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Article de méthode

Production recombinante d’endoglycosidases bifidobactériennes pour la libération de N-glycanes

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DOI :

10.3791/62804

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20 juillet 2021

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1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, 5Evolve BioSystems Inc., 6Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 7Department of Chemistry, Hacettepe University

Dans cet article

Résumé

Les bifidobactéries possèdent une capacité génomique unique pour le clivage des N-glycanes. La production recombinante de ces enzymes serait un nouvel outil prometteur pour libérer des N-glycanes bioactifs à partir de substrats riches en glycoprotéines tels que le colostrum.

Résumé

La glycosylation des protéines est une modification post-traductionnelle diverse et courante qui a été associée à de nombreux rôles importants tels que la fonction des protéines, y compris le repliement des protéines, la stabilité, la protection enzymatique et la reconnaissance biologique. Les N-glycanes attachés aux glycoprotéines (telles que la lactoferrine, la lactadérine et les immunoglobulines) ne peuvent pas être digérés par l’hôte et atteignent le gros intestin, où ils sont consommés par certains microbes bénéfiques. Par conséquent, ils sont considérés comme des composés prébiotiques de nouvelle génération qui peuvent stimuler sélectivement les micro-organismes bénéfiques du microbiome intestinal. Cependant, l’isolement de ces nouvelles classes de prébiotiques nécessite de nouvelles enzymes. Ici, nous décrivons la production recombinante de nouvelles glycosidases à partir de différentes souches de bifidobactéries (isolées chez les nourrissons, les lapins, les poulets et les bourdons) pour améliorer l’isolement des N-glycanes à partir des glycoprotéines. La méthode présentée dans cette étude comprend les étapes suivantes : clonage moléculaire de gènes bifidobactériens par une stratégie de clonage recombinatoire in vivo , contrôle du succès de transformation, induction de protéines et purification des protéines.

Introduction

La glycosylation est une modification post-traductionnelle très cruciale observée dans les protéines. Environ plus de 50 % des protéines se trouvent sous leurs formes glycosylées chez les eucaryotes. La N- et l’O-glycosylation sont les deux principaux types de glycosylation 1,2. Les glycanes liés à l’O (O-glycanes) sont attachés de manière covalente aux protéines via la N-acétylgalactosamine au groupe hydroxyle d’un résidu d’acide aminé sérine (Ser) ou thréonine (Thr). Les glycanes liés à l’azote (N-glycanes) sont des oligosaccharides complexes, qui sont liés de manière covalente au résidu d’acide aminé de l’asparagine (Asn) des protéines par l’intermédiaire de la N-acétylglucosamine (GlcNAc) dans une séquence d’acides aminés particulière commeN-X-Ser/Thr et une séquence moins courante, commeN-X-Cys (cystéine) (où X pourrait être n’importe quel acide aminé sauf la proline)3,4. Le noyau basique de N-glycane est constitué de deux résidus d’HexNAc et de trois résidus de mannose. L’allongement ultérieur de ce tronc commun avec d’autres monosaccharides via les enzymes glycosyltransférase et glycosidase détermine le type de N-glycanes en fonction du degré de ramification et du type de liaison5. Les N-glycanes sont généralement regroupés en trois classes principales : mannose élevé (HM), type complexe (CT) et hybride (HY)6.

