Expression de GFP induite par la lumière dans des embryons de poisson-zèbre à l’aide du système optogénétique TAEL/C120

Résumé

L’optogénétique est un outil puissant avec de nombreuses applications. Ce protocole montre comment obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue.

Résumé

Les systèmes d’expression génique inductibles sont un outil inestimable pour l’étude des processus biologiques. Les systèmes d’expression optogénétique peuvent fournir un contrôle précis sur le moment, l’emplacement et l’amplitude de l’expression des gènes en utilisant la lumière comme agent inducteur. Dans ce protocole, un système d’expression optogénétique est utilisé pour obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre. Ce système repose sur un facteur de transcription conçu appelé TAEL basé sur un facteur de transcription naturel activé par la lumière de la bactérie E. litoralis. Lorsqu’il est éclairé par une lumière bleue, TAEL se dimérise, se lie à son élément régulateur apparenté appelé C120 et active la transcription. Ce protocole utilise des embryons transgéniques de poisson zèbre qui expriment le facteur de transcription TAEL sous le contrôle du promoteur ubb omniprésent. Dans le même temps, l’élément régulateur C120 entraîne l’expression d’un gène rapporteur fluorescent (GFP). En utilisant un simple panneau LED pour délivrer une lumière bleue activatrice, l’induction de l’expression GFP peut d’abord être détectée après 30 minutes d’éclairage et atteint un pic de plus de 130 fois l’induction après 3 h de traitement par la lumière. L’induction de l’expression peut être évaluée par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et par microscopie à fluorescence. Cette méthode est une approche polyvalente et facile à utiliser pour l’expression des gènes optogénétiques.

Introduction

Les systèmes d’expression génique inductibles aident à contrôler la quantité, le moment et l’emplacement de l’expression des gènes. Cependant, il a été difficile d’obtenir un contrôle spatial et temporel exact dans les organismes multicellulaires. Le contrôle temporel est le plus souvent obtenu par l’ajout de composés à petites molécules¹ ou l’activation de promoteurs de choc thermique². Pourtant, les deux approches sont vulnérables aux problèmes de timing, de force d’induction et de réponses au stress hors cible. Le contrôle spatial est principalement réalisé par l’utilisation de promoteurs spécifiques aux tissus 3 , mais^cetteapproche nécessite un promoteur ou un élément régulateur approprié, qui ne sont pas toujours disponibles, et elle n’est pas propice à l’induction au niveau des sous-tissus.

Contrairement à ces approches conventionnelles, les activateurs transcriptionnels optogénétiques activés par la lumière ont le potentiel d’un contrôle spatial et temporel plus fin de l’expression des gènes^4. Le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue a été développé et optimisé pour une utilisation dans les embryons de poisson zèbre^5,6. Ce système est basé sur un facteur de transcription endogène activé par la lumière de la bactérie E. litoralis^7,8. Le système TAEL/C120 se compose d’un activateur transcriptionnel appelé TAEL qui contient un domaine de transactivation Kal-TA4, un domaine LOV (détection lumière-oxygène-tension) sensible à la lumière bleue et un domaine de liaison à l’ADN HTH (helix-turn-helix)^5. Lorsqu’ils sont éclairés, les domaines LOV subissent un changement conformationnel qui permet à deux molécules TAEL de se dimériser, de se lier à un promoteur C120 sensible au TAEL et d’initier la transcription d’un gène d’intérêt en aval^5,8. Le système TAEL/C120 présente une induction rapide et robuste avec une toxicité minimale, et il peut être activé par plusieurs modalités de livraison de lumière différentes. Récemment, des améliorations ont été apportées au système TAEL/C120 en ajoutant un signal de localisation nucléaire au TAEL (TAEL-N) et en couplant l’élément régulateur C120 à un promoteur basal cFos (C120F)(Figure 1A). Ces modifications ont amélioré les niveaux d’induction de plus de 15 fois⁶.

