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Article de méthode

Construction de membranes lipidiques modèles incorporant des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)

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DOI :

10.3791/62830

⸱

5 février 2022

 ,  , 
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole utilise le gonflement de l’agarose comme une technique puissante et généralisable pour incorporer des protéines membranaires intégrales (PIM) dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (GUV), comme décrit ici pour la reconstitution de la protéine réceptrice de la sérotonine 1A humaine (5-HT1AR), l’une des classes de récepteurs couplés à la protéine G pharmacologiquement importants.

Résumé

Des recherches in vitro robustes sur la structure et la fonction des protéines membranaires intégrales ont été un défi en raison de la complexité de la membrane plasmique et des nombreux facteurs qui influencent le comportement des protéines dans les cellules vivantes. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont un système de modèle in vitro biomimétique et hautement accordable pour étudier les interactions protéine-membrane et sonder le comportement des protéines d’une manière précise et dépendante du stimulus. Dans ce protocole, nous présentons une méthode peu coûteuse et efficace pour fabriquer des GUV avec le récepteur humain de la sérotonine 1A (5-HT1AR) intégré de manière stable dans la membrane. Nous fabriquons des GUV en utilisant une méthode de gonflement d’hydrogel modifiée; en déposant un film lipidique sur un mélange d’agarose et de 5-HT1AR puis en hydratant l’ensemble du système, des vésicules peuvent être formées avec du 5-HT1AR correctement orienté et fonctionnel incorporé dans la membrane. Ces GUV peuvent ensuite être utilisés pour examiner les interactions protéine-membrane et le comportement de localisation par microscopie. En fin de compte, ce protocole peut faire progresser notre compréhension de la fonctionnalité des protéines membranaires intégrales, fournissant un aperçu physiologique profond.

Introduction

Les membranes modèles synthétiques sont des outils puissants dans l’étude des propriétés et des fonctions fondamentales des biomembranes. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont l’une des plates-formes les plus importantes pour étudier une variété de propriétés de la membrane plasmique et peuvent être conçues pour imiter différentes conditions physiologiques1,2,3,4,5,6,7,8. Il est bien établi que la membrane plasmique et son organisation jouent un rôle clé dans une multitude de processus cellulaires, tels que la transduction du signal, l’adhésion, l’endocytose et le transport9,10,11,12,13,14,15.

Les GUV ont été fabriqués à l’aide de diverses méthodes, notamment l’hydratation douce16, le gonflement de l’hydrogel17, l’électroformation18, les techniques microfluidiques19,20,21,22, le jet23 et l’échange de solvant24,25,26. En raison des difficultés rencontrées dans la manipulation des protéines membranaires intégrales (PIM), les plateformes in vitro pour les étudier ont été limitées. Les GUV présentent une plate-forme simplifiée pour étudier les PIM dans un environnement qui imite leur environnement natif. Bien qu’il y ait eu plusieurs approches pour la reconstitution des protéines dans les GUV, l’incorporation de protéines avec l’orientation correcte et le maintien de la fonctionnalité des protéines27 posent des défis.

La reconstitution protéique la plus réussie dans les GUV nécessite la méthode d’échange de détergent; qui consiste à solubiliser les protéines de leur environnement natif par des détergents, puis à les purifier, puis à remplacer les molécules de détergent par des lipides par diverses méthodes28. Alors que les détergents servent à stabiliser la structure tertiaire des PIM lors de la purification, les micelles de détergent sont un environnement relativement peu naturel pour ces protéines, qui sont mieux stabilisées, en particulier pour les études fonctionnelles, dans les bicouches lipidiques28,29,30. De plus, l’incorporation de protéines transmembranaires fonctionnelles dans la bicouche lipidique à l’aide des techniques traditionnelles de fabrication guV a été difficile en raison de la taille, de la délicatesse de ces protéines et des étapes supplémentaires d’échange de détergent qui seraient nécessaires27,31,32,33. L’utilisation de solvant organique pour éliminer les détergents provoque l’agrégation et la dénaturation des protéines34. Une méthode améliorée médiée par un détergent a été prometteuse, mais la prudence est nécessaire pour l’étape d’élimination du détergent et une optimisation pourrait être nécessaire pour des protéines spécifiques31,35. De plus, les méthodes qui utilisent l’électroformation pourraient restreindre le choix des protéines et peuvent ne pas convenir à toutes les compositions lipidiques, en particulier les lipides chargés31,36,37. Une autre technique qui a été utilisée est la fusion induite par les peptides de grandes vésicules unilamellaires (LUV) contenant la protéine souhaitée avec des GUV, bien qu’elle se soit avérée laborieuse et puisse conduire à l’insertion de molécules étrangères - les peptides fusogéniques33,38,39. Les vésicules géantes de la membrane plasmique (GPMV), qui sont dérivées de cellules vivantes, peuvent être utilisées pour surmonter certains de ces problèmes, mais elles permettent un contrôle minimal de la composition lipidique et protéique résultante14,40,41. Par conséquent, l’intégration des PIM dans la couche bilipidique des GUV à l’aide de notre méthode de gonflement de l’agarose modifiée présente une méthode fiable pour examiner plus en détail ces protéines dans l’environnement membranaire42,43,44,45.