Les N-glycanes sont des composés non digestibles par les organismes hôtes en raison du manque d’enzymes glycosides hydrolases. Ces composés atteignent l’intestin grêle / gros sous une forme non digérée où des milliers d’espèces bactériennes différentes les utilisent, et ils peuvent agir comme des prébiotiques en favorisant des microbes intestinaux spécialisés, en particulier l’espèce Bifidobacterium 7. Des découvertes récentes ont montré que les N-glycanes stimulent sélectivement la croissance de certaines espèces bactériennes 8,9. Les N-glycanes libérés par les glycoprotéines du lait bovin ont stimulé sélectivement la croissance de Bifidobacterium longum sous-espèce infantis (B. infantis), qui est une espèce bifidobactérienne cruciale dans l’intestin du nourrisson, mais d’autres espèces bifidobactériennes telles que Bifidobacterium animalis (B. animalis) n’ont pas utilisé ces composés9. De plus, une étude in vivo récente a démontré que 19 N-glycanes uniques provenant de la lactoferrine et des immunoglobulines du lait stimulent sélectivement la croissance de B. infantis8. En particulier, B. infantis possède une capacité génomique pour le clivage et le métabolisme des glycanes. Une endo-β-N-acétylglucosaminidase (EndoBI-1), qui appartient à la famille des glycosyl hydrolases 18, produite de manière recombinante à partir de la souche ATCC 15697 de B. infantis, a montré une activité élevée sur les glycoprotéines du lait dans des conditions in vitro 9,10. Cette nouvelle enzyme glycoside hydrolase peut cliver les parties N-N'-diacétylchitobiose présentes dans les N-glycanes 10,11. L’activité d’EndoBI-1 n’est pas affectée par la fucosylation du cœur et les différentes conditions de réaction telles que la température élevée, le pH, le temps de réaction, etc. 3,11,12. Cette caractéristique unique des glycosides hydrolases bifidobactériennes fournit un outil prometteur pour la production de N-glycanes à partir de substrats riches en glycoprotéines tels que le colostrum bovin13,14.

Plusieurs méthodes de déglycosylation développées chimiquement et enzymatiquement ont été largement utilisées pour obtenir des N-glycanes et des O-glycanes à partir des glycoprotéines 2,15. Les méthodes chimiques sont largement utilisées en glycobiologie pour la déglycosylation des glycoprotéines en raison de leur facilité d’utilisation, de leur faible coût et de leur spécificité élevée du substrat16. Les méthodes de déglycosylation chimique les plus courantes sont la β-élimination et l’hydrazination17. Parmi ces méthodes, la β-élimination est basée sur le principe du clivage des glycanes des glycoprotéines par exposition des glycoprotéines à des conditions alcalines. Les glycanes libérés peuvent être dégradés au cours du processus en raison des réactions de β-élimination, mais ce problème peut être évité en utilisant des agents réducteurs tels que le borohydrure de sodium (NaBH4)18,19,20. La méthode de β-élimination présente différentes limites. Les agents réducteurs convertissent les glycanes en alditols, les empêchent de se lier à un fluorophore ou à un chromophore. Ainsi, il devient difficile de surveiller la libération de glycanes19,20. En raison de la teneur élevée en sel dans l’étape de nettoyage de la méthode, l’élution peut entraîner des pertes d’échantillon20. Une autre méthode de libération de glycane à partir de glycoprotéines est la méthode à l’hydrazine basée sur le principe de la réaction d’hydrolyse après l’ajout d’hydrazine anhydre à la glycoprotéine. Comme elle permet de contrôler l’isolement des glycanes en modifiant les conditions de réaction telles que la température, la méthode de l’hydrazination a été largement utilisée en glycobiologie21. La déglycosylation chimique peut également être effectuée à l’aide de la formulation anhydre de fluorure d’hydrogène et d’acide trifluoroacétique, en plus d’autres méthodes de déglycosylation chimique 16,22,23. La libération enzymatique de N-glycanes à partir des glycoprotéines est généralement effectuée par les peptidyl-N-glycosidases (PNGases) qui libèrent généralement des N-glycanes, quelle que soit leur taille et leur charge 24,25,26,27. Semblable aux méthodes de déglycosylation chimique, le processus de déglycosylation enzymatique présente des défis différents. Les PNGases montrent une activité en présence de plusieurs détergents utilisés, ce qui augmente l’accessibilité de l’enzyme aux glycanes. Cependant, ces traitements sévères pourraient perturber les glycanes natifs et les structures polypeptidiques restantes28. Les PNGases peuvent ne pas cliver les glycanes lorsqu’il y a un fucose lié à la N-acétylglucosamine29. Diverses endoglycosidases telles que F1, F2 et F3 montrent plus d’activité sur les protéines natives que les PNGases. Ces endoglycosidases ont une faible activité sur les glycanes à antennes multiples, tandis que le nouvel EndoBI-1, résistant à la chaleur, est efficace dans tous les types de N-glycanes 10,11,28. En ce qui concerne les limites des méthodes actuelles, il est évident que de nouvelles enzymes sont toujours nécessaires pour une libération efficace de glycanes sans aucune restriction. À cette fin, les espèces bifidobactériennes, qui ont un grand îlot génomique codant pour diverses enzymes glycosides hydrolases, permettent de cliver les N-glycanes des glycoprotéines30,31. Dans le cadre de ce contexte, l’objectif général de cette étude est de découvrir de nouvelles glycosidases à partir des différentes espèces de bifidobactéries. Pour produire ces enzymes de manière recombinante, différentes étiquettes de fusion sont destinées à améliorer leur production ainsi que leur activité.

