Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte

Résumé

Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.

Résumé

Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs prometteurs pour les applications de thérapie génique. Ici, le vecteur AAV2 est produit par co-culture de cellules Spodoptera frugiperda (Sf9) avec des cellules Sf9 infectées par le baculovirus (BV)-AAV2-GFP (ou gène thérapeutique) et BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension sans sérum. Les cellules sont cultivées dans une fiole dans un agitateur orbital ou un bioréacteur Wave. Pour libérer les particules d’AAV, les cellules productrices sont lysées dans un tampon contenant du détergent, qui est ensuite clarifié par centrifugation et filtration à basse vitesse. Les particules d’AAV sont purifiées du lysat cellulaire à l’aide de la chromatographie sur colonne AVB Sepharose, qui lie les particules d’AAV. Les particules liées sont lavées avec du PBS pour éliminer les contaminants et éluées de la résine à l’aide d’un tampon de citrate de sodium à pH 3,0. L’éluat acide est neutralisé avec un tampon alcalin Tris-HCl (pH 8,0), dilué avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et concentré par filtration à flux tangentiel (TFF). Le protocole décrit la production de vecteurs précliniques à petite échelle compatible avec la fabrication d’AAV de qualité clinique à grande échelle pour les applications de thérapie génique humaine.

Introduction

Les virus adéno-associés (AAV) sont des parvovirus humains non enveloppés contenant un ADN simple brin de 4,6 kb. Les vecteurs AAV présentent plusieurs avantages par rapport aux autres vecteurs viraux pour les applications de thérapie^{génique 1,2,3,4}. Les AAV sont naturellement incompétents en matière de réplication, ce qui nécessite un virus auxiliaire et des machines hôtes pour la réplication. Les AAV ne causent aucune maladie et ont une faible immunogénicité chez l’hôte infecté^3,5. L’AAV peut infecter à la fois les cellules quiescentes et les cellules en division active et peut persister sous forme d’épisome sans s’intégrer dans le génome des cellules hôtes (l’AAV s’intègre rarement dans le génome de l’hôte)^1,3. Ces caractéristiques ont fait de l’AAV un outil souhaitable pour les applications de thérapie génique.

Pour générer un vecteur de transfert de gène AAV, la cassette transgénique, y compris le gène thérapeutique, est clonée entre deux répétitions terminales internes (ITR), qui sont généralement dérivées du sérotype 2 de l’AAV. La taille maximale de 5' ITR à 3' ITR, y compris la séquence transgénique, est de 4,6 kb⁶. Différentes capsides peuvent avoir un tropisme cellulaire ou tissulaire différent. Par conséquent, les capsides doivent être choisies en fonction du type de tissu ou de cellule destiné à être ciblé avec le vecteur AAV⁷.

Les vecteurs AAV recombinants sont couramment produits dans des lignées cellulaires de mammifères telles que les cellules rénales embryonnaires humaines, HEK293 par transfection transitoire du vecteur de transfert de gène AAV, AAV rep-cap, et les plasmides du virus auxiliaire^2,3. Cependant, il existe plusieurs limitations pour la production d’AAV à grande échelle par transfection transitoire de cellules HEK293 adhérentes. Tout d’abord, un grand nombre de piles de cellules ou de bouteilles à rouleaux sont nécessaires. Deuxièmement, de l’ADN plasmidique de haute qualité et des réactifs de transfection sont nécessaires, ce qui augmente le coût de fabrication. Enfin, lors de l’utilisation de cellules HEK293 adhérentes, le sérum est fréquemment nécessaire pour une production optimale, ce qui complique le traitement en aval^1,2,3. Une méthode alternative de fabrication de l’AAV consiste à utiliser la lignée cellulaire d’insectes, les cellules de Spodoptera frugiperda (Sf9) et un virus d’insecte appelé virus de la polyédrose nucléaire multicapside autographa californica recombinant (AcMNPV ou baculovirus)^8,9,10. Les cellules Sf9 sont cultivées dans une culture en suspension sans sérum, facile à mettre à l’échelle et compatible avec la production actuelle de bonnes pratiques de fabrication (GMPc) à grande échelle, qui ne nécessite pas de réactifs plasmidiques ou de transfection. De plus, le coût de production de l’AAV à l’aide du système Sf9-baculovirus est inférieur au coût de l’utilisation de la transfection transitoire des plasmides dans les cellules HEK293¹¹.

