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Article de méthode

Dosage des hydrolases de nucléosides triphosphates chez Toxoplasm gondii et Neospora caninum pour le criblage à haut débit à l’aide d’un bras robotisé

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DOI :

10.3791/62874

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22 juillet 2022

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1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les infections à Toxoplasma gondii et Neospora caninum sont présentes chez les humains et les animaux et entraînent de graves problèmes de santé. Les deux parasites partagent des hydrolases nucléosidiques triphosphates similaires et jouent un rôle important dans la propagation et la survie. Nous avons établi un test de haute qualité des enzymes nécessitant l’utilisation d’un bras robotisé.

Résumé

Les parasites protozoaires infectent les humains et de nombreux animaux à sang chaud. Toxoplasma gondii, un parasite protozoaire majeur, est couramment trouvé chez les patients séropositifs, les receveurs de greffes d’organes et les femmes enceintes, entraînant un grave problème de santé, la toxoplasmose. Un autre protozoaire majeur , Neospora caninum, qui présente de nombreuses similitudes avec Toxoplasma gondii, provoque des maladies graves chez les animaux, tout comme l’encéphalomyélite et la myosite-polyradiculite chez les chiens et les vaches, entraînant des veaux mort-nés. Tous ces derniers présentaient des nucléosides triphosphate hydrolases (NTPase) similaires. Neospora caninum a une NcNTPase, tandis que Toxoplasma gondii a une TgNTPase-I. On pense que les enzymes jouent un rôle crucial dans la propagation et la survie. Afin d’établir des composés et/ou des extraits prévenant l’infection par des protozoaires, nous avons ciblé ces enzymes pour la découverte de médicaments. L’étape suivante a consisté à établir un nouveau test très sensible et très précis en combinant un test enzymatique biochimique conventionnel avec un test fluorescent pour déterminer la teneur en ADP. Nous avons également validé que le nouveau test répond aux critères permettant d’effectuer un criblage à haut débit (HTS) dans les deux enzymes protozoaires. Nous avons effectué une HTS, identifié 19 composés et six extraits de deux banques de composés synthétiques et d’une bibliothèque d’extraits dérivés de bactéries marines, respectivement. Dans cette étude, une explication détaillée a été introduite sur la façon de réaliser les SHD, y compris des informations sur la préparation des réactifs, des dispositifs, du bras du robot, etc.

Introduction

La robotique s’est imposée comme un outil sophistiqué et puissant permettant de réaliser des percées significatives dans divers domaines au-delà de l’industrie et de l’ingénierie de fabrication, tels que la biochimie, la biologie moléculaire et la recherche clinique, et notamment HTS 1,2,3. Toxoplasma gondii est un parasite majeur et un eucaryote parasite unicellulaire4 qui cause de graves problèmes de santé chez les humains5 et de nombreux animaux homéothermes4, entraînant des infections conduisant à la toxoplasmose, une maladie particulièrement grave chez les patients atteints du sida6, les receveurs de greffes d’organes7 et les femmes enceintes8. Neospora caninum appartenant à l’embranchement Apicomplexa9 infecte principalement les chiens et les vaches6, ce qui entraîne une encéphalomyélite et une myosite-polyradiculite chez les chiens10,11 et un avortement chez les vaches12,13. De plus, Neospora caninum présente des similitudes morphologiques et phylogénétiques étroites avec Toxoplasma gondii 9,14. De plus, ils ont une nucléoside triphosphate hydrolase (NTPase ; EC3.6.1.15)14. Les enzymes sont très différentes de l’ecto-ATPase14 conventionnelle. Ces parasites génèrent une quantité considérable de protéines NTPase, soit 2 à 8 % de la protéine totale et jouent un rôle important en tant qu’enzymes dormantes au stade15 de tachyzoïte. Il convient de noter que dans les granules sécrétoires denses, ceux-ci sont condensés16 et sécrétés dans la vacuole parasitophore16. En tant que caractère enzymatique biochimique, la NTPase est activée par le dithiothréitol17. Il est prédit que les inducteurs tels que le composé dithiol, une enzyme non identifiée telle que la dithiol-disulfure oxydoréductase et une autre présentent la même nature. Ils n’ont pas encore été identifiés chez les parasites. Cependant, l’enzyme joue un rôle important dans la libération de tachyzoïte à partir des cellules hôtes infectées17.