La signalisation et la communication cellulaires impliquent une famille de protéines connues sous le nom de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG); Les RCPG font partie de la plus grande famille de protéines et sont associés à la modulation de l’humeur, de l’appétit, de la pression artérielle, de la fonction cardiovasculaire, de la respiration et du sommeil parmi de nombreuses autres fonctions physiologiques46. Dans cette étude, nous avons utilisé le récepteur humain de la sérotonine 1A (5-HT1AR) qui est un membre prototypique de la famille gpCR. 5-HT1AR peut être trouvé dans le système nerveux central (SNC) et les vaisseaux sanguins; il influence de nombreuses fonctions telles que les fonctions cardiovasculaires, gastro-intestinales, endocriniennes, ainsi que la participation à la régulation de l’humeur47. Un obstacle important à la recherche sur les RCPG découle de leur structure amphiphile complexe, et les GUV représentent une plate-forme prometteuse pour l’étude de diverses propriétés d’intérêt, allant de la fonctionnalité des protéines, des interactions lipides-protéines et des interactions protéine-protéine. Diverses approches ont été utilisées pour étudier les interactions lipides-protéines telles que la résonance plasmonique de surface (SPR)48,49, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)50,51, le test de superposition de protéines lipidiques (PLO)51,52,53,54, la spectrométrie de masse native55, la calorimétrie de titrage isotherme (ITC)56,57 et le liposome essai de sédimentation58,59. Notre laboratoire a utilisé l’approche GUV simplifiée pour étudier l’effet des interactions lipides-protéines sur la fonctionnalité des protéines en incapsulant BODIPY-GTPγS, qui se lie à la sous-unité Giα à l’état actif du récepteur. Leur liaison désenclenche le fluorophore produisant un signal de fluorescence qui pourrait être détecté au fil du temps45. De plus, diverses études ont étudié les interactions lipides-protéines et le rôle des protéines dans la détection ou la stabilisation de la courbure de la membrane60,61, et l’utilisation d’une approche GUV réalisable pourrait être un avantage clé.

Ce protocole démontre une méthode simple pour incorporer des RCPG dans la membrane des GUV à l’aide d’un système d’hydrogel d’agarose modifié17,42. De plus, sur la base de nos travaux antérieurs, notre méthode pourrait convenir aux PIM qui peuvent supporter une exposition à court terme à 30-40 ° C. En bref, nous étalons un mince film d’agarose combiné à des fragments de membrane contenant le RCPG d’intérêt. Suite à la gélification de cette couche, nous déposons une solution lipidique sur l’agarose et permettons au solvant de s’évaporer. La réhydratation du système a ensuite été réalisée avec un tampon aqueux, entraînant la formation de GUV avec des protéines incorporées dans la bicouche lipidique.

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Protocole

1. Marquage des protéines

  1. Laissez le NHS-Rhodamine, les fragments de membrane 5-HT1A et une colonne de dessalement de spin de 7 K MWCO s’équilibrer à température ambiante.
  2. Dissoudre 1 mg de NHS-rhodamine dans 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
  3. Ajouter 5 μL de solution de bicarbonate de sodium 1 M pour augmenter le pH de la solution 5-HT1AR à pH 8.
  4. Ajouter 3,66 μL de la solution de NHS-rhodamine à 50 μL de la solution 5-HT1AR et pipeter doucement de haut en bas dans un tube de microcentrifugation.
    REMARQUE: Assurez-vous d’avoir au moins 10x l’excès molaire de NHS-rhodamine.
  5. Gardez le mélange à l’abri de la lumière et mettez le rotateur à température ambiante pendant 1 h.
  6. Lavez une colonne de spin MWCO de 7 k avec 200 μL de solution saline tampon phosphate 1x (1x PBS) trois fois pendant 1,5 min à 1,5 RCF pour chaque lavage.
  7. Ajouter la protéine marquée à une colonne et équilibrer la quantité dans un autre tube de microcentrifugation.
  8. Faites tourner la protéine marquée une fois pendant 5 minutes à 1,5 FCR.
  9. Prenez un spectre UV-vis à l’aide d’un spectrophotomètre nanodrop à 280 nm et 554 nm et calculez l’efficacité d’étiquetage en suivant le manuel du fabricant.
  10. Conserver la protéine étiquetée couverte à 5 °C jusqu’à une utilisation ultérieure. La solution est stable pendant environ une semaine après l’étiquetage.