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Protocole

1. Clonage moléculaire des gènes bifidobactériens

  1. Amplification par PCR de gènes ciblés par trois ensembles d’amorces de vecteurs (N-His, C-His et N-His SUMO)
    1. Préparez des solutions d’amorces mères (oligomères) de 100 μM en ajoutant de l’eau stérile dans les quantités déterminées par l’entreprise. Préparer 10 μM de nouveaux stocks à partir de ces stocks à utiliser dans l’amplification PCR des gènes cibles.
    2. Préparez le mélange PCR (volume total 50 μL) avec 25 μL de mélange maître, 1 μL d’amorce directe et inverse à 0,2 μM, 21 μL d’eau distillée exempte de DNase/RNase et 2 μL d’ADN matrice (cellules bactériennes) dans les tubes PCR. Remuez doucement le mélange en pipetant de haut en bas.
      REMARQUE : Le mélange principal (Lucigen) utilisé pour la PCR contient de l’ADN polymérase Taq d’une grande pureté et d’une activité élevée et peut fonctionner à des températures plus élevées pour une amplification fiable de matrices jusqu’à 5 kb.
    3. Réglez le programme de PCR comme suit : étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 5 min pour la libération de l’ADN génomique, puis 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, recuit à 60 °C pendant 30 s et allongement à 72 °C pendant 1 min, et extension finale à 72 °C pendant 10 min.
    4. Vérifiez les produits PCR par la méthode d’électrophorèse sur gel d’agarose avec un système de documentation sur gel après avoir été exécutés à 100 V pendant 60 min sur le gel d’agarose à 1 %. Mélanger les produits de PCR et l’échelle d’ADN avec le colorant de chargement en mélangeant dans un rapport de 1:5 (5 μL de produit PCR + 1 μL de colorant de charge et 5 μL d’échelle d’ADN de 1 kb + 1 μL de colorant de chargement) pour charger sur le gel (Figure 1).
    5. Mesurer les concentrations d’ADN des produits PCR à l’aide d’un fluorimètre avant l’étape de clonage moléculaire.
      REMARQUE : Les concentrations des produits de PCR doivent se situer dans la plage requise pour le clonage moléculaire (25-100 ng/μL).
  2. Préparation du milieu gélosé du bouillon de lysogénie (LB) pour le clonage moléculaire
    1. Dissoudre 12,5 g de LB et 6 g d’agarose dans 500 mL dedH2O et autoclaver le milieu gélosé LB (stérilisation à 121 °C pendant 20 min).
    2. Dissoudre 15 mg de kanamycine avec 1 mL dedH2O et conserver à -20 °C.
    3. Après l’autoclavage, ajouter 1 mL de kanamycine dans le flacon contenant les 500 mL stériles de milieu gélosé LB. La concentration finale de kanamycine est de 30 μg/mL. Verser 25 mL de milieu de gélose kanamycine LB dans chaque plaque de l’armoire de laboratoire.
  3. Transformation par choc thermique de cellules E. coli chimiquement compétentes
    1. Ajouter dans le tube 1 à 3 μL (25 à 100 ng) de produits PCR pour chaque souche, y compris 40 μL de cellules E. coli chimiquement compétentes. Ensuite, ajoutez 2 μL de l’ADN du vecteur dans le même tube. Mélangez doucement avec la pointe de la pipette et transférez les mélanges dans des tubes à centrifuger de 15 ml.
      REMARQUE : Effectuez cette étape sur de la glace. Ne pipetez pas de haut en bas pour mélanger afin d’éviter les bulles d’air et le réchauffement accidentel des cellules.