Toxoplasma gondii possède deux isoformes de la NTPase18 : l’enzyme de type I TgNTPase-I et l’enzyme de type II TgNTPase-II18. Le premier utilise préférentiellement des nucléosides triphosphates comme substrat18. Ce dernier hydrolyse à la fois les nucléosides triphosphate et diphosphate18. L’homologie est de 97 % dans les niveauxd’acides aminés 18. Neospora caninum a également un orthologue de TgNTPase-I nommé NcNTPase19. L’homologie est de 73 % dans les niveaux d’acides aminés19. Le professeur Asai et le professeur Harada ont généré des recombinants de la NTPase à l’aide d’E. coli. et ont modifié les mutants constitutivement actifs de ceux-ci, comme indiqué précédemment20. Ils ont gentiment offert les deux mutants actifs. Les deux enzymes peuvent convertir l’ATP en ADP in vitro20. Très récemment, nous avons mesuré l’activité de la NTPase en utilisant le contenu en ADP hydrolysé par les enzymes. Enfin, nous avons réussi à établir le test de haute qualité grâce au processus de détermination de la teneur en ADP avec une combinaison de fluorescence et de réaction enzymatique, comme indiqué précédemment21,22. Nous avons également effectué des contrôles à haut débit (HTS)22.

Cette étude présente les procédures détaillées d’un nouveau test de haute précision et de plage dynamique21 et une explication détaillée de la façon de préparer les réactifs pour mesurer l’activité enzymatique et développer l’intensité fluorescente à l’aide d’un bras robotique pour HTS.

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Protocole

1. Expression et purification de la TgNTPase-I et de la NcNTPase recombinantes

  1. Préparez le plasmide d’expression et introduisez-le dans E . coli. souche BL21.
    REMARQUE : Des renseignements détaillés sur les concepts et les procédures figurent dans un rapport précédent14. Dans cette étude, les mutants constitutivement actifs TgNTPase-I et NcNTPase ont été gracieusement offerts par le professeur Asai et le professeur Harada.

2. Préparation et placement de la solution réactionnelle biofluorescente sur la plaque

  1. Préparer 2 solutions réactionnelles biofluorescentes comme décrit au tableau 1 pour 2 mL de mélange maître pour un essai à 400 puits en format à 384 puits.
  2. Préparer des solutions mères à l’aide d’eau distillée pour chaque concentration indiquée, à l’exception de la résazurine et du N-éthylmaléimide. Dissoudre les deux réactifs restants avec du DMSO à la concentration appropriée. Ensuite, conservez les réactifs à -30 °C jusqu’au moment de réaliser les expériences.
  3. Ajouter 15 μL de solution réactionnelle biofluorescente 2x dans chacun des 368 puits (format 384 puits).
    REMARQUE : La première plaque sert de réservoir pour avoir suffisamment de réactif pour mener des expériences deux fois.

3. Placez les composés ou extraits d’essai au fond de chaque puits de la plaque d’essai.

  1. Déposer 0,5 μL de chaque composé sur le fond de la plaque à l’aide d’un bras robotique provenant de la plaque mère de la bibliothèque, y compris les composés d’essai.
  2. Ajouter 0,5 μL de DMSO aux témoins négatifs et positifs.

4. Préparation du mélange de réaction enzymatique et début de la réaction

  1. Préparez la solution de réaction enzymatique comme indiqué dans le tableau 2.
  2. Ajouter la NTPase (concentration finale de 0,0002 μg/mL) à 50 mL du mélange de réaction enzymatique, mélanger rapidement et transférer dans un réservoir en plastique.
  3. Procéder à l’injection simultanée de 4,5 μL dans chaque puits, à l’exception de la ligne de contrôle négative à l’aide du bras du robot.
  4. Ajouter la même quantité du mélange de réaction enzymatique avec du PBS au lieu de l’enzyme précédée de l’injection simultanée.
  5. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 10 min.

