coli MG1655 du bouillon de glycérol et cultivez-la dans une fiole agitée de 50 mL avec 10 mL de milieu LB dans un incubateur à agitation (200 tr/min) à 37 °C pendant 5-8 h.
      REMARQUE: Le temps de culture dépend des souches spécifiques. Il est optimal de cultiver la souche jusqu’à la période/phase logarithmique.
    3. Diluer la solution cultivée d’E. coli MG1655 avec un milieu frais à une OD600 de 0,05-0,1 pour obtenir une solution bactérienne initiale (préparer environ 10 mL).
  2. Cliquez sur Initialisation pour initialiser la console MMC. Une fois l’interface d’initialisation affichée, réglez la température de culture sur 37 °C et la valeur du signal photoélectrique sur 0,6 (Figure 3A). L’initialisation prendra environ 20 min.
  3. Allumez la lampe UV (longueur d’onde 254 nm) pendant l’initialisation.
  4. Injecter la solution bactérienne initiale et l’huile MMC dans le flacon de réactif.
    1. Sortez un flacon de réactif stérilisé sur le banc propre et serrez le bouchon.
    2. Utilisez une seringue stérile de 10 mL pour injecter 3 à 5 mL d’huile MMC à partir de l’aiguille de la seringue du tube latéral. Inclinez et faites pivoter lentement le flacon de réactif pour que l’huile s’infiltre complètement dans la paroi intérieure.
    3. Injecter environ 5 mL de solution bactérienne initiale, puis remplir le flacon de réactif en injectant à nouveau 5 à 7 mL d’huile.
    4. Retirez le connecteur rapide indépendant A et insérez le connecteur rapide A du flacon de réactif dans son connecteur rapide B pour terminer l’opération d’injection de l’échantillon (Figure 4A).
  5. Attendez la fin de l’initialisation, puis éteignez la lampe UV (longueur d’onde 254 nm).
  6. Ouvrez la porte de la chambre d’opération et placez le flacon de réactif dans le bain métallique.
  7. Retirez le connecteur C2 de la puce et le connecteur rapide A de la bouteille de réactif. Connectez le connecteur de tube latéral de la bouteille de réactif au connecteur C2 et le connecteur de tube supérieur au connecteur O2. Fermez ensuite la porte de la chambre d’opération.
  8. Cliquez sur Courbe de croissance pour choisir la fonction de mesure de la courbe de croissance (Figure 3A). Dans l’interface de paramétrage, entrez le nombre sur 15, activez le commutateur de détection OD et définissez la longueur d’onde sur 600 nm. Cliquez sur Démarrer pour lancer la génération de gouttelettes. Cela prendra environ 10 min.
    REMARQUE: Ici, nombre fait référence au nombre de gouttelettes à générer. La longueur d’onde fait référence à la longueur d’onde de la DO à détecter. Définissez le nombre (maximum 200) et la longueur d’onde (350-800 nm) en fonction des exigences de l’expérience.
  9. Lorsqu’une fenêtre contextuelle apparaît sur l’interface principale vous invitant à « Retirer le flacon de réactif entre C2 et O2, puis cliquez sur le bouton OK après l’achèvement », ouvrez la porte de la chambre de commande pour sortir le flacon de réactif et connectez les connecteurs C2 et O2.
  10. Fermez la porte et cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre contextuelle pour cultiver automatiquement les gouttelettes et détecter les valeurs OD.
    REMARQUE: La console MMC détecte la valeur OD lorsque la gouttelette passe la sonde à fibre optique. Par conséquent, la période de détection dépend du nombre de gouttelettes générées.
  11. Lorsque la courbe de croissance atteint la phase stationnaire, cliquez sur le bouton Exportation de données pour exporter les données OD. Sélectionnez le chemin d’enregistrement des données et exportez la valeur OD enregistrée pendant la période de culture au format .csv, qui peut être ouvert par un logiciel approprié (par exemple, Microsoft Excel). Utilisez ensuite un logiciel de cartographie (par exemple, EXCEL et Origin 9.0) pour tracer la courbe de croissance.
    REMARQUE: Pendant le processus de culture, il est possible de cliquer sur l’exportation de données à tout moment pour exporter les données OD de toutes les gouttelettes actuelles.