Le système original de production de rAAV utilisant des cellules baculovirus-Sf9 utilisait trois baculovirus: un baculovirus contenant une cassette de transfert de gènes, le deuxième baculovirus contenant le gène rep et le troisième baculovirus contenant le gène de capside spécifique au sérotype^12,13. Cependant, la construction de rep contenant le baculovirus était génétiquement instable sur plusieurs cycles de passages, ce qui a empêché l’amplification du baculovirus pour la production à grande échelle d’AAV. Pour résoudre ce problème, un nouveau système de vecteurs rAAV a été développé, qui contenait deux baculovirus (TwoBac): un baculovirus contenant la cassette de transfert de gène AAV et un autre baculovirus contenant les gènes AAV rep-cap ensemble qui sont génétiquement plus stables que le système original et plus pratiques pour produire rAAV en raison de l’utilisation de TwoBac au lieu de trois^{14, 15}. Le système OneBac utilise la cassette de transfert de gènes AAV et les gènes rep-cap dans un seul baculovirus, ce qui est plus pratique pour produire le rAAV en raison de l’utilisation d’un baculovirus au lieu d’utiliser TwoBac ou ThreeBac^2,16,17. Dans notre étude, le système TwoBac a été utilisé pour l’optimisation.

Le système de baculovirus pour la production d’AAV a également des limites: les particules de baculovirus sont instables pour un stockage à long terme dans un milieu sans sérum¹¹, et si le titre de baculovirus est faible, un grand volume de surnageant de baculovirus est nécessaire, ce qui peut devenir toxique pour la croissance des cellules Sf9 pendant la production d’AAV (observation personnelle). L’utilisation de cellules de préservation et de mise à l’échelle des cellules infectées sans titre (TIPS), ou de cellules d’insectes infectées par un baculovirus (BIIC), constitue une bonne option pour la production d’AAV dans laquelle les cellules Sf9 infectées par le baculovirus sont préparées, cryoconservées et ensuite utilisées pour l’infection de cellules Sf9 fraîches. Un autre avantage est la stabilité accrue du baculovirus (BV) dans les cellules Sf9 après cryoconservation^10,11.

Deux types de cellules TIPS sont générés pour permettre la production d’AAV: le premier par infection des cellules Sf9 par le gène BV-AAV2-GFP ou thérapeutique, et le second par infection de la cellule Sf9 par BV-AAV2-rep-cap. Les cellules TIPS sont cryoconservées dans de petites aliquotes prêtes à l’emploi. Les vecteurs AAV sont produits en culture en suspension sans sérum dans une fiole placée dans un agitateur orbital ou un bioréacteur Wave en co-cultivant des cellules TIPS qui produisent des baculovirus et des cellules Sf9 fraîches. Les cellules Sf9 sont infectées par des baculovirus porteurs du vecteur AAV2-GFP et des séquences rep-cap pour générer l’AAV. Quatre à cinq jours plus tard, lorsque les rendements en AAV sont les plus élevés, les cellules productrices sont lysées avec du détergent pour libérer les particules d’AAV. Le lysat cellulaire est ensuite clarifié par centrifugation et filtration à basse vitesse. Les particules d’AAV sont purifiées du lysat par chromatographie sur colonne AVB Sepharose. Enfin, les vecteurs AAV sont concentrés à l’aide de TFF. Le protocole décrit la production d’AAV à petite échelle, utile pour la recherche et les études précliniques. Cependant, les méthodes sont évolutives et compatibles avec la fabrication de vecteurs AAV de qualité clinique pour les applications de thérapie génique.

Protocole

Voir la figure 1 pour une illustration résumant le protocole.

