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Article de méthode

Méthode sandwich à membrane à deux couches pour la collection de salive Laodelphax striatellus

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DOI :

10.3791/62831

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27 août 2021

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode permettant de recueillir suffisamment de salive auprès d’insectes perçants-suceurs à l’aide d’un milieu artificiel. Il s’agit d’une méthode pratique pour collecter la salive des insectes et étudier la fonction salivaire sur le comportement alimentaire des insectes et la transmission du virus à transmission vectorielle.

Résumé

Le virus de la bande de riz (VRS), qui cause une perte économique importante de l’agriculture en Asie de l’Est, dépend entièrement des insectes vecteurs pour sa transmission efficace entre le riz hôte. Laodelphax striatellus (petite sauterelle brune, SBPH) est le principal insecte vecteur qui transmet horizontalement le VRS tout en aspirant la sève du phloème. La salive joue un rôle important dans le comportement alimentaire des insectes. Une méthode pratique qui sera utile pour la recherche sur la salive des insectes avec un comportement alimentaire perçant-suceur est décrite ici. Dans cette méthode, les insectes ont été autorisés à se nourrir d’un régime artificiel pris en sandwich entre deux couches de film de paraffine étirées. Le régime alimentaire contenant la salive a été recueilli chaque jour, filtré et concentré pour une analyse plus approfondie. Enfin, la qualité de la salive recueillie a été examinée par coloration protéique et immunobuvardage. Cette méthode a été illustrée par la détection de la présence du VRS et d’une protéine semblable à la mucine dans la salive de l’HBS. Ces méthodes d’alimentation artificielle et de collecte de la salive jetteront les bases de recherches supplémentaires sur les facteurs de la salive des insectes liés au comportement alimentaire et à la transmission du virus.

Introduction

Le virus de la bande de riz (VRS), un virus à ARN à brin négatif du genre Tenuivirus,provoque des maladies graves dans la production de riz en Asie del’Est1,2,3. La transmission du VRS des plants de riz infectés aux plants sains dépend des insectes vecteurs, principalement Laodelphax striatellus, qui transmet le VRS de manière persistante. SBPH acquiert le virus après s’être nourri de plantes infectées par le VRS. Une fois à l’intérieur de l’insecte, le VRS infecte la cellule épithéliale de l’intestin moyen un jour après l’alimentation, puis traverse la barrière de l’intestin moyen pour pénétrer dans l’hémolymphe. Par la suite, le VRS se propage dans différents tissus via l’hémolymphe, puis se propage. Après une période de latence d’environ 10 à 14 jours après l’acquisition, le virus à l’intérieur de la glande salivaire peut être transmis aux plantes hôtes saines via la salive sécrétée tandis que SBPH aspire la sève du phloème4,5,6,7,8,9,10 . Un processus d’alimentation efficace et divers facteurs dans la salive sont essentiels pour la propagation du VRS de l’insecte à la plante hôte.

On pense que la salive d’insecte sécrétée par les glandes salivaires sert de médiateur aux insectes, aux virus et aux plantes hôtes. Les insectes hémiptères produisent généralement deux types de salive: la salive gélifiante et la saliveaqueuse 11,12,13. La salive gélifiante est principalement sécrétée dans l’apoplasme pour soutenir le mouvement du stylet entre les cellules hôtes et est également liée au dépassement de la résistance des plantes et des réponses immunitaires14,15,16,17. Au stade de l’alimentation, les insectes sécrètent par intermittence de la salive gélifiante qui s’oxyde immédiatement pour former une bride de surface. Ensuite, des gaines simples ou ramifiées enveloppent le stylet pour réserver un canal tubulaire18,19,20. La bride de surface sur l’épiderme est supposée faciliter la pénétration du stylet en servant de point d’ancrage, tandis que les gaines autour du stylet peuvent assurer la stabilité mécanique et la lubrification16,21,22,23. Nlshp a été identifié comme une protéine essentielle pour la formation de la gaine salivaire et l’alimentation réussie de la sauterelle brune (Nilaparvata lugens, BPH). L’inhibition de l’expression de la protéine de gaine structurelle (SHP) sécrétée par le puceron Acyrthosiphon pisum a réduit sa reproduction en perturbant l’alimentation à partir des tubes du tamis hôte24. De plus, chez certaines espèces d’insectes, les facteurs de salive en gel sont censés déclencher les réponses immunitaires des plantes en formant des modèles moléculaires dits associés aux herbivores (HAMPs). Chez N. lugens,NlMLP, une protéine semblable à la mucine liée à la formation de gaines, induit des défenses végétales contre l’alimentation, y compris la mort cellulaire, l’expression de gènes liés à la défense et le dépôt de callose 25,26. En outre, il a été prouvé que certains facteurs de salive en gel chez les pucerons déclenchent des réponses de défense des plantes via des interactions gène-à-gène similaires aux modèles moléculaires associés aux agents pathogènes12,15,27.