4. Évolution adaptative dans la MMC

  1. Préparation de la solution bactérienne initiale
    1. Suivez les réglementations standard applicables pour préparer le milieu liquide spécial et les plaques solides pour le MeSV2.2 et l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
      REMARQUE: Pour les composants du support spécial, reportez-vous au tableau 1 et au tableau des matériaux.
    2. Cultivez le MeSV2.2 à l’aide de la plaque solide (diamètre = 90 mm) dans un incubateur à température constante à 37 °C pendant 72 h. Ensuite, choisissez une colonie indépendante et cultivez-la dans une fiole agitée de 50 mL avec 10 mL du milieu liquide spécial dans un incubateur à agitation (200 tr/min) à 37 °C pendant 72 h.
    3. Diluer la solution de MeSV2.2 cultivée avec le milieu à une OD600 de 0,1-0,2 (s’assurer que le volume total n’est pas inférieur à 10 mL) et continuer à la cultiver dans la fiole agitée pendant 5 h pour obtenir la solution bactérienne initiale.
      REMARQUE : Le MeSV2.2 est une souche d’E. coli essentielle au méthanol. Le milieu liquide spécial contient 500 mmol / L de méthanol, ce qui est un stress fort pour MeSV2.2, entraînant une croissance très lente. Notez que l’obtention de la solution bactérienne initiale ici est différente de celle décrite à l’étape 3.1.
  2. Initialisez la console MMC comme expliqué aux étapes 3.2, 3.3 et 3.5.
  3. Sortez deux flacons de réactif stérilisés, dont l’un est pour la solution bactérienne initiale et l’autre est pour le milieu frais. Injecter la solution bactérienne initiale (5 mL), le milieu frais (12-15 mL) et l’huile MMC dans les flacons de réactif comme expliqué à l’étape 3.4.
    REMARQUE: Comme l’évolution adaptative est un processus à long terme impliquant de multiples sous-cultures, stockez autant de milieu frais que possible dans la MMC. Le support ne peut pas être réapprovisionné pendant l’exécution de l’expérience.
  4. Installez les deux flacons de réactif dans MMC comme expliqué à l’étape 3.6. Installez l’un pour la solution bactérienne initiale entre le connecteur C2 et O2 et l’autre pour le milieu frais entre le connecteur C4 et O4.
  5. Cliquez sur ALE pour choisir la fonction d’évolution adaptative (Figure 3B). Dans l’interface de paramétrage, activez le commutateur Détection OD .
  6. Définissez le nombre sur 50, la longueur d’onde sur 600 nm, la concentration sur 0 %, le type sur le temps, le paramètre sur 30 h et les répétitions sur 99. Cliquez sur Démarrer pour lancer la génération de gouttelettes. Cela prendra environ 25 min.
    NOTE: Ici, « Concentration » fait référence à la concentration maximale de facteurs chimiques pour l’évolution adaptative. Pour différentes gouttelettes, il est possible dans la MMC d’introduire différentes concentrations de facteurs chimiques pour fournir différentes conditions de croissance. Calculez les concentrations introduites à l’aide de l’équation suivante :
    figure-protocol-1
    Ici, « C » fait référence à la concentration de facteurs chimiques introduits dans les gouttelettes; « a » fait référence à la concentration de facteurs chimiques dans les bouteilles de réactif entre le connecteur C4 et O4; « b » fait référence à la concentration de facteurs chimiques dans les bouteilles de réactif entre le connecteur C6 et O6; et « i » fait référence à la concentration disponible. Huit concentrations sont disponibles dans la MMC. Étant donné que le facteur chimique a ici une concentration unique (500 mmol / L de méthanol) et qu’il s’agit de l’un des ingrédients du milieu, une seule bouteille de réactif contenant le facteur chimique est installée ici et la concentration est fixée à 0%. Le type fait référence au mode de sous-culture, qui est divisé en trois types: le mode temporel, le mode de valeur OD et le mode de fluorescence. Le premier signifie cultiver les gouttelettes pendant un temps fixe, puis sous-cultiver, tandis que les deux derniers signifient cultiver les gouttelettes à une valeur OD / intensité de fluorescence prédéfinie, puis sous-cultiver. Le paramètre fait référence au paramètre associé requis lors du choix d’un mode de sous-culture. Les répétitions font référence au nombre de sous-cultures.
  7. Retirez le flacon de réactif placé entre le connecteur C2 et O2 comme expliqué à l’étape 3.8.
  8. Observez si les valeurs maximales de DO des gouttelettes au cours de chaque période de sous-culture ont augmenté de manière significative. Si l’augmentation se produit et répond aux exigences de l’expérience, cliquez sur le bouton Exportation de données pour exporter les données OD comme expliqué à l’étape 3.9.