1. Génération de cellules TIPS infectées par le baculovirus

1. Décongeler un flacon de cellules Sf9 et les ensemencer immédiatement dans 50 mL de milieu de culture de cellules d’insectes. Cultiver des cellules Sf9 dans un incubateur à agitateur orbital à 125 tr/min et 28 °C dans des flacons à fond rond avec un bouchon lâchement attaché pour l’échange d’air^8,9. Propager les cellules dans une fiole de 1 L contenant 200 mL de milieu pour obtenir suffisamment de cellules pour la production de cellules TIPS.
2. Ajouter 50 mL de cellules Sf9 à 2 x 10⁶ cellules/mL dans deux flacons : infecter une fiole de cellules Sf9 avec 0,5 mL de baculovirus (BV)-AAV2-GFP (ou gène thérapeutique) et l’autre fiole de cellules avec 0,5 mL de BV-AAV2-rep-cap.
   REMARQUE: Les plasmides vectoriels AAV ont été généreusement fournis par le Dr Robert M. Kotin (NIH). La production de baculovirus à partir de l’ADN bacmid (système Bac-to-Bac) a été décrite précédemment^8,9. La stabilité du baculovirus pendant le passage est un problème critique pour la production à grande échelle de rAAV. Il est préférable d’utiliser un nombre de passage inférieur de baculovirus (jusqu’au passage numéro 4). Déterminer empiriquement le volume optimal du surnageant à baculovirus en vérifiant l’efficacité de l’infection à baculovirus à l’aide de la cytométrie en flux(Figure 2)pendant la production des cellules TIPS.
3. Surveillez l’infection à baculovirus 3 à 4 jours après l’infection en colorant le baculovirus gp64 dans les cellules Sf9 infectées comme suit.
   1. Colorez 2 x 10⁵ cellules Sf9 (cellules non infectées et infectées par le baculovirus) avec 0,5 μg d’anticorps anti-baculovirus gp64 de souris (1:200) contenant un colorant fluorescent dans 100 μL de tampon bloquant pendant 30 min à température ambiante.
   2. Laver les cellules avec 1 mL de PBS pour retirer l’anticorps et remettre en suspension les cellules colorées dans 300 μL de PBS contenant 0,5% d’albumine sérique bovine.
   3. Analyser l’expression du baculovirus gp64 sur les cellules à l’aide de la cytométrie en flux (Figure 2).
      REMARQUE: Déterminer empiriquement la stratégie de contrôle pour l’acquisition et l’analyse de cytométrie en flux. Au total, 10 000 cellules vivantes uniques sont acquises. L’expression du baculovirus gp64 sur les surfaces des cellules Sf9 indique une infection à baculovirus. Après 3-4 jours, la plupart des cellules Sf9 sont infectées par le baculovirus, comme en témoigne l’expression du baculovirus gp64 (Figure 2).
4. Lorsque les cellules sont viables à 80% à 90% avec une augmentation du diamètre (Figure 3), récoltez les cellules et cryoconservez 1 x 10⁷ cellules dans 1 mL de milieu de culture d’insectes complété par 10% de sérum fœtal bovin et 10% de diméthylsulfoxyde dans un récipient à congélation lente à -80 °C. Le lendemain, transférez le tube contenant des cellules TIPS dans un congélateur à azote liquide pour un stockage à long terme.
   REMARQUE: Effectuer une culture cellulaire dans une armoire de biosécurité en suivant la technique de laboratoire aseptique standard au niveau de biosécurité 2 (BSL-2).