2. GUV avec membrane incorporée 5-HT 1A

  1. Préparation des matériaux et des réactifs
    1. Laissez la protéine, les lipides et la BSA (albumine sérique bovine) s’équilibrer à la température ambiante.
    2. Pendant ce temps, nettoyez les couvercles en les plaçant dans du méthanol et en les sonifiant pendant 30 min à 40 °C. Assurez-vous que le méthanol recouvre complètement les couvercles et que le niveau d’eau dans le bain-marie est supérieur au niveau du méthanol dans le récipient.
      REMARQUE: Le méthanol est toxique et doit être manipulé dans une hotte chimique appropriée.
    3. Séchez l’excès de méthanol sur les couvercles avec un léger courant d’air. Placez la grille à couvercle recouvert d’un four à 40 °C pendant 15 min pour vous assurer que les couvercles excédentaires sèchent.
    4. Commencez le processus de nettoyage au plasma. Tout d’abord, placez les couvercles dans le nettoyeur plasma et fermez la soupape d’admission d’air pour évacuer tout l’air à l’intérieur de la chambre.
    5. Une fois que la chambre est sous vide, nettoyez les couvercles pendant 5 minutes en utilisant un réglage de puissance RF élevé et un vide presque complet, avec seulement une légère entrée d’air dans la chambre à vide. Pour assurer le bon niveau de plasma, ajustez l’ouverture de la chambre à vide de manière à ce que la couleur résultante du plasma soit d’un rose vif et stable.
      REMARQUE: Il est crucial lors de l’utilisation de l’air que le plasma reste de couleur rose vif pendant toute la durée de l’étape de traitement au plasma, car une couleur violette plus foncée indique qu’il y a une quantité incorrecte d’air dans la chambre et entraînera un traitement au plasma sous-optimal.
    6. Une fois les 5 minutes écoulées, coupez l’alimentation RF et relâchez le vide.
      REMARQUE: Lors du retrait de la chambre à plasma, veuillez vous assurer que les couvercles restent couverts.
  2. Préparation d’hydrogel
    1. Combiner 6 mg d’agarose à très basse température de fusion avec 300 μL d’eau ultrapure (c.-à-d. 2 % (p/v) d’agarose).
      REMARQUE: 2% d’agarose sera utilisé pour fabriquer des GUV sans protéines. La solution d’agarose peut être conservée à 45 °C pendant deux jours.
    2. Mélanger 9 mg d’agarose à ultra-basse température avec 300 μL d’eau ultrapure pour 3 p/v% d’agarose par préparation à l’étape 3.1. 3% d’agarose sera utilisé pour fabriquer des GUV incorporés aux protéines.
    3. Vortex la solution brièvement avant de la placer sur le bloc thermique de 90 °C pendant 10 min. Ensuite, vortexez à nouveau le tube avant de le transférer dans un bloc thermique de 45 ° C pour le maintenir sous forme fondue jusqu’à une utilisation ultérieure.
  3. Agarose et mélange de protéines
    1. Mélanger 21 μL d’agarose à 3 % avec les 7 μL de fragments de membrane 5-HT1AR. Pipettez lentement de haut en bas plusieurs fois pour assurer un mélange adéquat. Ensuite, incuber à 45 °C pendant 1 min.
  4. Hydrogel et dépôt lipidique
    1. Pour les GUV sans protéines : Faites un film mince sur des couvercles fraîchement nettoyés au plasma en utilisant 20 μL d’agarose à 2 %. Déposez rapidement un autre couvercle sur le dessus de la gouttelette d’agarose et faites glisser doucement les couvercles pour former un film mince sur les deux couvercles.
      REMARQUE: Cette étape est délicate en ce sens que le glissement de la gouttelette doit se produire alors que l’agarose est encore sous forme fondue.
    2. Pour les GUV incorporés aux protéines : Pipettez le mélange protéine/agarose de haut en bas une fois de plus, puis déposez 20 μL de l’agarose à 2 % sur un couvercle nettoyé au plasma. Suivez les instructions de coulée par glissement décrites ci-dessus.
    3. Laisser l’agarose geler à l’abri de la lumière pendant 30 min à température ambiante.
    4. Déposez les lipides goutte à goutte sur le dessus de la couche d’agarose. Utiliser un total de 10 μL de 2 mg/mL de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) avec 0,4 Mol% de 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine (DPPE) marqué avec ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (ou mélange lipidique d’intérêt) dans le chloroforme sur le film d’agarose. Déposez les gouttelettes à l’aide d’une aiguille de chromatographie en phase gazeuse et étalez une gouttelette à la fois via un flux d’air doux.