Pour étudier les facteurs salivaires essentiels à l’alimentation des insectes et / ou à la transmission des agents pathogènes, il est nécessaire d’analyser la salive sécrétée. Ici, les méthodes d’alimentation artificielle et de collecte pour obtenir des quantités suffisantes de salive sont décrites pour une analyse plus approfondie. En utilisant un milieu ne contenant qu’un seul élément nutritionnel, de nombreuses protéines salivaires ont été collectées et analysées par coloration à l’argent et western blotting. Cette méthode sera utile dans d’autres recherches sur les facteurs de la salive qui sont essentiels à la transmission du VRS par SBPH.

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Protocole

1. Maintenance sbph

  1. Élever les individus SBPH virulifères et sans VRS dans un incubateur en verre (65 x 200 mm) avec 5-6 plants de riz(Oryza sativa cv. Nipponbare) par chambre en verre dans le laboratoire. Cultivez les plants de riz à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité.
    NOTE: Les individus SBPH virulifères et exempts de VRS ont été initialement capturés dans la province du Jiangsu, en Chine.
  2. Détecter le VRS dans l’HBSP par un dosage immuno-enzymatique (dot-ELISA) avec un anticorps polyclonal spécifique du VRS de lapin (voir tableau des matériaux)élevé contre les ribonucléoprotéines (RNP) du VRS.
    REMARQUE: Pour assurer une efficacité élevée de l’infection de la progéniture, les femelles virulifères ont été maintenues séparément et 15% de leur progéniture ont été testées au hasard pour l’infection par le VRS. Les détails de dot-ELISA sont décrits aux étapes 1.3-1.7.
  3. Homogénéiser un seul SBPH dans 20 μL de tampon de revêtement (0,05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9,5). Repérez 3 μL de chacun sur une membrane en nylon (voir Tableau des matériaux),puis séchez la membrane à température ambiante (RT).
  4. Incuber la membrane avec 15 mL de tampon bloquant (PBS + 3% de lait écrémé) pendant 30 min à température ambiante.
  5. Incuber la membrane avec des anticorps de lapin primaires dilués contre le VRS (1:10000) dans 15 mL de PBS pendant 1 h à RT et laver la membrane trois fois avec du PBS pendant 5 min d’incubation à chaque fois.
  6. Incuber la membrane avec 1,5 μL d’anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (voir tableau des matériaux)dans 15 mL de PBS et laver trois fois avec du PBS pendant 5 minutes d’incubation à chaque fois.
  7. Développer les immunoblots avec Enhanced HRP-DAB Chromogenic Kit (voir Tableau des matériaux)selon les protocoles fournis par le fabricant.

