Method Article

Formulation et modulation acoustique de nanogouttelettes de perfluorocarbone vaporisées optiquement

DOI:

10.3791/62814

⸱

July 16th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les nanogouttelettes de perfluorocarbone optiquement activées sont prometteuses dans les applications d’imagerie en dehors du système vasculaire. Cet article montrera comment synthétiser ces particules, réticuler les fantômes de polyacrylamide et moduler les gouttelettes acoustiquement pour améliorer leur signal.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les microbulles sont l’agent de contraste d’imagerie le plus couramment utilisé en échographie. Cependant, en raison de leur taille, ils sont limités aux compartiments vasculaires. Ces microbulles peuvent être condensées ou formulées sous forme de nanogouttelettes de perfluorocarbures (PFCnD) suffisamment petites pour extravaser puis être déclenchées acoustiquement sur le site cible. Ces nanoparticules peuvent être encore améliorées en incluant un absorbeur optique tel qu’un colorant organique proche infrarouge ou des nanoparticules (par exemple, des nanoparticules de sulfure de cuivre ou des nanoparticules d’or / nanotiges d’or). Les PFCnD marqués optiquement peuvent être vaporisés par irradiation laser dans un processus connu sous le nom de vaporisation optique de gouttelettes (ODV). Ce processus d’activation permet l’utilisation de noyaux perfluorés à point d’ébullition élevé, qui ne peuvent pas être vaporisés acoustiquement en dessous du seuil d’indice mécanique maximal pour l’imagerie diagnostique. Les noyaux à point d’ébullition plus élevé produisent des gouttelettes qui se recondensent après la vaporisation, ce qui entraîne des PFCnD « clignotants » qui produisent brièvement un contraste après la vaporisation avant de se condenser à nouveau sous forme de nanogouttelettes. Ce processus peut être répété pour produire un contraste à la demande, ce qui permet l’imagerie sans arrière-plan, le multiplexage, la super-résolution et l’amélioration du contraste grâce à la modulation optique et acoustique. Cet article montrera comment synthétiser des PFCnD à enveloppe lipidique déclenchables optiquement en utilisant la sonication de sonde, créer des fantômes de polyacrylamide pour caractériser les nanogouttelettes et moduler acoustiquement les PFCnD après ODV pour améliorer le contraste.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les microbulles sont l’agent de contraste ultrasonore le plus omniprésent en raison de leur biocompatibilité et de leur excellente échogénicité par rapport aux tissus mous. Cela en fait des outils précieux pour visualiser le flux sanguin, la délimitation des organes et d’autres applications1. Cependant, leur taille (1-10 μm), ce qui les rend exceptionnels pour l’imagerie basée sur leur fréquence de résonance, limite leurs applications au système vasculaire2.

Cette limitation a conduit au développement des PFCnD, qui sont des nano-émulsions composées d’un tensioactif enfermé autour d’un noyau de perfluorocarbone liquide. Ces nanoparticules peuvent être synthétisées à des tailles aussi petites que 200 nm et sont conçues pour tirer parti du système vasculaire ou des pores « perméables » et des fenestrations ouvertes trouvées dans le système vasculaire tumoral. Bien que ces perturbations soient dépendantes de la tumeur, cette perméabilité permet une extravasation des nanoparticules de ~200 nm à 1,2 μm selon la tumeur 3,4. Dans leur forme initiale, ces particules produisent peu ou pas de contraste ultrasonore. Lors de la vaporisation - induite acoustiquement ou optiquement - la phase centrale passe du liquide au gaz, induisant une augmentation de deux fois et demie à cinq du diamètre 5,6,7 et générant un contraste photoacoustique et ultrasonore. Bien que la vaporisation acoustique soit la méthode d’activation la plus courante, cette approche crée des artefacts acoustiques qui limitent l’imagerie de la vaporisation. De plus, la plupart des hydrocarbures perfluorés nécessitent des ultrasons focalisés avec un indice mécanique au-delà du seuil de sécurité pour se vaporiser8. Cela a conduit au développement de PFCnD à point d’ébullition inférieur, qui peuvent être synthétisés en condensant des microbulles en nanogouttelettes9. Cependant, ces gouttelettes sont plus volatiles et sujettes à une vaporisation spontanée10.