    2. Incuber les tubes contenant les cellules compétentes et l’ADN sur de la glace pendant 30 min. Appliquez un choc thermique sur le mélange dans un bain-marie à 42 °C pendant 45 s. Mettez immédiatement ces tubes sur de la glace et incubez pendant 2 min.
    3. Ajouter 960 μL du milieu de récupération, utilisé pour la récupération rapide des cellules après clonage moléculaire, aux cellules dans les tubes et incuber les tubes à 250 tr/min pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur à agitation.
    4. Plaque de 100 μL de cellules transformées sur des plaques de gélose LB contenant 30 μg/mL de kanamycine. N’utilisez que des cellules E. coli chimiquement compétentes comme contrôle négatif.
      REMARQUE : Mettre dans l’incubateur à 37 °C des plaques de gélose LB contenant 30 μg/mL de kanamycine préparée à l’étape 1.2.2 avant de les utiliser.
    5. Incuber toutes les plaques pendant la nuit à 37 °C sous atmosphère ambiante (figure 2).
  4. Préparation du milieu LB pour la PCR de colonie
    1. Dissoudre 7,5 g de LB avec 300 mL de dH2O dans un flacon et autoclaver le milieu LB (stérilisation à 121 °C pendant 20 min).
    2. Dissoudre 9 mg de kanamycine (30 μg/mL) avec 1 mL de dH2O et mettre à -20 °C. Après l’autoclavage, ajoutez 1 mL de kanamycine dans le flacon contenant les 300 mL stériles de milieu LB. Conservez le milieu de culture liquide à +4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
  5. Criblage des transformants par PCR de colonie
    1. Pour confirmer que tous les transformants sont porteurs des gènes recombinants, sélectionnez les colonies au hasard et amplifiez les gènes cibles par PCR à l’aide des amorces de séquençage fournies avec le kit de clonage.
    2. Effectuez toutes les étapes sur de la glace et pré-refroidissez tous les tubes PCR et les tubes de 15 ml avant utilisation.
    3. À l’aide d’une pointe de pipette, transférez la moitié d’une colonie sélectionnée dans le tube PCR pour chaque échantillon. Prélever une autre moitié de la colonie à l’aide de la pointe de la pipette et la placer dans le tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu liquide LB+kanamycine (préparé à l’étape 1.4). Vortex les tubes de 15 mL et incuber les cultures liquides à 250 tr/min à 37 °C pendant la nuit dans un incubateur agitant.
    4. Placez 50 μL de mélange réactionnel PCR (25 μL de mélange maître, 1 μL d’amorce directe, 1 μL d’amorce inverse, 23 μL d’eau distillée exempte de DNase/RNase) dans tous les tubes PCR et dispersez les cellules en pipetant doucement de haut en bas.
    5. Réglez le programme PCR à 95 °C pendant 5 min pour la libération de l’ADN génomique par lyse des cellules bactériennes, soit un total de 40 cycles de 95 °C pendant 30 s pour la dénaturation initiale, 60 °C pendant 30 s pour le recuit, 72 °C pendant 1 min pour l’allongement et 72 °C pendant 10 min pour l’extension finale.
    6. Vérifiez les produits de PCR par la méthode d’électrophorèse sur gel après les avoir exécutés à 100 V pendant 60 min sur le gel d’agarose à 1 % (Figure 3). Les détails de l’électrophorèse sur gel d’ADN sont décrits à l’étape 1.1.3.
    7. Préparez des stocks de glycérol à 15 % des transformants réussis. Mettez 500 μL de stock de glycérol à 60 % dans les cryotubes et ajoutez 1 500 μL de la culture liquide des transformants réussis. Conservez les bouillons préparés à -80 °C.