2. Production du vecteur AAV

1. Jour 1 : Co-culture de cellules Sf9 avec les cellules TIPS infectées par le baculovirus
   1. Cultiver et cultiver des cellules Sf9 naïves à 1 x 10⁶ cellules/mL à 28 °C dans plusieurs flacons de 2 L contenant 400 mL de milieu de culture de cellules d’insectes dans un incubateur agitateur nécessaire à la production d’AAV. Après 3-4 jours, la densité cellulaire est augmentée jusqu’à 5 x 10⁶-6 x 10⁶ cellules / mL.
      REMARQUE: Le CO₂ et l’humidité ne sont pas des facteurs importants pour la croissance des cellules Sf9.
   2. Ensemencez les cellules Sf9 soit dans des flacons agités, soit dans un bioréacteur comme suit.
      1. Production d’AAV dans des flacons dans un incubateur à agitateur orbital : Utilisez une pipette ou une pompe péristaltique pour ensemencer 400 mL de culture Sf9 à 2 x^{10 6} cellules/mL dans une fiole de 2 L de manière aseptique. Installez le secoueur orbital à 125 tr/min et 28 °C.
         NOTE Utilisez une pompe péristaltique ou une pipette standard en fonction de l’échelle de production de l’AAV.
      2. Production d’AAV dans un bioréacteur : Utilisez une pompe péristaltique pour ensemencer 1 L de culture Sf9 à 2 x 10⁶ cellules/mL dans un sac de bioréacteur de 10 L de manière aseptique. Chargez le sac sur l’unité Bioreactor pour une culture à 28 °C. Ajouter 40% d’oxygène dans le sac du bioréacteur à 0,1 psi. Installez l’unité de bioréacteur à un angle de 20° et secouez le sac à 25 tr / min.
   3. Décongeler un flacon de chaque cellule TIPS BV-AAV2-GFP (ou gène thérapeutique) et BV-AAV2-rep-capuchon. Diluer les cellules avec 20 mL de milieu de culture d’insectes et effectuer un comptage de viabilité des cellules en utilisant du bleu de trypan. Inoculez les deux cellules TIPS dans un rapport de 1:10 000 par rapport aux cellules Sf9 naïves cultivées dans une fiole agitatrice ou un bioréacteur.
      REMARQUE: La survie des cellules TIPS est réduite en raison de la cryoconservation, et le taux de récupération est d’environ 50% lorsque la viabilité cellulaire est déterminée avec la coloration bleu trypan. Effectuer une expérience pilote pour déterminer empiriquement le rapport entre les cellules TIPS et les cellules Sf9 naïves avant la production de rAAV à grande échelle.
2. Jour 2 : Suivi de la culture
   1. Récolter 1 mL de culture Sf9 de manière aseptique. Coloration avec le colorant bleu Trypan pour analyser le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie.
3. Jour 3 : Surveillance de la culture et alimentation
   1. Récoltez 1 mL de culture Sf9 et analysez le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie. Vérifiez l’état de l’infection à baculovirus après avoir coloré les cellules Sf9 comme mentionné à l’étape 1.3.
      REMARQUE: L’augmentation du diamètre cellulaire et l’effet cytopathique sont des indications d’infection à baculovirus. L’augmentation du diamètre précède une diminution de la viabilité cellulaire, et ces paramètres sont utilisés pour déterminer le temps de récolte cellulaire pendant la production d’AAV. Déterminez empiriquement le point temporel optimal.
   2. Nourrissez la culture Sf9 avec un milieu de culture d’insectes frais dans un rapport de 1:5 de manière aseptique.
4. Jour 4 : Suivi de la culture
   1. Récoltez 1 mL de culture Sf9 et analysez le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie. Débranchez l’alimentation en oxygène du sac du bioréacteur.
5. Jour 5 : Suivi de la culture et récolte
   1. Récoltez 1 mL de culture Sf9 et analysez le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie. Récoltez le milieu de culture et les cellules lorsque la viabilité des cellules Sf9 a diminué à environ 50 %(Figure 4).
   2. Faire tourner la suspension de la cellule à 2100 x g pendant 15 min à 4 °C. Recueillir le surnageant et la pastille cellulaire et les stocker à -80 °C.

3. Lyse des cellules et libération d’AAV

1. Décongeler la pastille de cellule de production DVA. Ajouter 100 mL de tampon de lyse cellulaire (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de chlorure de sodium, 0,5 % Triton-X-100) à la pastille cellulaire, mélanger vigoureusement et incuber pendant 30 min à température ambiante pour libérer les particules AAV.
2. Centrifuger à 2100 × g pendant 30 min à 4 °C et transférer le lysat de cellule dans un nouveau récipient. Mélanger le lysat cellulaire et le surnageant de culture cellulaire après décongélation.
3. Ajouter 20 U/mL nucléase et 10 mM MgCl₂ au lysat cellulaire pour digérer l’ADN et l’ARN. Incuber pendant 2-4 h à 37 °C.
4. Filtrer le lysat à travers un système de double filtration de 0,8 μm et 0,2 μmpolyéthersulfone à l’aide d’une pompe.
5. Conservez le lysat de cellules clarifié à 4 °C pendant la nuit ou purifiez immédiatement l’AAV.

