Ablations volumiques profondes et spatialement contrôlées à l’aide d’un microscope à deux photons dans la Gastrula du poisson-zèbre

Summary

Le développement embryonnaire nécessite une coordination à grande échelle du mouvement cellulaire. L’ablation laser médiée par l’excitation à deux photons permet l’ablation en 3 dimensions contrôlée spatialement de grands groupes de cellules profondes. De plus, cette technique permet de sonder la réaction des cellules qui migrent collectivement in vivo à des perturbations dans leur environnement mécanique.

Abstract

La morphogenèse implique de nombreux mouvements cellulaires pour organiser les cellules en tissus et organes. Pour un bon développement, tous ces mouvements doivent être étroitement coordonnés, et l’accumulation de preuves suggère que cela est réalisé, au moins en partie, par des interactions mécaniques. Tester cela dans l’embryon nécessite des perturbations physiques directes. Les ablations au laser sont une option de plus en plus utilisée qui permet d’alléger les contraintes mécaniques ou d’isoler physiquement deux populations cellulaires l’une de l’autre. Cependant, de nombreuses ablations sont effectuées avec un laser ultraviolet (UV), qui offre une résolution axiale et une pénétration tissulaire limitées. Une méthode est décrite ici pour ablation de volumes profonds, significatifs et spatialement bien définis à l’aide d’un microscope à deux photons. Les ablations sont démontrées dans une lignée transgénique de poisson zèbre exprimant la protéine fluorescente verte dans le mésendoderme axial et utilisées pour couper le mésendoderme axial sans affecter l’ectoderme sus-jacent ou la cellule vitellin sous-jacente. Le comportement cellulaire est surveillé par imagerie en direct avant et après l’ablation. Le protocole d’ablation peut être utilisé à différents stades de développement, sur n’importe quel type de cellule ou de tissu, à des échelles allant de quelques microns à plus d’une centaine de microns.

Introduction

Les interactions cellule-cellule jouent un rôle essentiel dans le développement. Les cellules fournissent des signaux que leurs voisines directes, ou des cellules plus éloignées, peuvent percevoir, influençant ainsi leur destin et / ou leur comportement. Beaucoup de ces signaux sont de nature chimique. Par exemple, dans les événements d’induction bien caractérisés, un groupe cellulaire produit des molécules diffusibles affectant le devenir d’une autre population ^cellulaire1. D’autres signaux, cependant, sont mécaniques; les cellules exercent des forces et des contraintes sur leurs voisins, que les voisins perçoivent et auxquels ils

Protocol

Tous les travaux d’animaux ont été approuvés par le Comité d’Éthique N 59 et le Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche sous le numéro de dossier APAFIS#15859-2018051710341011v3. Certaines des étapes décrites ci-dessous sont spécifiques à nos équipements et logiciels, mais pourraient être facilement adaptées à différents équipements.

1. Préparation par injection

1. Préparer 75 mL de solution d’agarose à 1 % dans un milieu embryonnaire (EM).
2. Placez le moule injecteur dans une boîte de Petri de 90 mm et versez environ 50 mL d’agarose, assez pour que le moule flotte. Laissez l’agarose....

Results

Pour couper le polster en son milieu, un embryon Tg(gsc:GFP), injecté avec des ARNm Histone2B-mCherry a été monté au stade épiboly à 70%, comme décrit à l’étape 4. Le polster a été identifié par l’expression de GFP, et l’embryon a été monté de manière à ce que le plan du polster soit perpendiculaire à l’axe optique (Figure 1B). Incliner l’embryon loin de cette position compliquera la procédure. La lumière devra traverser plus de tissus pour atteindre les plans d’ablation, et les pla.......

Discussion

Nous décrivons ici un protocole qui utilise une optique non linéaire pour effectuer des ablations volumiques profondes et spatialement bien définies. L’étape la plus critique du protocole est de trouver des conditions de traitement qui fournissent suffisamment d’énergie pour permettre des ablations, mais pas trop d’énergie, afin d’éviter des débris excessifs ou une cavitation. La quantité d’énergie délivrée sur le site cible dépend principalement de: (1) la puissance de sortie du laser, (2) la qualité de l’alignement las.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Objectif à immersion dans l’eau 25x	Olympus	XLPLN25XWMP2
Agarose	PanReac AppliChem	A8963,0500
Logiciel d’analyse de données : Matlab	Math Works
Modulateur électro-optique (EOM)	ConOptics	350-80LA
Solution			de milieu embryonnaire (EM)Westerfield, M. Le livre du poisson-zèbre. Guide pour l’utilisation en laboratoire du poisson-zèbre (Danio rerio), 5e édition. Presses de l’Université de l’Oregon, Eugene (livre). (2000).
Chambre environnementale	Chambre Okolab	H201-T-UNIT-BL
EOM driver	ConOptics	302RM
Source de fluorescence	Lumencor	SOLA
Plats à fond en verre	MatTek	P35G-0-10-C
Capillaires en verre	Harvard Apparatus	300085	Diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur 0,58  ; mm
Pipettes en verre	Volac	D810	L’embout doit être poli au feu
Vert/laser d’ablation	Spectra Physics	Mai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNA			synthétisé à partir du plasmide pCS2-H2B-mCherry (Dumortier& al. 2012)
Logiciel d’analyse d’images : IMARIS	Bitplane
ImSpector software	Abberior Equipe de développement d’instruments
Moule d’injection	Outils scientifiques adapatifs	I-34
Embouts de microchargeur	Eppendorf	5242956003
Micromanipulateur	Narishige	MN-151
Extracteur de micropipettes	Sutter	P-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcription	Invitrogen	AM1340
Pénicilline-Streptomycine	Thermofisher	15140-122	10 000 unités de pénicilline et 10 mgstreptomycine par ml
Tube photomultiplicateur (PMT)	Hammamatsu	H7422-40
PicoPump (Injecteur d’air)	World Precision Instrument	PV820
Laser rouge	Spectra Physics	OPO/Insight DeepSee
Eau libre d’ARNase pour injection	Sigma	W3500
Tableur : Excel	Microsoft
Stereomicroscope	Nikon	SMZ18
Tg(gsc :GFP) ligne			Doitsidou, M. et al. Guidage de la migration des cellules germinales primordiales par la chimiokine SDF-1. Cellule. 111 (5), 647&ndash ; 59, DOI : doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).
Microscope TriM Scope II	La Vision Biotech