2. Préparation de la chambre d’alimentation et du régime artificiel

  1. Peser 2 g de poudre de saccharose et la dissoudre dans 40 mL de ddH2O pour préparer une solution aqueuse de saccharose à 5% comme régime artificiel.
  2. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm (voir tableau des matériaux)pour éliminer la contamination bactérienne et les impuretés.
  3. Affamer 200 larves de 3èmeà5 ème SBPH pendant 3-5 h avant de les introduire dans la chambre.
    NOTE: 200 SBPH sont préparés pour une chambre; plus de SBPH devrait être préparé pour plusieurs chambres.
  4. Préparer les cylindres de verre comme des chambres d’alimentation (Figure 1A). Couvrir une extrémité ouverte de la chambre avec une membrane de paraffine (voir tableau des matériaux)avant d’introduire les insectes expérimentaux.
    REMARQUE: Chaque cylindre mesure 15,0 cm de long et 2,5 cm de diamètre. Ces cylindres en verre sont fabriqués sur mesure selon les exigences expérimentales.
  5. Transférer les insectes dans un cylindre en verre.
  6. Couvrir l’autre extrémité de la chambre avec une membrane de paraffine étirée (plus précisément, Parafilm M). Ensuite, ajoutez-y 200 μL de régime artificiel. Enfin, recouvrez le liquide d’une autre couche de membrane de paraffine étirée.
    REMARQUE: La membrane de paraffine est étirée pour environ doubler sa surface d’origine.
  7. Couvrez la chambre avec du papier d’aluminium, mais laissez l’extrémité avec l’appareil de régime artificiel exposé à la lumière.

3. Collecte de salive SBPH

  1. Recueillir le régime artificiel de SBPH sans VRS et virulifère séparément à la fin de la période de 24 heures.
  2. Refroidir le cylindre à 4 °C pour immobiliser les insectes.
  3. Découvrez le film extérieur et recueillez le liquide alimentaire artificiel à l’aide d’une pipette stérile dans des tubes stériles de 1,5 mL. Conserver la salive recueillie à -80 °C jusqu’à l’analyse.
    REMARQUE: La salive recueillie peut être conservée à -80 ° C pendant 1 an.
  4. Rincez la membrane interne avec 50 μL de régime artificiel frais trois fois en pipetant doucement, et recueillez le régime de lavage artificiel comme décrit à l’étape 3.3. Placez le nouveau régime artificiel sur la membrane interne et gardez une membrane de paraffine fraîchement étirée sur le dessus.
  5. Répétez les étapes 3.2 et 3.3 pendant 5 jours à 2 semaines.
    REMARQUE: Comptez le taux de survie de l’alimentation artificielle SBPH et assurez-vous d’un supplément suffisant de SBPH frais en fonction du taux de survie.
  6. Filtrer les échantillons prélevés à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm pour éliminer les microbes et autres contaminants.

4. Concentration de la salive recueillie

  1. Transférer les échantillons de salive prélevés dans un filtre centrifuge de 0,5 mL de 10 kD (voir tableau des matériaux)et filer à 5 500 x g à 4 °C pendant 20 min. Recueillir le surnageant et porter le volume final à 100 μL.
  2. Mesurer la concentration de la salive recueillie à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis approprié en suivant les étapes 4.3-4.6.
  3. Allumez le spectrophotomètre et lavez les piédestaux trois fois avec ddH2O.
  4. Sélectionnez les options suivantes à l’écran dans le bon ordre : Protéines | Protéine A280 | Sélectionnez Type | 1 Abs = 1 mg/mL. Ensuite, cochez la case Correction de ligne de base 340 nm.
  5. Chargez 2 μL de solution aqueuse de saccharose à 5% à blanc, appuyez sur Blank en bas de l’écran.
  6. Après avoir établi des normes, chargez 2 μL de la salive collectée pour la mesure. Lisez et enregistrez la concentration en protéines.
    NOTE: 1 mg de protéines salivaires ont finalement été collectés au total au moins.