La vaporisation optique par gouttelettes (ODV), en revanche, nécessite l’ajout d’un déclencheur optique tel que les nanoparticules 11,12,13 ou le colorant 6,14,15 et peut vaporiser des perfluorocarbones à point d’ébullition plus élevé en utilisant des fluences dans la limite de sécurité ANSI 11. Les PFCnD synthétisés avec des noyaux à point d’ébullition plus élevé sont plus stables et se recondensent après vaporisation, ce qui permet une imagerie sans arrière-plan16, un multiplexage 17 et une super-résolution18. L’une des principales limites de ces techniques est le fait que les PFCnD à point d’ébullition élevé sont échogènes après vaporisation pendant une courte période, à l’échelle de millisecondes19, et sont relativement faibles. Bien que ce problème puisse être atténué par des vaporisations répétées et la moyenne, la détection et la séparation du signal des gouttelettes restent un défi.

En s’inspirant de l’inversion d’impulsion, la durée et le contraste peuvent être améliorés en modifiant la phase de l’impulsion d’imagerie ultrasonore19. En démarrant l’impulsion d’imagerie ultrasonore avec une phase de raréfaction (n-pulse), la durée et le contraste des PFCnDs vaporisés augmentent. En revanche, le démarrage de l’impulsion d’imagerie ultrasonore avec une phase de compression (p-pulse) entraîne une réduction du contraste et une durée plus courte. Cet article décrira comment synthétiser des nanogouttelettes de perfluorocarbone déclenchables optiquement, des fantômes de polyacrylamide couramment utilisés en imagerie, et démontrera l’amélioration du contraste et la longévité du signal grâce à la modulation acoustique.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Formulation de nanogouttelettes de fluorocarbone

  1. Rincer une fiole à fond rond de 10 ml avec du chloroforme et laver une seringue en verre étanche aux gaz de 10 μL et 1 mL avec du chloroforme en aspirant à plusieurs reprises le volume complet de la seringue et en l’expulsant trois fois au total.
    ATTENTION : Le chloroforme est volatil et peut être toxique en cas d’inhalation. Tous les travaux avec ce solvant doivent être effectués dans une hotte.
  2. À l’aide des seringues, ajouter 200 μL de DSPE-mPEG2000 (25 mg/mL), 6,3 μL de 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC, 25 mg/mL) et 1 mL d’IR 1048 (1 mg/mL dans le chloroforme) dans la fiole à fond rond. N’oubliez pas de nettoyer les seringues entre les lipides / colorants pour éviter la contamination du stock.
    REMARQUE: Les colorants infrarouges sont sensibles à la lumière et le travail doit être effectué dans des conditions sombres ou les flacons doivent être recouverts de papier d’aluminium.
  3. Retirez le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif. Assurez-vous que le vide est lentement ajusté à 332 mbar pour éviter les chocs. Après 5 min, réduire la pression à 42 mbar pour éliminer toute eau qui aurait pu pénétrer dans la solution.
    NOTE: Le gâteau lipidique peut être conservé pendant la nuit dans une fiole à fond rond recouverte de parafilm à 4 °C.
  4. Suspendre le gâteau lipidique dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et sonicater ou vortex à température ambiante pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que tout le gâteau lipidique ait été mis en suspension et dissous dans la solution. Sonicer pendant 2 minutes supplémentaires pour homogénéiser la solution.
  5. Transférer la solution dans un flacon en verre de 7 ml et placer le flacon dans un plat en verre rempli de glace pour laisser refroidir la solution pendant 5 minutes avant d’ajouter 50 μL de perfluorohexane à l’aide d’une seringue en verre étanche aux gaz. N’oubliez pas de rincer la seringue avec du perfluorohexane avant de la distribuer dans le flacon.
  6. Placez le flacon en verre contenant les lipides et le bain de glace dans l’enceinte du sonicateur de sonde et immergez l’extrémité de la sonde sous le miniscus. Assurez-vous que les côtés de la sonde du sonicateur ne touchent pas la lèvre du flacon en verre.
  7. Sonder soniquer le mélange avec les réglages suivants: Amplitude 1, Temps de traitement: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Puis sonicer aux réglages suivants : Amplitude : 50, Temps de traitement : 5 s, Pulse-on : 1 s, Pulse-off : 10 s.
  8. Transférer la solution de nanogouttelettes dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger à 300 x g pendant 3 minutes pour séparer les grosses gouttelettes (>1 μm) des gouttelettes plus petites.
  9. Jeter la pastille et transférer le surnageant dans un autre tube à centrifuger de 1,5 mL. Laver le surnageant par centrifugation à 3000 x g pendant 5 min pour enduire toutes les gouttelettes en solution. Remettez en suspension les PFCnDs dans 1 mL de PBS en pipetant la pastille de haut en bas, puis en soniquant dans un sonicateur de bain pendant 1 min.
  10. Mesurez la taille des gouttelettes à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Diluer les PFCnDs de base de 100 fois (10 μL de PFCnD dans 990 μL de PBS) et le soniquat de bain pour disperser les PFCnD avant de mesurer. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 1.
  11. Déterminer la concentration des PFCnDs à l’aide de l’analyseur de suivi des nanoparticules (voir le tableau des matériaux). Diluer les PFCnDs de 100 à 1000 fois pour assurer une mesure précise de la concentration. Le protocole produit généralement des gouttelettes à une concentration de l’ordre de 10à 10 particules/mL.
  12. Préparer 10 mL de gel de couplage à ultrasons dans un tube centrifuge de 50 mL et ajouter 1 % (v/v) ou 100 μL de PFCnDs pour obtenir une solution de ~108 particules/mL. Vortex la solution à mélanger. Centrifuger le mélange à 4000 x g pendant 3 min pour éliminer les bulles.