      REMARQUE: La prudence est nécessaire avec cette étape pour faire une couche relativement uniforme de lipides sur le dessus de l’hydrogel. En outre, le chloroforme est toxique et doit être manipulé dans une hotte chimique appropriée.
    5. Assemblez les chambres Sykes-Moore (S-M) en plaçant un joint torique sur le dessus du couvercle, puis en plaçant le composant supérieur de la chambre sur le joint torique. Utilisez la clé fournie par le fabricant pour assembler la chambre en vissant les composants de la chambre ensemble pour sceller la chambre et éviter toute fuite.
      REMARQUE: Le haut de la chambre doit être serré sur le joint torique, mais la prudence est nécessaire pour s’assurer que le couvercle reste intact car le couvercle peut se fissurer si le joint torique ne s’assoit pas correctement dans la chambre. Assurez-vous également que la chambre est suffisamment étanche pour que la chambre ne fuie pas lorsque la solution de gonflement est ajoutée. Si vous ne serrez pas suffisamment la chambre, vous risquez de fuir et de perdre l’échantillon.
  5. Gonflement et récolte des vésicules
    1. Hydrater l’ensemble du système en pipetant doucement 450 μL de saccharose de 200 mM dans 1x PBS et en tapotant doucement les chambres pour assurer une couverture tampon adéquate des couches hydrogel-lipidiques.
      REMARQUE: La solution de saccharose peut être remplacée par un tampon de réhydratation contenant des sondes biologiques d’intérêt.
    2. Placez les chambres à 45 °C et recouvrez la partie supérieure de la chambre d’un couvercle pour éviter l’évaporation. Laisser gonfler l’échantillon, à l’abri des débris et de la lumière pendant 1 h.
    3. Ajouter 100 μL de 1 mg/mL de BSA dans de l’eau ultrapure dans chaque puits d’une plaque de 96 puits destinée à être utilisée. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
    4. Laver trois fois avec de l’eau ultra-pure et une fois avec 200 mM de saccharose dans 1x PBS.
    5. Enfin, ajouter 200 mM de glucose dans 1x PBS jusqu’à l’ajout de la solution d’échantillon DE GUV.
      REMARQUE: BSA a été utilisé pour bloquer l’adsorption de GUV.
    6. Après avoir laissé gonfler l’hydrogel, secouez doucement et tapotez la chambre pour déloger les GUV qui peuvent rester attachés à la surface de l’hydrogel. Ensuite, pipetez soigneusement la solution de saccharose GUV.
      REMARQUE: En option pour vous assurer que toutes les vésicules sont détachées de la surface, pipettez doucement une partie de la suspension de saccharose sur la surface de l’hydrogel.
    7. Déplacez la suspension dans un tube de microcentrifugation préalablement préparé contenant 700 μL de glucose 200 mM dans 1x PBS.
      REMARQUE: Le gradient de densité entraînera la décantation des vésicules au fond du tube de centrifugeuse.
    8. Laissez les vésicules se déposer pendant une autre heure pour vous assurer que les vésicules peuvent couler au fond du tube de microcentrifugation, ce qui permet une collecte optimale.
    9. Après la décantation des GUV dans le glucose, transférer 300 μL du fond du tube de centrifugeuse (les vésicules décantées) dans la plaque de 96 puits préalablement préparée et traitée au BSA pour examiner les vésicules au microscope confocal.
      REMARQUE: Assurez-vous d’éviter le fond du tube de microcentrifugation pour minimiser la quantité de débris recueillis dans l’échantillon final.
  6. Vérifiez les échantillons au microscope.
    1. Faire briller un laser de 488 nm sur l’échantillon (ce qui nous permet de visualiser la membrane, car la bicouche a été étiquetée ATTO-488-DPPE).
    2. Faites briller un laser de 561 nm sur l’échantillon (ce qui nous permet de visualiser la protéine, puisqu’elle a été marquée avec NHS-Rhodamine).
      REMARQUE: La prudence est nécessaire lors de l’imagerie de l’échantillon car la photooxydation peut déstabiliser les vésicules. Des vésicules ont été observées le même jour.