5. Coloration à l’argent des protéines salivaires

  1. Extraire les protéines des échantillons de salive d’insectes à l’aide d’un tampon de charge de l’échantillon (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% de glycérol, 2% de FDS, 0,1% de bleu de bromophénol et 1% de β-mercaptoéthanol). Ensuite, fractionnez-le de 10% SDS-PAGE (voir Tableau des matériaux). Charger la solution sucroseaqueuse à 5% traitée de la même manière qu’un témoin négatif.
  2. Chargez une aliquote de 20 μL de l’échantillon sur un gel SDS-PAGE à côté d’un marqueur précoloré. Faites fonctionner le gel pendant 15 min à 90 Volt, puis 50 min à 140 Volt.
  3. Fixer le gel dans de l’éthanol à 30 % (vol/vol), de l’acide acétique à 10 % (vol/vol) pendant au moins 30 min après l’électrophorèse.
  4. Rincez le gel deux fois avec de l’éthanol à 20% (vol/vol) et arrosez séparément pendant 10 min à chaque fois.
  5. Sensibilisez le gel dans 0,8 mM de thiosulfate de sodium pendant 1 min, puis rincez deux fois à l’eau pendant 1 min à chaque fois.
  6. Immerger le gel dans du nitrate d’argent de 12 mM pendant au moins 1 h, puis le tremper dans de l’eau désionisée pendant 10 s avant de le transférer dans la solution de développement.
  7. Lorsque le fond du gel devient sombre, immergez le gel dans une solution d’arrêt (acide acétique à 5%) pendant au moins 30 minutes pour arrêter la réaction.
  8. Lavez le gel deux fois avec de l’eau pendant 30 minutes à chaque fois. Développer l’image avec le système de détection (voir tableau des matériaux).

6. Détection des protéines par transfert western

  1. Détecter la protéine semblable à la mucine salivaire du SBPH (LssgMP) et du VRS par transferts occidentaux à l’aide d’anticorps spécifiques, respectivement.
  2. Traiter les échantillons de salive d’insectes après l’étape 5.1.
  3. Charger une aliquote de 20 μL de l’échantillon sur un gel SDS-PAGE à 10 % à côté d’un marqueur précoloré et d’un échantillon de salive non infectée par le VRS de 20 μL comme témoin négatif. Faites fonctionner le gel pendant 15 min à 90 Volt, puis pendant 50 min à 140 Volt.
  4. Mélanger 100 mL de tampon de transfert de protéines 10x (humide) (voir Tableau des matériaux)avec 900 mL de ddH2O dans une solution de travail (1x), puis transférer les protéines dans une membrane de difluorure de polyvinylidène à l’aide d’un tampon de transfert de protéines (1x).
  5. Bloquer la membrane dans du lait écrémé à 5 % avec une solution saline tamponnée Tris de 0,01 M avec une solution saline tween 20 à 0,05 % (TBST) à température ambiante (RT) pendant 1 h.
    REMARQUE: Dans ce protocole, mélanger 100 mL de 10x TBST (voir Tableau des matériaux)avec 900 mL de ddH2O dans la solution de travail.
  6. Incuber la membrane avec des anticorps primaires de lapin contre le VRS ou le LssgMP (tous deux 1:10000) dilués dans tbST à RT pendant au moins 2 h.
    REMARQUE: La production d’anticorps primaires contre le VRS a été mentionnée ci-dessus. Une société de biotechnologie a produit l’anticorps polyclonal anti-LssgMP de lapin contre le peptide LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Lavez la membrane trois fois avec TBST pendant 10 minutes d’incubation à chaque fois.
  8. Incuber la membrane avec des anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort dilués dans 1:10000 TBST.
  9. Développez les immunoblots avec le système amélioré de détection de transfert Western Blotting par chimiluminescence.

