Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.
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Article de méthode
Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs prometteurs pour les applications de thérapie génique. Ici, le vecteur AAV2 est produit par co-culture de cellules Spodoptera frugiperda (Sf9) avec des cellules Sf9 infectées par le baculovirus (BV)-AAV2-GFP (ou gène thérapeutique) et BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension sans sérum. Les cellules sont cultivées dans une fiole dans un agitateur orbital ou un bioréacteur Wave. Pour libérer les particules d’AAV, les cellules productrices sont lysées dans un tampon contenant du détergent, qui est ensuite clarifié par centrifugation et filtration à basse vitesse. Les particules d’AAV sont purifiées du lysat cellulaire à l’aide de la chromatographie sur colonne AVB Sepharose, qui lie les particules d’AAV. Les particules liées sont lavées avec du PBS pour éliminer les contaminants et éluées de la résine à l’aide d’un tampon de citrate de sodium à pH 3,0. L’éluat acide est neutralisé avec un tampon alcalin Tris-HCl (pH 8,0), dilué avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et concentré par filtration à flux tangentiel (TFF). Le protocole décrit la production de vecteurs précliniques à petite échelle compatible avec la fabrication d’AAV de qualité clinique à grande échelle pour les applications de thérapie génique humaine.
Introduction
Les virus adéno-associés (AAV) sont des parvovirus humains non enveloppés contenant un ADN simple brin de 4,6 kb. Les vecteurs AAV présentent plusieurs avantages par rapport aux autres vecteurs viraux pour les applications de thérapiegénique 1,2,3,4. Les AAV sont naturellement incompétents en matière de réplication, ce qui nécessite un virus auxiliaire et des machines hôtes pour la réplication. Les AAV ne causent aucune maladie et ont une faible immunogénicité chez l’hôte infecté3,5.....
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Protocole
Voir la figure 1 pour une illustration résumant le protocole.
1. Génération de cellules TIPS infectées par le baculovirus
- Décongeler un flacon de cellules Sf9 et les ensemencer immédiatement dans 50 mL de milieu de culture de cellules d’insectes. Cultiver des cellules Sf9 dans un incubateur à agitateur orbital à 125 tr/min et 28 °C dans des flacons à fond rond avec un bouchon lâchement attaché pour l’échange d’air8,9. Propager les cellules dans une fiole de 1 L contenant 200 mL de milieu pour obtenir suffisamment de cellules pour la production....
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Résultats
Ici, les résultats représentatifs du développement de processus pour la production et la purification de vecteurs AAV à l’aide du système de cellules d’insectes Sf9 sont présentés. La méthode comprend la co-culture de cellules Sf9 avec des cellules TIPS infectées par le baculovirus, l’alimentation des cellules avec un milieu de croissance, la récolte et la lyse des cellules productrices pour libérer les particules aAV, la clarification du lysat cellulaire avec un traitement nucléase, la centrifugation et la filtration, l.......
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Discussion
Les paramètres utilisés dans ce protocole pour le développement de processus de production, de purification et de concentration de vecteurs AAV peuvent être appliqués à la fabrication à petite et à grande échelle de vecteurs AAV pour des applications de thérapie génique. L’ensemble du processus en amont et en aval peut être effectué dans un système fermé compatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) en vigueur. Les principaux avantages du système Sf9-baculovirus sont l’évolutivité pour la production à grande .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous tenons à remercier le Dr Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) de nous avoir généreusement fourni les plasmides AAV et Danielle Steele et Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) pour leur assistance technique. Ce travail est soutenu par le fonds Start-Up de la Cincinnati Children’s Research Foundation à M.N.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 N Hydroxyde de sodium | Sigma-Aldrich | 1.09137 | Pour le nettoyage d’Akta Avant |
| Flacons de 2 L ThermoFisher | Scientific | 431281 | Flacon pour culture en suspension |
| 50 ml Tube conique | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | Pour le prélèvement de surnageants |
| Plaque à 24 puits | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Plaque de culture cellulaire adhérente |
| Flacons de 250 mL | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flacon pour culture en suspension |
| Akta Avant 150 avec logiciel | Unicorn Cytiva | 28976337 | Système de chromatographie |
| AVB Sepharose Haute Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatographie milieu |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | Vecteur | ||
| de transfert AAV interne hors catalogueBaculovirus-AAV-2 rep-cap | Vecteur d’emballage AAV | interne hors catalogue | |
| Nucléase | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme pour dégrader l’ADN et l’ARN |
| Tampon de blocage | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques aux cellules |
| Tampon de lyse cellulaire Interne | Article hors catalogue | 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 % Titron X-100 | |
| Cellbag, 2 L et 10 L | Cytiva | 28937662 | Sac pour bioréacteur |
| Tampon de nettoyage | Interne | Article hors catalogue | 100 mM d’acide citrique (pH 2,1) ; |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | Pour la cryoconservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Milieu de croissance pour lignées cellulaires |
| Tampon d’élution | Interne Article hors catalogue | 50 mM Tampon de citrate de sodium (pH 3,0) | |
| Éthanol | Sigma-Aldrich | E7073 | Pour la désinfection et le stockage de la chromatographie |
| Unité de filtration ; | Pall Corporation | 12941 | Filtre à membrane |
| HT1080 Lignée cellulaire | ATCC | CCL-121 | Lignée cellulaire de fibroblastes |
| HyClone&trade ; SFX-Milieu de culture d’insectes | Cytiva | SH30278.02 | Milieu de croissance cellulaire d’insecte sans sérum |
| Pompe péristaltique | Pall Corporation | Article hors catalogue | Pompe TFF |
| MaxQ 8000 incubateur à agitation orbitale ; | ThermoFisher Scientific | Article hors catalogue | Agitateur pour culture en suspension |
| Microscope | Nikon | Article hors catalogue | Surveillance et comptage de cellules ; |
| Anti-baculovirus de souris gp64 Anticorps PE | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Surveillance de l’infection à baculovirus dans les cellules Sf9 |
| Réservoir d’oxygène | Praxair | Article hors catalogue | 40 % Un apport en oxygène est nécessaire pour la croissance des cellules Sf9 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Tampon de lavage |
| de coloration à l’argent | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Coloration AAV protéines de capside |
| Cellules Sf9 | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Cellules |
| d’insectes Eau Steile | Interne Article | hors catalogue | Pour le nettoyage Akta Avant Centrifugeuse |
| table | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | surnageant de Baculovirus |
| Pall Corporation | OA100C12 | Cartouche TFF pour concentrer l’AAV | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | ThermoFisher | 15568025 | Tampon alcalin pour neutraliser l’éluation du |
| bioréacteur AAV WAVE Système 20/50 | Bioréacteur | Cytiva | 28-9378-00 |
Références
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes....
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Réimpressions et autorisations