2. Induction de l’expression des protéines par le L-rhamnose

  1. Préparez une préculture avec 1 L de milieu liquide LB contenant 30 μg/mL de kanamycine.
  2. Mettez 8 ml du milieu LB dans des tubes à centrifuger de 50 ml. Utilisez l’un des tubes comme contrôle négatif contenant uniquement le milieu liquide. Pour 20 % de L-rhamnose sous forme de bouillon, dissoudre 0,5 g de L-rhamnose avec 2,5 mL de dH2O et conserver à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
  3. Mettre 10 μL de stocks bactériens dans les tubes à centrifuger contenant 8 mL de milieu liquide. Agitez-les doucement et incubez à 37 °C pendant la nuit dans l’incubateur à agitation.
  4. Verser 250 ml de milieu liquide LB dans un erlenmeyer stérilisé de 2 L.
  5. Inoculer 2,5 mL de culture liquide d’une nuit dans une fiole de 2 L contenant du milieu liquide LB dans un rapport de 1:100 entre le ballon et le milieu, et incuber à 37 °C et 150 tr/min pendant 4 h dans l’incubateur à agiter.
  6. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) pour les cellules bactériennes à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque les cellules atteignent la densité optique de 0,5 à 0,6, ajouter 2,5 mL de rhamnose à 20 % (la concentration finale est de 0,2 %) aux 250 mL de culture LB et incuber à 37 °C pendant la nuit à 250 tr/min dans l’incubateur à agitation.
  7. Transférez la culture liquide dans les tubes de 5 x 50 ml, centrifugez les échantillons 3724 x g pendant 15 min à +4 °C et jetez le surnageant. Conservez les granulés à -20 °C jusqu’à l’étape de purification.
    REMARQUE : Pour évaluer l’expression des protéines avec SDS-PAGE, prélever 1 mL de culture non induite (lorsque les cultures sont à une densité optique de 600 nm de 0,5-0,6, sans L-rhamnose) comme témoin et 1 mL de culture induite (après une nuit d’incubation) comme échantillon induit. Microcentrifuger tous les échantillons à 12 000 x g pendant 1 min et remettre en suspension les échantillons non induits et induits avec 50 μL et 100 μL de tampon de chargement SDS-PAGE, respectivement.