2. Préparation fantôme de polyacrylamide

  1. Dégazer l’eau en remplissant un ballon sous vide de 500 ml avec 400 ml d’eau désionisée, sceller avec un bouchon en caoutchouc et raccorder le ballon à la conduite de vide. Ouvrez la conduite de vide et immergez le fond de la fiole dans le sonicateur de bain. Sonicer pendant 5 minutes ou jusqu’à ce qu’aucune formation de bulles de gaz ne soit visible.
  2. Préparer une solution de persulfate d’ammonium (APS) à 10 % en dissolvant 500 mg dans 5 mL d’eau dégazée. Remuer doucement la solution si le persulfate d’ammonium ne se dissout pas complètement.
  3. Dans un bécher de 400 mL muni d’une barre d’agitation sur une plaque d’agitation, ajouter 150 mL d’eau dégazée et 50 mL de solution acrylamide-bisacrylamide à 40 % (p/v) pour former 200 mL de solution d’acrylamide-bisacrylamide à 10 %. Remuer le mélange à 200 tr/min pour permettre le bon mélange sans introduire de bulles.
    ATTENTION: L’acrylamide est cancérogène et tout travail doit être effectué dans une hotte avec des gants, surtout si vous travaillez avec de l’acrylamide sous forme de poudre.
  4. Peser 400 mg de silice et l’ajouter à la solution d’acrylamide-bisacrylamide à 10 % de l’étape 2.3 pour former une solution à 0,2 % (p/v) de silice et d’acrylamide.
    ATTENTION : La silice lorsqu’elle est inhalée peut être cancérigène. Tous les travaux, y compris la pesée, doivent être effectués dans une hotte.
  5. Préparez un moule carré de 58 mm x 58 mm x 78 mm avec une inclusion cylindrique en coupant les extrémités d’une pipette de transfert en plastique et en la soutenant dans le moule avec du ruban de laboratoire. Voir la figure 2.
  6. Ajouter 2 mL de solution d’APS à 10 % dans le bécher pour obtenir une concentration finale de 0,1 % APS et ajouter 250 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) à la solution fantôme. Laisser la solution remuer brièvement (moins d’une minute).
  7. Versez rapidement la solution dans le moule, tout en veillant à ne pas introduire de bulles d’air dans la solution. La solution doit polymériser en 10 minutes. Retirez le fantôme en faisant passer l’extrémité plate d’une spatule de laboratoire autour du bord du moule et en inversant le moule.
    REMARQUE: Ces fantômes peuvent être réutilisés plusieurs fois et doivent être immergés dans l’eau et stockés à 4 ° C.

