Article de méthode

Méthode sandwich à membrane à deux couches pour la collection de salive Laodelphax striatellus

DOI :

10.3791/62831

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27 août 2021

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

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Le présent protocole décrit une méthode permettant de recueillir suffisamment de salive auprès d’insectes perçants-suceurs à l’aide d’un milieu artificiel. Il s’agit d’une méthode pratique pour collecter la salive des insectes et étudier la fonction salivaire sur le comportement alimentaire des insectes et la transmission du virus à transmission vectorielle.

Résumé

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Le virus de la bande de riz (VRS), qui cause une perte économique importante de l’agriculture en Asie de l’Est, dépend entièrement des insectes vecteurs pour sa transmission efficace entre le riz hôte. Laodelphax striatellus (petite sauterelle brune, SBPH) est le principal insecte vecteur qui transmet horizontalement le VRS tout en aspirant la sève du phloème. La salive joue un rôle important dans le comportement alimentaire des insectes. Une méthode pratique qui sera utile pour la recherche sur la salive des insectes avec un comportement alimentaire perçant-suceur est décrite ici. Dans cette méthode, les insectes ont été autorisés à se nourrir d’un régime artificiel pris en sandwich entre deux couches de film de paraffine étirées. Le régime alimentaire contenant la salive a été recueilli chaque jour, filtré et concentré pour une analyse plus approfondie. Enfin, la qualité de la salive recueillie a été examinée par coloration protéique et immunobuvardage. Cette méthode a été illustrée par la détection de la présence du VRS et d’une protéine semblable à la mucine dans la salive de l’HBS. Ces méthodes d’alimentation artificielle et de collecte de la salive jetteront les bases de recherches supplémentaires sur les facteurs de la salive des insectes liés au comportement alimentaire et à la transmission du virus.

Introduction

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Le virus de la bande de riz (VRS), un virus à ARN à brin négatif du genre Tenuivirus,provoque des maladies graves dans la production de riz en Asie del’Est1,2,3. La transmission du VRS des plants de riz infectés aux plants sains dépend des insectes vecteurs, principalement Laodelphax striatellus, qui transmet le VRS de manière persistante. SBPH acquiert le virus après s’être nourri de plantes infectées par le VRS. Une fois à l’intérieur de l’insecte, le VRS infecte la cellule épithéliale de l’intestin moyen un jour après l’alimentation, puis traverse la barr....

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Protocole

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1. Maintenance sbph

  1. Élever les individus SBPH virulifères et sans VRS dans un incubateur en verre (65 x 200 mm) avec 5-6 plants de riz(Oryza sativa cv. Nipponbare) par chambre en verre dans le laboratoire. Cultivez les plants de riz à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité.
    NOTE: Les individus SBPH virulifères et exempts de VRS ont été initialement capturés dans la province du Jiangsu, en Chine.
  2. Détecter le VRS dans l’HBSP par un dosage immuno-enzymatique (dot-ELISA) avec un anticorps polyclonal spécifique du VRS de lapin (voir tableau des matériaux)élevé contre les ribonucléoprotéines (RNP) du....

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Résultats

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Schémas de l’installation d’alimentation artificielle et de la collecte de salive
La figure 1A représente le cylindre de verre (15 cm x 2,5 cm) utilisé comme chambre d’alimentation pour recueillir la salive. Tout d’abord, les larves de SBPH ont été affamées pendant plusieurs heures pour améliorer l’efficacité de la collecte, puis immobilisées en refroidissant pendant 5 minutes. Après le transfert des insectes dans le cylindre de verre, les deux extrémités ouvertes de la c.......

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Discussion

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L’élevage réussi d’insectes sur des régimes artificiels a été signalé pour la première fois en 1962 lorsque Mittler et Dadd ont décrit la technique de la membrane de paraffine pour tenir un régime artificiel29,30. Et cette méthode a été explorée dans de nombreux aspects de la biologie et du comportement des insectes, par exemple, le supplément nutritif, l’alimentation en ARNd et l’acquisition de virus. Sur la base des exigences de l’analyse de la salive, 5% de sa.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le National Key Research and Development Program of China (n° 2019YFC1200503), par la National Science Foundation of China (n° 32072385) et par la Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre centrifuge 10-KDMerck MilliporeR5PA83496Pour la concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet)macGENEMP008Tampon de transfert pour western blot
10x TBSTbuffer CoolaberSL1328-500mL× ; 10Tampon de lavage pour le western blot
Azure c600 biosystemsAzure BiosystemsAzure c600Système d’imagerie pour le western blot et la coloration à l’argent
Prestained Échelle de protéinesGenStarM221-01Marqueur protéique pour le western blot
ECL  ; réactifs de détection par transfert westernGE HealthcareRPN2209détection par transfert western
Enhanced HRP-DAB Chromogenic KitTIANGENRéaction chromogène
Anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifortSigma401393-2MLAnticorps secondaire polyclonal pour le western blot
Immobilon(R)-P Membrane de difluorure de polyvinylidèneMerck MilliporeIPVH00010Membrane de transfert pour western blot
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125Pour la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891Pour la PCR transcriptionnelle inverse (RT-PCR)
Filtre Millex-GP, 0.22 µ ; mMerck MilliporeSLGP033RBPour la filtration
Mini-PROTEAB TGX GelsBio-Rad4561043Pour SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-WDétection de la concentration en
protéines Membrane en nylonPALLT42754Membrane pour dot-ELISA
Parafilm M MembraneSigmaP7793-1EARéalisation d’un régime artificiel sandwichs
Anticorps polyclonal anti-LssgMP de lapin contre les peptides LssgMPGenstriptRabbit Anticorps polyclonal primaire anti-LssgMP pour western blot
Anticorps polyclonal anti-VRS de lapinGenstriptRabbit Anticorps polyclonal primaire anti-VRS pour le western blot et dot-ELISA
RNAprep pure Micro KitTIANGENDP420pour l’extraction d’ARN
Color #PA110

Références

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  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Vir....

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Mots-clés

Alimentation artificielleVirus de la striure du rizInsectes piqueurs suceursColoration des prot inesWestern blotSDS PAGESpectrophotom tre UV

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