3. Lyse cellulaire de cellules E. coli chimiquement compétentes contenant des enzymes marquées par son propre produit

  1. Préparez le tampon de lyse pH 8,0 (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM imidazole, 1 % SDS), le tampon d’équilibrage pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole), le tampon de lavage pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 25 mM imidazole) et le tampon d’élution pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 250 mM d’imidazole).
  2. Placez les tubes de 50 mL contenant les granules de cellule à -80 °C pendant 15 min pour les congeler. Ensuite, retirez les granulés à -80 °C et décongelez-les à température ambiante.
  3. Ajouter 5 mL dedH2O aux pastilles et dissoudre en pipetant de haut en bas. Centrifuger à 3724 x g pendant 15 min à +4 °C et jeter le surnageant.
  4. Pour les pastilles de culture de 50 ml, ajoutez 6 300 μL de tampon de lyse et 63 μL de cocktail d’inhibiteur de protéase d’arrêt sans EDTA (rapport 1:100) dans les pastilles et dissolvez par pipetage de haut en bas. Incuber-les sur glace pendant 30 min, tourbillonnez toutes les 10 min.
  5. Réglez le mode d’impulsion du sonicateur sur 10 s ON et 59 s OFF, et l’amplitude sur 37 %. Placez le tube dans un bécher contenant de la glace et plongez la sonde du sonicateur dans le tube.
    REMARQUE : La sonde doit être complètement immergée sans toucher aucun côté du tube.
  6. Après le processus de sonication (6 impulsions pendant 10 s avec 1 min de refroidissement), centrifuger les échantillons à 3 724 x g pendant 45 min à +4 °C. Ensuite, rassemblez toutes les parties surnageantes dans un tube et centrifugez à 3 724 x g pendant 5 min à +4 °C.
  7. Prélever le surnageant dans un tube et prélever 100 μL de l’échantillon pour l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) à l’étape 4.7. Mesurer les concentrations en protéines des échantillons à l’aide d’un fluorimètre.

4. Purification des enzymes marquées à l’his par la méthode par lots

  1. Ajouter 1 mL de résine Ni-NTA dans un tube à centrifuger et centrifuger pendant 2 min à 700 x g. Retirez délicatement le tube et jetez le surnageant formé.
  2. Ajouter 2 ml (deux fois le volume de résine) du tampon d’équilibrage dans le tube et bien mélanger jusqu’à ce que la résine soit complètement en suspension. Centrifugez le tube pendant 2 min à 700 x g et retirez et jetez soigneusement le tampon.
  3. Mélangez l’extrait de protéine et le tampon d’équilibrage dans un rapport de 1:1 dans un tube à centrifuger. Ajoutez le mélange dans le tube contenant de la résine et mettez-le sur un shaker à 150 tr/min pendant 30 min. Centrifuger le tube pendant 2 min à 700 x g et jeter le surnageant.
  4. Lavez la résine avec 5 mL de tampon de lavage et centrifugez le tube pendant 2 min à 700 x g. Répétez l’étape de lavage jusqu’à ce que la concentration du surnageant diminue jusqu’à la ligne de base.
  5. Ajouter 1 mL de tampon d’élution dans le tube pour éluer les protéines marquées His. Centrifuger le tube pendant 2 min à 700 x g. Enregistrez le surnageant et prélevez 100 μL pour l’analyse SDS-PAGE à l’étape 4.7. Répétez l’étape d’élution trois fois. Mesurez les concentrations de chaque surnageant à l’aide d’un fluorimètre.
  6. Recueillir tous les surnageants dans le tube de tronçonnage de 10 kDa et le centrifuger pendant 2 min à 700 x g. Répétez la centrifugation jusqu’à ce que le volume du surnageant diminue à 200 μL en pipetant de haut en bas de temps en temps. Stockez les protéines purifiées à -20 °C et prélevez 100 μL pour l’analyse SDS-PAGE à l’étape 4.7.
    REMARQUE : La concentration en protéines doit être mesurée et, si la concentration est faible, centrifuger jusqu’à ce qu’elle augmente.
  7. Analyse SDS-PAGE des protéines purifiées
    1. Préparez un gel d’empilage à 4 % (40 % d’acrylamide/bisacrylamide, 1 M Tris pH 6,8, 10 % SDS, 10 % de persulfate d’ammonium, TEMED, dH2O) et un gel résolutif à 12 % (40 % d’acrylamide/bisacrylamide, 1 M de Tris pH 8,8, 10 % de SDS, 10 % de persulfate d’ammonium, TEMED, dH2O).
    2. Mélanger l’échantillon avec 2x tampon d’échantillon Laemmli dans un rapport de 1:1 et incuber à 95 °C pendant 5 min pour dénaturer les protéines.
      REMARQUE : La concentration en protéines des échantillons doit être mesurée avant le chargement, et le volume chargé sera basé sur leur concentration pour une charge égale.
    3. Ajoutez 1x tampon coulant dans le réservoir et chargez les échantillons et l’échelle protéique dans les puits. Faites fonctionner les protéines d’abord à 80 V et augmentez le courant à 120 V lorsque les protéines passent du gel d’empilement au gel de résolution.
    4. Mettez le gel dans un colorant bleu de coomassie et mettez-le dans un shaker pendant 30 min. Lavez le gel avec une solution décolorante (250 mL dH2O + 50 mL d’acide acétique (HOAc) + 200 mL de méthanol) et prenez l’image (Figure 4).