3. Imagerie des nanogouttelettes de fluorocarbone

  1. Allumez et réchauffez le système laser pulsé pendant ~20 minutes en suivant les instructions du fabricant. Assurez-vous que le faisceau de fibres optiques est correctement connecté à la sortie laser et que les deux pieds sont correctement placés dans le support du faisceau de fibres.
  2. Allumez le système d’imagerie par ultrasons, connectez le transducteur d’imagerie matricielle (L11-4v) au système et fixez le transducteur dans le support pour aligner son plan d’imagerie avec la section transversale laser.
  3. Réglez la fréquence de répétition des impulsions du système laser sur 10 Hz et placez un capteur de puissance à l’extrémité du faisceau de fibres pour mesurer l’énergie. Réglez le délai de l’interrupteur q jusqu’à ce que la fluence estimée soit de 70 mJ/cm2.
    ATTENTION: Des lunettes appropriées doivent être portées lors du tir du laser et des rideaux laser doivent entourer l’espace.
  4. Remplissez l’un des canaux du fantôme de polyacrylamide avec le mélange gel à ultrasons/PFCnD à l’aide d’une seringue à embout coulissant en plastique de 1 mL. Couvrir généreusement le haut du canal avec un gel à ultrasons et enlever les bulles avec une seringue à embout en plastique de 1 mL. Placez le fantôme de polyacrylamide sous le transducteur et le faisceau de fibres, comme illustré à la Figure 3.
  5. Utilisez la plate-forme d’imagerie combinée à ultrasons laser et élasticité (CLUE) basée sur le logiciel20 pour imager PFCnD synchronisée avec activation optique. Modifiez les paramètres généraux définis par l’utilisateur dans la structure Param pour l’imagerie : définissez la profondeur de début/fin sur 0/40 mm, la fréquence centrale sur 6,9 MHz et le nom du transducteur sur « L11-4v ».
  6. Définir un nouveau RunCase et concevoir une séquence de modules pour l’activation/recondensation optique répétée et l’imagerie US des PFHnD. Cela se fait en répertoriant les modules prédéfinis tels que l’imagerie ultrarapide (mUF), le laser externe (mExtLaser) et le ralenti (mIdle).
    1. Répétez deux fois le jeu de séquences mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF pour acquérir les données d’imagerie à n impulsions et p.
      REMARQUE: Le premier module mExtLaser de chaque séquence est défini comme un laser simulé en réglant ExtLaser.Enable sur 0 et le 'mIdle' est inclus pour minimiser le temps entre les images US d’arrière-plan et les images US n/p-pulse après l’activation laser.
  7. Définissez les paramètres de module pour chaque module placé dans la séquence de module du cas d’exécution en cours. Accédez à chaque paramètre de module par index correspondant à son ordre dans la séquence du module. Les modules exécuteront des opérations prédéfinies avec les paramètres de module définis par l’utilisateur ici.
    1. Réglez ExtLaser.QSdelay dans les modules laser externes sur la valeur du retard du Q-switch laser réglé à l’étape 3.3, en microsecondes. Ce module attend que le déclenchement de la lampe de poche du système laser s’éteigne et génère le déclenchement Q-switch après le délai spécifié dans QSdelay.
    2. Dans le module d’imagerie ultrarapide, définissez Resource.numFrame sur 100, SeqControl.PRI sur 200 (μs) et définissez TW.polarity sur 1 pour l’impulsion P et -1 pour l’impulsion N (voir la Figure 4 pour la forme d’impulsion correspondante). Ce module transmettra une onde plane ultrarapide de 0 degré avec le type d’impulsion spécifié en polarité TW.
      1. Obtenez une fenêtre d’imagerie à pleine ouverture de 38,8 mm de large pour le nombre d’images dans Resource.numFrame, l’intervalle de répétition d’impulsions de SeqControl.PRI, puis enregistrez les données pour un traitement hors ligne.
    3. Réglez SeqControl.lastPRI_Module en module inactif sur la durée entre les impulsions laser (100 ms) soustraite par le retard du commutateur Q, le temps d’acquisition des données d’imagerie (20 ms) et une marge de 20 μs pour que le signal se déplace. Ce module maintient le système sous l’état « sans fonctionnement » pendant la durée de SeqControl.lastPRI_Module pour combler le laps de temps entre la fin de l’acquisition des données d’imagerie et la prochaine excitation d’impulsion laser.