    REMARQUE: Ici, la période de sous-culture dépend du paramètre. Par exemple, lorsque vous définissez Type comme Temps et Paramètre sur 30 h, la période de sous-culture est de 30 h. Au cours de chaque période de sous-culture, il y a les valeurs maximales de DO des gouttelettes. Estimer si l’évolution adaptative répond aux exigences de l’expérience par l’augmentation des valeurs maximales de DO (l’augmentation dépend du processus de culture réel de la souche, par exemple, augmenté de plus de 20%).
    ATTENTION : Faites attention à ce que le milieu frais stocké soit épuisé. Si l’augmentation significative ne s’est pas produite même après l’épuisement du milieu, extraire les gouttelettes les plus en croissance et effectuer un nouveau cycle d’évolution adaptative.
  9. Extrayez les gouttelettes cibles de la console MMC.
    1. Cliquez sur le bouton Criblage pour choisir la fonction d’extraction des gouttelettes (Figure 3C). Choisissez l’option Collecter , cliquez sur le nombre de gouttelettes cibles, puis cliquez sur OK.
      REMARQUE: Le criblage des gouttelettes comprend « Collecter », « Jeter » et « Extraire la solution de semences ». Par « extraire la solution de semences », on entend la collecte des gouttelettes restantes13 après l’opération de sous-culture.
    2. Attendez que la fenêtre contextuelle vous invite à « Veuillez retirer le connecteur rapide CF et le mettre dans le tube EP ». Placez le connecteur rapide CF dans le tube de microcentrifugation pour la collecte en fonction de l’invite du logiciel, puis cliquez sur OK (Figure 4D).
    3. Après 1-2 min, l’interface du logiciel affichera une nouvelle fenêtre invitant, « Veuillez insérer le connecteur en arrière et cliquez sur OK si vous avez terminé ». Ensuite, insérez le connecteur rapide CF et cliquez sur OK pour que la console MMC continue de fonctionner (Figure 4D). Lorsque la gouttelette cible suivante atteint le site de reconnaissance des gouttelettes, répétez 4.9.2-4.9.3 pour la collecter.
      REMARQUE: Une fois que toutes les gouttelettes cibles sont collectées, la MMC continuera à cultiver les gouttelettes restantes. Si la culture n’est pas nécessaire, cliquez sur Arrêter pour mettre fin directement à l’opération.
    4. Extrayez la gouttelette à l’aide d’une pipette de 2,5 μL, déposez-la sur la plaque d’agarose de 90 mm et étalez-la uniformément avec une tige d’étalement triangulaire en verre d’une longueur latérale de 3 cm. Ensuite, cultivez-le dans un incubateur à température constante à 37 °C pendant 72 h.
    5. Choisissez 3 à 5 colonies indépendantes et cultivez-les séparément dans les flacons agités de 50 mL avec 10 mL de milieu frais dans un incubateur à agitation (200 tr/min) à 37 °C pendant 48-72 h. Suivez les réglementations standard connexes pour stocker la solution de bactéries cultivées dans le tube de glycérol pour les expériences ultérieures.

5. Nettoyage de la MMC

  1. Une fois l’expérience terminée, cliquez sur Arrêter pour arrêter toutes les opérations. Cliquez ensuite sur Nettoyer pour nettoyer la puce et les tubes. Cela prendra environ 15 min.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole utilise E. coli MG1655 et une souche MeSV2.2 comme exemples pour démontrer la culture microbienne et l’évolution adaptative essentielle au méthanol avec une stratégie automatisée et à débit relativement élevé dans la MMC. La mesure de la courbe de croissance a été principalement utilisée pour caractériser la culture microbienne. L’évolution adaptative a été réalisée par la sous-culture continue automatisée et l’ajout d’une forte concentration de méthanol comme pression sélective lors de chaque sous-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole montre comment utiliser le système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC) pour effectuer une culture microbienne automatisée et une évolution adaptative à long terme. MMC est un système de culture microbienne miniaturisé, automatisé et à haut débit. Par rapport aux méthodes et instruments de culture microbiens à haut débit conventionnels, la MMC présente de nombreux avantages tels qu’une faible consommation de main-d’œuvre et de réactifs, un fonctionnement simple, une détection en ligne (OD et fl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), le National Key Scientific Instrument and Equipment Project de la National Natural Science Foundation of China (21627812) et le Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Nous remercions également le professeur Julia A. Vorholt (Institut de microbiologie, Département de biologie, ETH Zurich, Zurich 8093, Suisse) pour la fourniture de la souche d’E. coli essentielle au méthanol version 2.2 (MeSV2.2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 &mu ; m membrane filtrante en PVDFMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBStériliser l’huile MMC
4 ° ; C réfrigérateurHaierBCD-289BSWPour le stockage des réactifs
AgarBecton, Dickinson and Company214010Pour la préparation des plaques solides
CaCl2· ; 2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Composant du support spécial pour MeSV2.2.