4. Purification du vecteur AAV à l’aide d’un système de chromatographie sur colonne d’affinité

1. Préparer l’instrument de chromatographie en lavant séquentiellement l’échantillon et les lignes tampons avec de l’eau stérile, de l’hydroxyde de sodium 1 N, de l’eau et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) à un débit de 50 mL/min.
2. Montez la colonne AVB Sepharose (10,0 mL) dans le système de chromatographie et faites fonctionner 100 mL de PBS à un débit de 5 mL/min.
   REMARQUE: Utilisez un volume inférieur ou supérieur de colonne AVB Sepharose en fonction de l’échelle de production d’AAV et configurez le débit comme suggéré par le fabricant de la colonne ou de la résine (voir Tableau des matériaux).
3. Pour collecter les fractions de la solution de passage de colonne, du tampon de lavage et du tampon d’élution contenant des particules AAV, insérez des tubes dans les fentes du collecteur de fractions de l’instrument de chromatographie.
4. Équilibrez la colonne avec pbS à un débit de 5,0 mL/min.
5. Chargez le lysat de cellule filtré contenant des particules AAV sur la colonne à l’aide de la machine de chromatographie équipée d’une pompe à échantillon. Exécutez l’échantillon à un débit de 3,0 mL par minute.
6. Faites passer le PBS à travers la colonne AVB Sepharose à un débit de 3,0 mL/min jusqu’à ce que la courbe d’absorbance ultraviolette (UV) (280 nm) revienne à la ligne de base et devienne stable.
7. Éluez les particules d’AAV de la colonne avec un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 3,0) à un débit de 3,0 mL/min(Figure 5).
   REMARQUE: Alors que les particules AAV se dissocient de la résine et traversent le détecteur UV, un pic d’élution de protéine peut être vu sur le chromatogramme.
8. Diluer immédiatement le surnageant AAV avec un volume d’un cinquième de Tris-HCl de 500 mM (pH 8,0) pour augmenter le pH du surnageant contenant de l’AAV à environ pH 5,5 afin d’empêcher la dégradation médiée par le pH avec un tampon d’élution acide. De plus, diluez le surnageant AAV 10 fois avec du PBS pour neutraliser complètement le pH.
   REMARQUE: La valeur du pH est d’environ 5,5 après neutralisation de la solution de rAV. Après avoir neutralisé l’AAV, diluer la solution de rAV 10 fois avec du PBS (pH 7,4) afin que l’AAV soit dans un tampon physiologique.
9. Stocker 1 mL d’échantillons traversants de colonne, un tampon de lavage et 100 μL du surnageant AAV élué pour évaluer la présence d’AAV par infection des cellules cibles.
10. Nettoyez la colonne AVB Sepharose avec 100 mL d’acide citrique 100 mM (pH 2,1) et 100 mL de PBS (pH7,4) à un débit de 5,0 mL/min. Rincer la colonne avec de l’éthanol à 20 % à un débit de 5,0 mL/min et conserver à 4 °C.
11. Nettoyez les canalisations de l’instrument de chromatographie avec la position hors ligne de la colonne comme décrit à la section 4.1. Enfin, rincez le système de chromatographie avec 200 mL d’éthanol à 20 % à un débit de 50,0 mL/min et conservez-le dans de l’éthanol à 20 %.

5. Concentration et diafiltration du vecteur AAV à l’aide de la filtration à flux tangentiel (TFF)

1. Configurez le système TFF équipé d’une cartouche à membrane de polysulfone (100 kDa Molecular Weight Cut Off) pour concentrer l’AAV.
2. Équilibrer le module TFF avec 200 mL de PBS pendant 10 min.
3. Chargez l’échantillon AAV en contrôlant le débit de la pompe jusqu’à ce que l’échantillon soit réduit au volume souhaité tout en maintenant une pression transmembranaire à 2-3 psi.
4. Diafiltrer le rétentat avec 100 mL de PBS, tel qu’utilisé dans cette étude, ou définir empiriquement un tampon alternatif qui soutient la stabilité à long terme de l’AAV.
5. Après avoir concentré l’échantillon d’AAV au volume souhaité, prélever l’échantillon d’AAV, le filtrer à travers un filtre en polyéthersulfone de 0,2 μm, aliquote, puis le stocker à -80 °C.