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Results

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Une formulation réussie et une séparation centrifuge des PFCnD devraient produire des gouttelettes d’environ 200 à 300 nm de diamètre (Figure 1A). Des gouttelettes mal séparées peuvent montrer de petits pics autour de 1 μm. Ces solutions peuvent être davantage soniquées pour briser les plus grosses gouttelettes. La taille des gouttelettes augmentera avec le temps en raison de la coalescence et/ou de la diffusion dans un processus connu sous le nom de maturation d’Ostwald21,...

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Discussion

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La sonication de sonde est une méthode relativement simple et facile à apprendre pour fabriquer des PFCnD. Il y a quelques étapes où il faut faire attention. Lors de la manipulation du chloroforme, il est impératif d’utiliser une pipette volumétrique ou des seringues en verre, car il est volatil et « fuira » des pipettes à déplacement d’air standard. De plus, si vous utilisez un déplacement positif, assurez-vous qu’une pointe appropriée est utilisée car le chloroforme dissoudra la plupart des embouts en plastique, ce qui...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Le travail a été financé en partie par la Fondation de la recherche sur le cancer du sein dans le cadre de la subvention BCRF-20-043.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Persulfate d’ammonium (APS)VWR97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids850365CLipids, ceux-ci peuvent être achetés en suspension sous forme de chloroforme ou sous forme de poudre. Pour le stockage à long terme, la forme en poudre est la meilleure, mais le chloroforme est plus pratique.
1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d’ammonium) (DSPE-PEG)Avanti Polar Lipids880120CLipids, ceux-ci peuvent être achetés en suspension sous forme de chloroforme ou sous forme de poudre. Pour le stockage à long terme, la forme en poudre est la meilleure, mais le chloroforme est plus pratique.
Acrylamide : Solution de bisachylamide (19:1) 40 % (p/v), OmniPur® ;VWREM-1300solution d’acrylamide, concentration plus faible/poudre
IR-1048Sigma405175Colorant infrarouge
L11-4vVerasonics-transducteurà réseau linéaire à ultrasons
Microtip 1/8"Qsonica LLC4418microtip pour sonde sonicateur
N, N, N&prime ;, N&prime ; -Tetramethylethylenediamine (TEMED)VWR97064-902Utilisé pour polymériser le polyacrylamide en formant des radicaux libres en présence de persulfate d’ammonium
Nova IIOphir-Spiricon7Z01550capteur de puissance laser
PerfluorohexaneFluoromedFluoromed APF-60Mperfluorocarbone liquide
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)VWR97062-732Comprimés utilisés pour la fabrication de PBS
Q500Qsonica LLCQ500-110Sonde sonicateur
Gel de siliceSigma-Aldrich2885002-25 &mu ; m taille des particules
Tempest 30New waveresearch-Systèmelaser pulsé
Vantage 128Verasonics-researchSystème d’imagerie par ultrasons
Zetasizer Nano ZSMalvern InstrumentsLtd-Effectuedes mesures de taille basées sur la diffusion dynamique de la lumière

References

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