5. Effectuer une mesure en temps réel des activités enzymatiques à l’aide d’un lecteur de microplaques

  1. Après 10 min d’incubation, ajoutez simultanément 5 μL de solution réactionnelle biofluorescente 2x dans chaque puits immédiatement à l’aide du bras robotisé.
  2. Arrêtez temporairement le bras du robot pour maintenir la solution dans chaque pointe au-dessus de l’endroit où la plaque doit être placée.
  3. Une fois la plaque de test en place, redémarrez le bras du robot.
    REMARQUE : Pour éviter la saturation de l’ADP généré, mesurez immédiatement l’intensité fluorescente.
  4. Essorez rapidement (200 x g pendant 1 min) la plaque et placez la plaque dans le lecteur de plaques.
  5. Démarrez la mesure en temps réel de la fluorescence à 540 nm/590 nm (excitation/émission) toutes les minutes pendant 1 h.

6. Analyse des résultats

  1. Calculer les valeurs comme la moyenne ± l’erreur type de la moyenne (SEM) à partir des échantillons indiqués et répétés dans chaque groupe expérimental ; Reproduire les expériences pour assurer la cohérence.
  2. Effectuez une signification statistique à l’aide d’un test t de Student.
  3. Calculez les valeurs comme statistiquement significatives si les valeurs P sont P < 0,05.
  4. Calculez le rapport signal/bruit (S/B), le rapport signal/bruit (S/N) et le facteur Z' à l’aide des formules suivantes :
    S/B = Ligand moyen/Véhicule moyen
    S/N = (Ligand moyen - Véhicule moyen)/Écart-type véhicule
    Facteur Z' = 1 - (3 x Ligand d’écart type + Véhicule d’écart type)/(Ligand moyen - Véhicule moyen)
  5. Assurez-vous que les facteurs S/B, S/N et Z' sont supérieurs à 3, 10 et 0,5, respectivement.
    REMARQUE : Confirmer si chaque expérience satisfait au critère général suffisant pour effectuer le HTS tel qu’indiqué dans les rapports précédents23,24.

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Résultats

Un principe de l’essai est résumé dans la figure supplémentaire 1 et basé sur un rapport précédent12,18. L’analyse a été conçue dans un format de 384 puits, comme le montre la figure 1. Les lignes d’extrême droite et de gauche ont été évitées sur la plaque. Les deux lignes à côté des lignes les plus à gauche et à droite ont ensuite été utilisées comme contrôle négatif et témoin positif avec ou sans l’enzyme, respecti...

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Discussion

Nous avons réussi à établir un nouveau test à haute plage dynamique et à haute précision avec une combinaison d’un test enzymatique classique et d’un test fluorescent pour l’ADP, qui est le produit final par ATPase, y compris Tg et Nc ATPase22. Afin d’effectuer un test HTS, il est important que le test ait de meilleures valeurs de S/B, S/N et du facteur Z' qu’un test enzymatique classique15,22. De plus, l’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier dans cette étude.

Remerciements

Ce travail a été en partie soutenu par la Platform for Drug Discovery, Informatics and Structural Life Science, une subvention pour la recherche scientifique (C) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS-21K06566). Les auteurs remercient sincèrement Asai (Keio University School of medicine) et Harada (Kyoto Institute of Technology) ainsi que Stephen Stratton pour le don de deux mutants actifs NTPase recombinants et leur contribution à la préparation de ce manuscrit, respectivement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poste de travail à 12 étages EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXBras robotique Système de tuyauterie
384 pointesde puits Biotech Co., Ltd.
ADP-hexokinasesur mesure Asahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPOriental Yeast, Co, Ltd.45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Ltd.011-15144
Diaphorase-IUnitika Ltd.Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P déshydrogénaseOriental Yeast, Co, Ltd.306-50143
GlucoseWako Pure Chemical Industries, Ltd.049-31165
Greiner 384 puits micro-plaque non contraignant puits peu profond Noir#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPOriental Yeast, Co, Ltd.44332000
N-éthylmaléimideWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FSLecteur de microplaques multimode
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Matériel de laboratoire Seahorse 384 Puits RéservoirsS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.Référence 35501-02
à profil bas

Références

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