Imagerie et analyse automatisées pour la quantification des macropinosomes marqués par fluorescence

Koen M. O. Galenkamp; Cheska Marie Galapate; Yijuan Zhang; Cosimo Commisso

doi:10.3791/62828

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Article de méthode

Imagerie et analyse automatisées pour la quantification des macropinosomes marqués par fluorescence

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DOI :

10.3791/62828

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24 août 2021

Koen M. O. Galenkamp¹ , Cheska Marie Galapate¹ , Yijuan Zhang¹ , Cosimo Commisso¹

¹Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, NCI-designated Cancer Center

Dans cet article

Résumé

Les essais automatisés utilisant des microplaques multi-puits sont des approches avantageuses pour identifier les régulateurs de voie en permettant l’évaluation d’une multitude de conditions dans une seule expérience. Ici, nous avons adapté le protocole bien établi d’imagerie et de quantification des macropoinosomes à un format de microplaques à 96 puits et fournissons un aperçu complet de l’automatisation à l’aide d’un lecteur de plaques multimode.

Résumé

La macropinocytose est une voie d’absorption de la phase liquidienne non spécifique qui permet aux cellules d’internaliser de grandes cargaisons extracellulaires, telles que des protéines, des agents pathogènes et des débris cellulaires, par endocytose en vrac. Cette voie joue un rôle essentiel dans une variété de processus cellulaires, y compris la régulation des réponses immunitaires et le métabolisme des cellules cancéreuses. Compte tenu de cette importance dans la fonction biologique, l’examen des conditions de culture cellulaire peut fournir des informations précieuses en identifiant les régulateurs de cette voie et en optimisant les conditions à utiliser dans la découverte de nouvelles approches thérapeutiques. L’étude décrit une technique d’imagerie et d’analyse automatisée utilisant un équipement de laboratoire standard et un lecteur de plaques multimode d’imagerie cellulaire pour la quantification rapide de l’indice macropinocytaire dans les cellules adhérentes. La méthode automatisée est basée sur l’absorption de dextran fluorescent de haut poids moléculaire et peut être appliquée à des microplaques de 96 puits pour faciliter l’évaluation de plusieurs conditions dans une expérience ou des échantillons fixes montés sur des couvercles en verre. Cette approche vise à maximiser la reproductibilité et à réduire la variation expérimentale tout en étant à la fois rapide et rentable.

Introduction

La voie endocytaire non spécifique de la macropinocytose permet aux cellules d’internaliser une variété de composants extracellulaires, y compris les nutriments, les protéines, les antigènes et les agents pathogènes, grâce à l’absorption en vrac du liquide extracellulaire et de ses ^{constituants1}. Bien qu’importante pour la biologie de nombreux types de cellules, la voie de la macropinocytose est décrite comme jouant un rôle essentiel dans la biologie tumorale, où, grâce à l’absorption macropinocytaire, les cellules tumorales sont capables de survivre et de proliférer en présence d’un microenvironnement appauvri en ^{nutriments2,....}