In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Résumé

Ce manuscrit décrit comment évaluer l’immunogénicité in vivo des vésicules extracellulaires dérivées de cellules tumorales (VE) à l’aide de la cytométrie en flux. Les VE dérivés de tumeurs subissant une mort cellulaire immunogène induite par le traitement semblent particulièrement pertinents dans l’immunosurveillance tumorale. Ce protocole illustre l’évaluation des VE des tumeurs immunostimulantes induites par l’oxaliplatine, mais peut être adapté à divers contextes.

Résumé

La mort cellulaire immunogène des tumeurs, causée par la chimiothérapie ou l’irradiation, peut déclencher des réponses des lymphocytes T spécifiques à la tumeur en libérant des modèles moléculaires associés au danger et en induisant la production d’interféron de type I. Les immunothérapies, y compris l’inhibition des points de contrôle, reposent principalement sur des cellules T préexistantes spécifiques à la tumeur pour déployer un effet thérapeutique. Ainsi, les approches thérapeutiques synergiques qui exploitent la mort cellulaire immunogène comme vaccin anticancéreux intrinsèque peuvent améliorer leur réactivité. Cependant, le spectre des facteurs immunogènes libérés par les cellules soumises à un stress induit par le traitement reste incomplètement caractérisé, en particulier en ce qui concerne les vésicules extracellulaires (VE). Les VE, des particules membraneuses à l’échelle nanométrique émises par pratiquement toutes les cellules, sont considérés comme facilitant la communication intercellulaire et, dans le cancer, il a été démontré qu’ils médient l’amorçage croisé contre les antigènes tumoraux. Pour évaluer l’effet immunogène des VE dérivés de tumeurs dans diverses conditions, des méthodes adaptables, évolutives et valides sont recherchées. Par conséquent, une approche relativement simple et robuste est présentée ici pour évaluer l’immunogénicité in vivo des VE. Le protocole est basé sur l’analyse par cytométrie en flux des lymphocytes T spléniques après l’immunisation in vivo de souris avec des VE, isolées par des tests basés sur les précipitations à partir de cultures de cellules tumorales sous thérapie ou dans des conditions d’état d’équilibre. Par exemple, ces travaux montrent que l’exposition à l’oxaliplatine des cellules de mélanome murin B16-OVA a entraîné la libération de VE immunogènes qui peuvent servir de médiateur dans l’activation des lymphocytes T cytotoxiques réactifs à la tumeur. Par conséquent, le dépistage des VE par immunisation in vivo et cytométrie en flux identifie les conditions dans lesquelles les VE immunogènes peuvent émerger. L’identification des conditions de libération immunogène des VE fournit une condition préalable essentielle pour tester l’efficacité thérapeutique des VE contre le cancer et explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents afin de dévoiler de nouvelles perspectives sur le rôle des VE dans l’immunologie du cancer.

Introduction

Le système immunitaire joue un rôle central dans la lutte contre le cancer, à la fois lorsqu’il est incité par l’inhibition du point de contrôle immunitaire et pour l’efficacité des thérapies conventionnelles contre le cancer. Les cellules tumorales succombant à des thérapies génotoxiques telles que les agents chimiothérapeutiques oxaliplatine et doxorubicine, ou la radiothérapie ionisante peuvent libérer des antigènes et des modèles moléculaires associés au danger (DAMP) qui initient potentiellement une réponse immunitaire antitumorale ^adaptative1. Les DAMP les plus importants, dans le contexte de la mort cellulaire immunogène, comprennent les....

Protocole

Au début des expériences, les souris étaient âgées d’au moins 6 semaines et étaient maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes. Le présent protocole est conforme aux normes éthiques institutionnelles et aux réglementations locales en vigueur. Les études sur les animaux ont été approuvées par l’organisme de réglementation local (Regierung von Oberbayern, Munich, Allemagne). Les biais possibles liés au sexe n’ont pas été étudiés dans ces études.

1. Génération et isolement de VE dérivés de cellules tumorales après une exposition à la chimiothérapie

1. Cultiver des cellules de mélanome B16 murin exprimant l’o....

Résultats

Ce protocole vise à faciliter l’évaluation simple et facilement reproductible de l’immunogénicité des VE dérivés de tumeurs. Ainsi, les souris sont inoculées avec des VE dérivées de cultures in vitro de cellules tumorales exprimant l’antigène modèle de l’ovalbumine de poulet (OVA). La réponse immunitaire subséquente est analysée dans les lymphocytes T spléniques par cytométrie en flux.

La figure 1 donne un aperçu des étapes pratiques de l’ensembl.......

Discussion

Ce protocole fournit une évaluation immunologique in vivo des VE dérivés de cellules de mélanome sous stress induit par la chimiothérapie tout en s’adaptant aux VE émis par divers cancers sous divers traitements. L’immunisation des souris avec des VE dérivés de cellules B16-OVA traitées à l’oxaliplatine, par exemple, élargit les lymphocytes T CD8⁺ producteurs d’IFN-γ dans la rate, qui sont ensuite stimulés par incubation ex vivo avec de l’ovalbumine, indiquant une réponse immunitaire spécifiq.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Clone 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clone GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clone 53-6.7
Anti-IFN&gamma ; PE	eBioscience	RM90022	Clone XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Passoire à cellules, 100 µ ; m	Greiner	542000	EASYtrainer 100 & micro ; m
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium avec D-glucose (4,5 g/L) et L-glutamine (4 mM)
FBS Good Forte PAN	BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixable Viability Dye eFluor 506	eBioscience, division de Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Concentré de fixation/perméabilisation	eBioscience	00-5123-43	Concentré de fixation/perméabilisation (10x)
Diluant de fixation/perméabilisation	eBioscience	00-5223-56
Ionomycine	Sigma-Aldrich	407952	de Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, &ge ; 97 % (HPLC)
L-Glutamine	Gibco	25030-032	L-Glutamine (200 mM)
Ovalbumine	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumine avec endotoxine < 1 EU/mg - CAS 9006-59-1
Oxaliplatine	Pharmacie de l’hôpital
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Solution saline tamponnée au phosphate sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	1514-122	Mélange de pénicilline (10 000 U/mL) et de streptomycine (10 000 μg/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-myristate 13-acétate, &ge ; 99 % (HPLC)
Filtre PVDF, 0,22 µ ; m, pour seringues	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Unité de filtre 0,22 & micro ; m Durapore PVDF
Membrane Red Blood Cell Lysis	Buffer Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium avec D-glucose (2,00 g/L) et L-glutamine (300 mg/L), sans
HEPES Seringue, 26 G	BD Biosciences	305501	1 mL Seringues Sub-Q avec aiguille (0,45 mm x 12,7 mm)
Réactif d’isolement d’exosome total	Invitrogen	4478359	Pour l’isolement à partir de milieux de culture cellulaire
&beta ; -Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	&beta ; -Mercaptoéthanol (50 mM)

IRM