Expression de GFP induite par la lumière dans des embryons de poisson-zèbre à l’aide du système optogénétique TAEL/C120

Summary

L’optogénétique est un outil puissant avec de nombreuses applications. Ce protocole montre comment obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue.

Abstract

Les systèmes d’expression génique inductibles sont un outil inestimable pour l’étude des processus biologiques. Les systèmes d’expression optogénétique peuvent fournir un contrôle précis sur le moment, l’emplacement et l’amplitude de l’expression des gènes en utilisant la lumière comme agent inducteur. Dans ce protocole, un système d’expression optogénétique est utilisé pour obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre. Ce système repose sur un facteur de transcription conçu appelé TAEL basé sur un facteur de transcription naturel activé par la lumière de la bactérie E. litoralis. Lorsqu’il est éclairé par une lumière bleue, TAEL se dimérise, se lie à son élément régulateur apparenté appelé C120 et active la transcription. Ce protocole utilise des embryons transgéniques de poisson zèbre qui expriment le facteur de transcription TAEL sous le contrôle du promoteur ubb omniprésent. Dans le même temps, l’élément régulateur C120 entraîne l’expression d’un gène rapporteur fluorescent (GFP). En utilisant un simple panneau LED pour délivrer une lumière bleue activatrice, l’induction de l’expression GFP peut d’abord être détectée après 30 minutes d’éclairage et atteint un pic de plus de 130 fois l’induction après 3 h de traitement par la lumière. L’induction de l’expression peut être évaluée par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et par microscopie à fluorescence. Cette méthode est une approche polyvalente et facile à utiliser pour l’expression des gènes optogénétiques.

Introduction

Les systèmes d’expression génique inductibles aident à contrôler la quantité, le moment et l’emplacement de l’expression des gènes. Cependant, il a été difficile d’obtenir un contrôle spatial et temporel exact dans les organismes multicellulaires. Le contrôle temporel est le plus souvent obtenu par l’ajout de composés à petites molécules¹ ou l’activation de promoteurs de choc thermique². Pourtant, les deux approches sont vulnérables aux problèmes de timing, de force d’induction et de réponses au stress hors cible. Le contrôle spatial est principalement réalisé par l’utilisation de promoteurs spécifiques aux tissus 3 , ma....

Protocol

Cette étude a été réalisée avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie Merced.

1. Croisement de poissons-zèbres et collecte d’embryons

1. Maintenir des lignées de poissons-zèbres transgéniques distinctes contenant soit l’activateur transcriptionnel TAEL, soit le gène rapporteur contrôlé par C120 afin de minimiser l’activation fallacieuse.
2. Croisez 6 à 8 poissons-zèbres adultes de^chaque lignée en utilisant les méthodes standard 9 pour produire des embryons transgéniques doubles contenant à la fois les composants TAEL et C120

Results

Pour cette démonstration, une ligne rapporteur GFP sensible au C120 (Tg(C120F:GFP)^ucm107)) a été croisée avec une ligne transgénique qui exprime TAEL-N de manière omniprésente à partir du promoteur de l’ubiquitine b (ubb) (Tg(ubb:TAEL-N)^ucm113)) pour produire des embryons transgéniques doubles contenant les deux éléments. 24 h après la fécondation, les embryons ont été exposés à l’activation de la lumière bleue, pulsée à une fréquence de 1 h on/1 h off. L’inductio.......

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation du système optogénétique TAEL/C120 pour obtenir une expression génique inductible à la lumière bleue. Ce système est constitué d’un activateur transcriptionnel, TAEL, qui dimérise lors de l’éclairage avec de la lumière bleue et active la transcription d’un gène d’intérêt en aval d’un élément régulateur C120. L’expression induite d’un rapporteur GFP peut être détectée après aussi peu que 30 minutes d’exposition à la lumière, ce qui suggère que cette approche possède une cinétique relative.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Outil d’illustration scientifique en ligne BioRender			Appareil
photo numérique CCD https://biorender.com/ couleur	Lumenara	755-107
Console compacte de mesure de puissance et d’énergie, LCD numérique 4"	Thorlabs	PM100D
, Filtre d’excitation, 545 nm,	Olympus	ET545/25x
illustra, RNAspin, Mini kit	GE Soins de santé	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Lumière d’aquarium (bleu et blanc)	Amazon	B017GWDF7E
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Minuterie numérique programmable	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix	Quantabio	101414-286
Logiciel de traitement d’images	Photoshop
Prism GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 Système de PCR en temps réel	Applied Biosystems	A28137
Stéréomicroscope	Olympus	SZX16
Tricaïne (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Source lumineuse LED à fluorescence	Excelitas	010-00326R	Discontinué. Il a été remplacé par le X-Cite mini+