Dans ce protocole, un simple panneau LED est utilisé pour activer le système TAEL/C120 et induire l’expression omniprésente d’un gène rapporteur, GFP. L’induction de l’expression peut être surveillée qualitativement en observant l’intensité de fluorescence ou quantitativement en mesurant les niveaux de transcription à l’aide de la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Ce protocole démontrera le système TAEL/C120 comme un outil polyvalent et facile à utiliser qui permet une régulation robuste de l’expression des gènes in vivo.

Protocole

Cette étude a été réalisée avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie Merced.

1. Croisement de poissons-zèbres et collecte d’embryons

1. Maintenir des lignées de poissons-zèbres transgéniques distinctes contenant soit l’activateur transcriptionnel TAEL, soit le gène rapporteur contrôlé par C120 afin de minimiser l’activation fallacieuse.
2. Croisez 6 à 8 poissons-zèbres adultes de^chaque lignée en utilisant les méthodes standard 9 pour produire des embryons transgéniques doubles contenant à la fois les composants TAEL et C120(figure 1B).
   REMARQUE: Alternativement, les deux composants peuvent être exprimés transitoirement par microinjection de l’ARNm ou de l’ADN plasmidique en utilisant des méthodes standard¹⁰.
3. Recueillir des embryons dans des boîtes de Pétri contenant de l’eau d’œuf (60 μg/mL de sel de mer instant de l’océan dissous dans de l’eau distillée), avec environ 30 embryons par condition à tester.
4. Placez la vaisselle dans une boîte à l’épreuve de la lumière ou couvrez avec du papier d’aluminium pour minimiser l’activation involontaire par la lumière ambiante (voir le tableau 1).

2. Induction lumineuse globale

1. Utilisez un panneau LED à lumière bleue (465 nm) pour transmettre une lumière bleue activatrice à plusieurs embryons à la fois.
2. Positionner le panneau LED par rapport aux boîtes de Petri contenant des embryons de manière à ce que la puissance réelle de la lumière reçue par les embryons soit d’environ 1,5 mW/cm2 mesurée par un compteur de puissance lumineuse et d’énergie(Figure 2A).
3. Pulser la lumière à des intervalles de 1 h on/1 h d’arrêt à l’aide d’un relais de minuterie si elle s’allume pendant plus de 3 h pour réduire le risque de photodommages à l’activateur transcriptionnel TAEL^5,8.
   REMARQUE: La durée exacte de l’éclairage peut devoir être optimisée pour des applications spécifiques. Dans ce protocole, des exemples de durée d’éclairement de 30 min, 1 h, 3 h et 6 h sont fournis.
4. Retirez les couvercles des boîtes de Petri pour minimiser la diffusion de la lumière due à la condensation.
5. Placez les boîtes de Petri contenant des embryons de contrôle dans une boîte résistante à la lumière ou couvrez-les de papier d’aluminium pour les contrôles sombres.