6. Infection des échantillons d’AAV dans les cellules cibles pour évaluer la présence d’AAV dans les étapes de purification

1. Inoculer 7 x 10⁴ cellules HT1080/puits dans une plaque de 24 puits dans 500 μL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 1 % de L-glutamine, 1 % de pyruvate de sodium et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) la veille de l’infection. Cultiver les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO_2.
2. Comptez les cellules avant l’infection. Ajoutez l’échantillon en vrac AAV non purifié dilué avant l’exécution de la colonne, les échantillons de passage de colonne, le tampon de lavage et l’échantillon AAV purifié élué.
   REMARQUE: Comptez les cellules colorées en bleu trypan avec un hémocytomètre. Déterminer empiriquement le facteur de dilution et le volume (μL) des échantillons de VAA. Plus les titres AAV sont élevés, plus la dilution est nécessaire. S’assurer que les particules de baculovirus de l’échantillon en vrac non purifié avant l’écoulement de la colonne, les échantillons de passage de la colonne, le tampon de lavage sont inactivés à la chaleur à 50 °C pendant 50 min avant d’infecter les cellules cibles pour déterminer les titres infectieux de LAV.
3. Deux jours après l’infection, analysez l’expression des protéines (p. ex. GFP ou gène thérapeutique) dans les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.
4. Calculer les titres infectieux de l’AAV en utilisant le nombre de cellules au moment de l’infection, le facteur de dilution et le pourcentage de cellules GFP+ avec la formule: (Nombre total de cellules x Pourcentages de cellules GFP+ x Facteur de dilution) / Volume d’AAV en millilitres.
   REMARQUE: Par exemple, le nombre de cellules est de 1 x 10⁵, le pourcentage de cellules GFP + est de 3,4%, le facteur de dilution est de 100 et le volume d’AAV ajouté est de 2 μL. Le titre de l’AAV est de 1,7 x 10⁸ unités infectieuses (UI) / mL. La quantité totale de particules d’AAV purifiées dans 25 mL de la fraction éluée est de 4,3 x 10⁹ unités infectieuses (UI)/mL(Figure 6). Le nombre total de particules initiales d’AAV non purifiées est de 1,09 x^{10 10} UI/mL, et les particules d’AAV purifiées sont de 4,3 x^{10 9} UI/mL. Par conséquent, le pourcentage de récupération est de 39,4%. Le pourcentage de cellules GFP+ doit être compris entre 1% et 30%, ce qui correspond à une plage linéaire lorsqu’il est utilisé pour calculer le titre infectieux de l’AAV. Si des particules vectorielles AAV plus concentrées sont infectées dans les cellules cibles; il est possible que plusieurs copies des particules AAV infectent une seule cellule qui apparaîtra comme une seule copie du vecteur. Par conséquent, diluer le surnageant du vecteur AAV pour obtenir une infection vectorielle de 1% à 30% dans les cellules cibles. Si le vecteur AAV n’a pas de gène rapporteur, colorez le transgène ou le gène thérapeutique exprimé par le vecteur AAV avec un anticorps contenant un colorant fluorescent qui peut être détecté et quantifié à l’aide d’un cytomètre en flux. Tous les sérotypes AAV ne peuvent pas infecter efficacement les cellules HT1080. Par conséquent, pour effectuer le test d’infectiosité pour d’autres sérotypes AAV, utilisez différentes lignées cellulaires. Titrer les particules AAV2-GFP avant et après purification sur les cellules HT1080 et mesurer l’expression GFP par cytométrie en flux. Calculer la récupération (%) par le rapport entre le nombre de particules AAV purifiées et le nombre de particules AAV avant purification multiplié par 100.