7. Détection du modèle d’expression LssgMP dans SBPH

  1. Immobiliser les insectes à 4 °C pendant 5 min.
  2. Lavez les insectes avec de l’éthanol à 75 % et du ddH2O un par un, puis disséquez les insectes dans du TBS pré-réfrigéré (solution saline tamponnée Tris de 0,01 M).
  3. Disséquer les insectes de l’abdomen tout en coupant les pattes antérieures de SBPH à l’articulation coxa-trochanter par pince; laver l’intestin moyen et les glandes salivaires deux fois dans le SCT pour éliminer toute contamination de l’hémolymphe.
  4. Mettez cinq tissus dans un tube sans RNase de 1,5 mL pour extraire l’ARN. Considérez chaque tube comme un échantillon.
  5. Effectuer l’extraction de l’ARN selon les protocoles du fabricant et la PCR transcriptionnelle inverse (RT-PCR) (voir Tableau des matériaux).
  6. Effectuer une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) pour étudier les niveaux relatifs d’expression de transcription de LssgMP dans des extraits de tout le corps ou de divers tissus de L. striatellus.
    REMARQUE: Les paires d’amorces utilisées pour l’amplification des gènes étaient LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, SYBR Green-based qPCR a été réalisée selon le protocole du fabricant. Le niveau de transcription du facteur d’allongement de la traduction de L. striatellus 2 (ef2) a été quantifié avec la paire d’amorces ef2-q-F /ef2-q-R pour la normalisation des modèles d’ADNc. Et les séquences d’amorce sont jointesci-dessous: LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

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Résultats

Schémas de l’installation d’alimentation artificielle et de la collecte de salive
La figure 1A représente le cylindre de verre (15 cm x 2,5 cm) utilisé comme chambre d’alimentation pour recueillir la salive. Tout d’abord, les larves de SBPH ont été affamées pendant plusieurs heures pour améliorer l’efficacité de la collecte, puis immobilisées en refroidissant pendant 5 minutes. Après le transfert des insectes dans le cylindre de verre, les deux extrémités ouvertes de la c...

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Discussion

L’élevage réussi d’insectes sur des régimes artificiels a été signalé pour la première fois en 1962 lorsque Mittler et Dadd ont décrit la technique de la membrane de paraffine pour tenir un régime artificiel29,30. Et cette méthode a été explorée dans de nombreux aspects de la biologie et du comportement des insectes, par exemple, le supplément nutritif, l’alimentation en ARNd et l’acquisition de virus. Sur la base des exigences de l’analyse de la salive, 5% de sa...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Key Research and Development Program of China (n° 2019YFC1200503), par la National Science Foundation of China (n° 32072385) et par la Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre centrifuge 10-KDMerck MilliporeR5PA83496Pour la concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet)macGENEMP008Tampon de transfert pour western blot
10x TBSTbuffer CoolaberSL1328-500mL× ; 10Tampon de lavage pour le western blot
Azure c600 biosystemsAzure BiosystemsAzure c600Système d’imagerie pour le western blot et la coloration à l’argent
Prestained Échelle de protéinesGenStarM221-01Marqueur protéique pour le western blot
ECL  ; réactifs de détection par transfert westernGE HealthcareRPN2209détection par transfert western
Enhanced HRP-DAB Chromogenic KitTIANGENRéaction chromogène
Anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifortSigma401393-2MLAnticorps secondaire polyclonal pour le western blot
Immobilon(R)-P Membrane de difluorure de polyvinylidèneMerck MilliporeIPVH00010Membrane de transfert pour western blot
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125Pour la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891Pour la PCR transcriptionnelle inverse (RT-PCR)
Filtre Millex-GP, 0.22 µ ; mMerck MilliporeSLGP033RBPour la filtration
Mini-PROTEAB TGX GelsBio-Rad4561043Pour SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-WDétection de la concentration en
protéines Membrane en nylonPALLT42754Membrane pour dot-ELISA
Parafilm M MembraneSigmaP7793-1EARéalisation d’un régime artificiel sandwichs
Anticorps polyclonal anti-LssgMP de lapin contre les peptides LssgMPGenstriptRabbit Anticorps polyclonal primaire anti-LssgMP pour western blot
Anticorps polyclonal anti-VRS de lapinGenstriptRabbit Anticorps polyclonal primaire anti-VRS pour le western blot et dot-ELISA
RNAprep pure Micro KitTIANGENDP420pour l’extraction d’ARN
Color #PA110

Références

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