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Figure 1 : Illustration des étapes détaillées du protocole. Créé avec BioRender.com Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

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Résultats

La concentration de protéines a été mesurée et le degré de marquage a été calculé comme le rapport molaire entre le colorant et la protéine étant de 1:1. En examinant les GUV à l’aide de la microscopie confocale, nous avons pu confirmer la formation réussie et l’intégration protéique des vésicules. Les lipides ont été marqués avec 0,4 mol% d’ATTO 488-DPPE, et la protéine a été marquée de manière covalente via la modification de l’ester NHS de rhodamine des amines primaires. La figure 2a et <...

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Discussion

Nous avons identifié deux étapes essentielles au succès du protocole global: le traitement au plasma et le dépôt de lipides. Le nettoyage au plasma des couvercles est essentiel pour assurer une couverture et une adhérence adéquates de l’hydrogel d’agarose sur le couvercle en verre. Le nettoyage au plasma accomplit deux choses: premièrement, il élimine les traces de matière organique de la surface du verre; deuxièmement, il active la surface du couvercle, ce qui permet une augmentation de la mouillabilité à mesure que l’h...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Matthew Blosser pour ses précieux échanges et conseils. Ce travail a été soutenu par l’Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) et la National Science Foundation (PHY-1915017).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC)Lipides polaires avanti, Albâtre, AL850375C-25mg
  ; TI-Eclipse microscope inverséNikon, Melville, NYEclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)Avanti Polar Lipids, Albâtre, AL850355C-25mg
13/16&Prime ; ID, 1&Prime ; O-joints en silicone ODSterling Seal & Alimentation, Neptune, IN5-003-8770
Caméra à dispositif couplé à charge multipliée par électrons Cascade II 512 bitsPhotométrie, Huntington Beach, CA²nbsp ; Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids, Albâtre, AL850457C-25mg
Lasers à semi-conducteurs 50 mW à 488 nm et filtre d’émission centré à 525 nm, et 561 nm avec filtre d’émission centré à 595 nmCoherent, Santa Clara, CA488/561-50-LS
5-HT1AR fragments de membranePerkin Elmer, Waltham, MARBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)ATTO-TEC, Siegen, AllemagneAD 488-155
Nettoyeur plasma de paillasseHarrick Plasma, Ithaca, NYPDC-32G
albumine sérique bovine (BSA)Sigma Aldrich, St. Louis, MOA9418
chloroforme (CHCl3)Millipore Sigma, Burlington, MACX1055
Cholestérol (Chol)Sigma Aldrich, St. Louis, MOC8667-5G
Corning 96-well Flat Clear BottomCorning, Corning, NY3904
Elmasonic E-Series E15H UltrasonicElma, Singen, Allemagne[n’est plus vendu sur le site Web principal]
glucoseSigma Aldrich, St. Louis, MOG7528
méthanol (MeOH)Millipore Sigma, Burlington, MAMX0485
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAND-1000
NHS-RhodamineThermo Fisher Scientific, Waltham, MA46406
solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (10x PBS)Corning, Corning, NY21-040
tête confocale CSUX à disque rotatifYokogawa, Tokyo, JaponCSU-X1
lamelles de verre standard n° 1 de 25 mmChemGlass, Vineland, NJCLS-1760
saccharoseSigma Aldrich, St. Louis, MOS7903
Chambres Sykes-MooreBellco, Vineland, NJ1943-11111
Agarose à ultra-basse température de fusionSigma Aldrich, St. Louis, MOA5030
VWR Bloc chauffant analogiqueVWR International, Radnor, PA[n’est plus vendu sur le site principal]
VWR Tube RotatorVWR International, Radnor, PA10136-084
Colonnes de dessalage Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mLThermo Fisher Scientific, Waltham, MA89882

Références

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