Résultats

Ici, les résultats représentatifs du développement de processus pour la production et la purification de vecteurs AAV à l’aide du système de cellules d’insectes Sf9 sont présentés. La méthode comprend la co-culture de cellules Sf9 avec des cellules TIPS infectées par le baculovirus, l’alimentation des cellules avec un milieu de croissance, la récolte et la lyse des cellules productrices pour libérer les particules aAV, la clarification du lysat cellulaire avec un traitement nucléase, la centrifugation et la filtration, l...

Discussion

Les paramètres utilisés dans ce protocole pour le développement de processus de production, de purification et de concentration de vecteurs AAV peuvent être appliqués à la fabrication à petite et à grande échelle de vecteurs AAV pour des applications de thérapie génique. L’ensemble du processus en amont et en aval peut être effectué dans un système fermé compatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) en vigueur. Les principaux avantages du système Sf9-baculovirus sont l’évolutivité pour la production à grande ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 N Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	1.09137	Pour le nettoyage d’Akta Avant
Flacons de 2 L ThermoFisher	Scientific	431281	Flacon pour culture en suspension
50 ml Tube conique	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	Pour le prélèvement de surnageants
Plaque à 24 puits	ThermoFisher Scientific	07-200-80	Plaque de culture cellulaire adhérente
Flacons de 250 mL	ThermoFisher Scientific	238071	Flacon pour culture en suspension
Akta Avant 150 avec logiciel	Unicorn Cytiva	28976337	Système de chromatographie
AVB Sepharose Haute Performance	Cytiva	28411210	Chromatographie milieu
Baculovirus-AAV-2 GFP		Vecteur
de transfert AAV interne hors catalogueBaculovirus-AAV-2 rep-cap		Vecteur d’emballage AAV	interne hors catalogue
Nucléase	Sigma-Aldrich	E1014	Enzyme pour dégrader l’ADN et l’ARN
Tampon de blocage	Santa Cruz Biotechnologies	516214	Blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques aux cellules
Tampon de lyse cellulaire Interne		Article hors catalogue	20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L et 10 L	Cytiva	28937662	Sac pour bioréacteur
Tampon de nettoyage	Interne	Article hors catalogue	100 mM d’acide citrique (pH 2,1)  ;
Cryovial	Thomas Scientific	1222C24	Pour la cryoconservation
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Milieu de croissance pour lignées cellulaires
Tampon d’élution		Interne Article hors catalogue	50 mM Tampon de citrate de sodium (pH 3,0)
Éthanol	Sigma-Aldrich	E7073	Pour la désinfection et le stockage de la chromatographie
Unité de filtration  ;	Pall Corporation	12941	Filtre à membrane
HT1080 Lignée cellulaire	ATCC	CCL-121	Lignée cellulaire de fibroblastes
HyClone&trade ; SFX-Milieu de culture d’insectes	Cytiva	SH30278.02	Milieu de croissance cellulaire d’insecte sans sérum
Pompe péristaltique	Pall Corporation	Article hors catalogue	Pompe TFF
MaxQ 8000 incubateur à agitation orbitale  ;	ThermoFisher Scientific	Article hors catalogue	Agitateur pour culture en suspension
Microscope	Nikon	Article hors catalogue	Surveillance et comptage de cellules  ;
Anti-baculovirus de souris gp64 Anticorps PE	Santa Cruz Biotechnologies	65498 PE	Surveillance de l’infection à baculovirus dans les cellules Sf9
Réservoir d’oxygène	Praxair	Article hors catalogue	40 % Un apport en oxygène est nécessaire pour la croissance des cellules Sf9
PBS	ThermoFisher Scientific	20012027	Tampon de lavage
de coloration à l’argent	ThermoFisher Scientific	LC6100	Coloration AAV protéines de capside
Cellules Sf9	ThermoFisher Scientific	11496-015	Cellules
d’insectes Eau Steile	Interne Article	hors catalogue	Pour le nettoyage Akta Avant Centrifugeuse
table	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	surnageant de Baculovirus
	Pall Corporation	OA100C12	Cartouche TFF pour concentrer l’AAV
Tris-HCl, pH 8,0	ThermoFisher	15568025	Tampon alcalin pour neutraliser l’éluation du
bioréacteur AAV WAVE Système 20/50	Bioréacteur	Cytiva	28-9378-00