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Résultats

Les enzymes membres de la glycosyl hydrolase sélectionnées de différentes origines ont été ciblées dans cette étude. On a supposé que l’application concomitante de différentes enzymes avec des structures différentes pourrait fournir une meilleure libération de glycanes puisqu’elles ont évolué pour être actives dans différentes glycoprotéines. La liste des gènes cibles et leur origine figure dans le tableau 1. Des souches bactériennes ont été obtenues à partir de collections coordonnées de micro-organisme...

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Discussion

La stratégie de clonage recombinatoire in vivo utilisée pour le clonage moléculaire des gènes cibles fournit des résultats rapides et fiables par rapport aux autres protocoles de clonage traditionnels. Même s’il existe de nombreuses méthodes pratiques pour le clonage moléculaire, la méthode décrite dans cet article présente plus d’avantages. Le système de clonage in vivo , contrairement à d’autres systèmes de clonage, n’a besoin d’aucun traitement enzymatique ou purific...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude est soutenue par TUBITAK #118z146 et Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
EconoTaq PLUS 2X Master MixLucigen30035-1Amplification des gènes cibles (PCR)
DNase/RNeau distillée sansInvitrogen10977035Amplification des gènes cibles (PCR)
Safe-Red Loading DyeabmG108-RÉlectrophorèse sur gel d’ADN
1 kb Plus Échelle d’ADNGoldBioD011-500Électrophorèse
sur gel d’ADNKit de dosage des protéines QubitInvitrogenQ33211Mesure de la concentration d’ADN
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)amrescoJ106-2KGMilieux de culture bactérienne
AgaroseInvitrogen16500-500Milieux de culture bactérienne et al.
Monosulfate de kanamycineGoldBioK-120-5Antibiotique dans un milieu de culture bactérien
Kit de système de clonage et d’expression Expresso Rhamnose, N-HisLucigen49011-1Kit de clonage Kit de
système de clonage et d’expression Expresso Rhamnose, SUMOLucigen49013-1Kit de clonage
Expresso Rhamnose Kit de système de clonage et d’expression, C-HisLucigen49012-1Kit de clonage
Solution de glycérolSigma-Aldrich15524-1L-RPréparation du stock de glycérol
L-Rhamnose monohydratéSigma-Aldrich83650Induction de l’expression protéique
2X Laemmli Sample BufferClearBandTGS10Analyse de la page SDS
SureCast 40 % (p/v) AcrylamideInvitrogenHC2040page SDS
SureCast APSInvitrogenHC2005SDS-Page analysis
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-Page analysis
10X Running BufferClearBandTGS10SDS-Page analysis
Triset al.BioShopTRS001.1SDS-Page analyse et lyse cellulaire
10 % SDSClearBandS100SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermoFisher26619SDS-Page analysis
ImidazoleSigma-Aldrich56750Lyse cellulaire
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-RLyse cellulaire
Sodium Phosphate monobasique anhydreamresco0571-1KgTampon de phosphate de sodium pour la lyse cellulaire
Phosphate de sodium dibasique dihydraté et al.Sigma-Aldrich04272-1KgTampon phosphate de sodium pour la lyse cellulaire
Filtre centrifuge à coupure 10 kDaAmicon® ; - MERCKUFC9010Purification d’enzymes
Analyse de la

Références

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