3. Évaluation quantitative de l’induction par qRT-PCR

1. Retirez les embryons de l’éclairage après la durée d’activation souhaitée.
2. Extrayez l’ARN total de 30 à 50 embryons activés par la lumière et de 30 à 50 embryons sombres à l’aide d’un kit d’isolement d’ARN en suivant les instructions du kit.
   1. Transférer les embryons dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et éliminer l’excès d’eau d’œuf. Ajouter un tampon de lyse et homogénéiser les embryons avec un pilon en plastique.
   2. Transférez le lysate dans une colonne fournie par le kit et continuez avec les instructions du kit. Passez immédiatement à l’étape 3.3 ou stockez l’ARN purifié à -20 °C à -80 °C.
3. Utilisez 1 μg d’ARN total pour la synthèse de l’ADNc à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc en suivant les instructions du kit.
   1. Prenez un tube PCR de 0,2 mL à paroi mince, ajoutez 1 μg d’ARN à 4 μL de 5x mélange maître de réaction d’ADNc (contenant un tampon optimisé, des oligo-dT et des amorces aléatoires, et des dNTP), 1 μL de solution de transcriptase inverse 20x et de l’eau sans nucléase pour un volume total de 20 μL.
   2. Placez le tube dans un thermocycleur programmé comme suit : 22 °C pendant 10 min, 42 °C pendant 30 min, 85 °C pendant 5 min, puis maintenez à 4 °C. Passez immédiatement à l’étape 3.4 ou stockez l’ADNc à -20 °C.
4. Préparer des réactions qPCR contenant le mélange maître d’enzyme verte SYBR, 5 fois l’ADNc dilué (étape 3.3) et 325 nM de chaque amorce pour la GFP.
   REMARQUE : Amorces utilisées dans ce protocole comme suit. GFP en avant: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP inversé: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a forward 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a inverse : 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
5. Effectuer des réactions qPCR dans une machine PCR en temps réel.
   REMARQUE: Programme PCR: activation initiale à 95 °C pendant 10 min, suivie de 40 cycles de 30 s à 95 °C, 30 s à 60 °C et 1 min à 72 °C.
6. Effectuer une analyse de la courbe de fusion une fois la PCR terminée pour déterminer la spécificité de la réaction. Effectuez trois réplications techniques pour chaque échantillon.
7. Calculer l’induction activée par la lumière en tant que changement de pli par rapport aux embryons maintenus dans l’obscurité en utilisant la méthode^{2 -ΔΔCt 11}. La signification statistique peut être déterminée à l’aide d’un progiciel de statistiques.

4. Évaluation qualitative de l’induction par microscopie à fluorescence

1. Retirez les embryons de l’éclairage après la durée d’activation souhaitée.
2. Immobiliser des embryons pour l’imagerie dans 3% de méthylcellulose contenant 0,01% de tricaïne dans des lames de dépression en verre.
3. Obtenez des images de fluorescence et de champ lumineux sur un stéréomicroscope fluorescent connecté à un appareil photo numérique à l’aide des paramètres de filtre GFP standard. Utilisez des paramètres d’acquisition d’image identiques pour tous les échantillons.
4. Fusionnez les images en champ clair et en fluorescence après l’acquisition avec un logiciel de traitement d’image.

Résultats

Pour cette démonstration, une ligne rapporteur GFP sensible au C120 (Tg(C120F:GFP)^ucm107)) a été croisée avec une ligne transgénique qui exprime TAEL-N de manière omniprésente à partir du promoteur de l’ubiquitine b (ubb) (Tg(ubb:TAEL-N)^ucm113)) pour produire des embryons transgéniques doubles contenant les deux éléments. 24 h après la fécondation, les embryons ont été exposés à l’activation de la lumière bleue, pulsée à une fréquence de 1 h on/1 h off. L’inductio...

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation du système optogénétique TAEL/C120 pour obtenir une expression génique inductible à la lumière bleue. Ce système est constitué d’un activateur transcriptionnel, TAEL, qui dimérise lors de l’éclairage avec de la lumière bleue et active la transcription d’un gène d’intérêt en aval d’un élément régulateur C120. L’expression induite d’un rapporteur GFP peut être détectée après aussi peu que 30 minutes d’exposition à la lumière, ce qui suggère que cette approche possède une cinétique relative...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Outil d’illustration scientifique en ligne BioRender			Appareil
photo numérique CCD https://biorender.com/ couleur	Lumenara	755-107
Console compacte de mesure de puissance et d’énergie, LCD numérique 4"	Thorlabs	PM100D
, Filtre d’excitation, 545 nm,	Olympus	ET545/25x
illustra, RNAspin, Mini kit	GE Soins de santé	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Lumière d’aquarium (bleu et blanc)	Amazon	B017GWDF7E
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Minuterie numérique programmable	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix	Quantabio	101414-286
Logiciel de traitement d’images	Photoshop
Prism GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 Système de PCR en temps réel	Applied Biosystems	A28137
Stéréomicroscope	Olympus	SZX16
Tricaïne (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Source lumineuse LED à fluorescence	Excelitas	010-00326R	Discontinué. Il a été remplacé par le X-Cite mini+