Banc proprePékin Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDII Pour lefonctionnement aseptique et la stérilisation UV
CoCl2· ; 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Composant du support spécial pour MeSV2.2.
OrdinateurLenovoE450Installation du logiciel et contrôle MMC
Incubateur à température constanteShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250Pour la culture microbienne à l’aide de milieu solide
CuSO4· ; 5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Composant du support spécial pour MeSV2.2.
Balance électroniqueOHAUSAR 3130Pour le pesage de réactifs
Tube EPThermo Fisher1,5 mLPour la collecte des gouttelettes
FeCl3· ; 6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Composant du support spécial pour MeSV2.2.
Tube de congélationThermo Fisher2.0 mLPour la conservation de la souche
GluconateSigma-AldrichS2054Composant du milieu spécial pour MeSV2.2.
GlycérolGENERAL-REAGENTG66258APour la conservation des souches
Pot de stérilisation à la vapeur à haute pressionSANYOElectric MLS3020Pour la stérilisation autoclavée
isopropyl-&beta ;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)Biotop420322Composant du milieu spécial pour MeSV2.2.
Sulfate de kanamycineSolarbioK8020Composant du milieu spécial pour MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Composant du support spécial pour MeSV2.2.
MéthanolMACKLINM813895Composant du milieu spécial pour MeSV2.2.
MgSO4· ; 7H2OBIOBYING1305715Composant du support spécial pour MeSV2.2.
Système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  ; MMC-IRéalisation de la détermination de la courbe de croissance et de l’évolution adaptative. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
puce microfluidiqueLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODPour diverses opérations de gouttelettes. Veuillez vous référer à
l’huile http://www.tmaxtree.com/en/ MMCLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODLa phase huileuse pour la microfluidique des gouttelettes. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Composant du support spécial pour MeSV2.2.
NaClGENERAL-REAGENTG81793JComposant du milieu LB
Na2HPO4· ; 12H2OGENERAL-REAGENTComposant du milieu spécial pour MeSV2.2.
NH4ClRéactif chimique Sinopharm Beijing Co., Ltd.10001518Composant du support spécial pour MeSV2.2.
Boîte de PétriCorning Incorporated90 mmPour la préparation de milieu solide
Pipetteeppendorf2.5 &mu ; L, 10 &mu ; L, 100&mu ; L, 1000&mu ; LPour la manipulation des liquides
Connecteur rapide ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.&mdash ;Pour la connexion de chaque joint. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
Flacon de réactifLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBÉchantillonnage et stockage de solutions bactériennes et de réactifs. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flaskUnion-Biotech50 mLPour la culture microbienne Incubateur
à secouer ShanghaiSukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BPour la culture microbienne en flacon agité
Sulfate de streptomycineSolarbioS8290Composant du milieu spécial pour MeSV2.2.
SeringueJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mLPrélever le liquide et l’injecter dans le flacon de réactif
Aiguille de seringueOUBEL Hardware Store22GLe diamètre intérieur est de 0,41 mm et le diamètre extérieur est de 0,71 mm.
TryptoneOxoid Ltd.LP0042Composant du réfrigérateur LB medium
Ultra basse températureSANYO Ultra-lowMDF-U4086SPour la conservation des souches (-80 ° ; C)
UV&ndash ; Spectrophotomètre VisGeneral Electric CompanyUltrospec 3100 proPour la mesure des valeurs OD
Vitamine B1SolarbioSV8080Composant du milieu spécial pour MeSV2.2.
Extrait de levureOxoid Ltd.LP0021Composant du LB medium
ZnSO4· ; 7H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10024018Composant du support spécial pour MeSV2.2.
G10267B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508(2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998(2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles