Nous présentons ici un protocole basé sur le système d’appât du ver de farine (Tenebrio molitor) qui a été utilisé pour isoler et sélectionner les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Une formule de nombre de conidies efficaces (ECN) est utilisée pour sélectionner un EPF à haute tolérance au stress en fonction des caractéristiques physiologiques de la lutte microbienne des ravageurs sur le terrain.
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Article de méthode
Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les champignons entomopathogènes (FPE) sont l’un des agents de lutte microbienne pour la lutte intégrée contre les ravageurs. Pour lutter contre les ravageurs locaux ou envahissants, il est important d’isoler et de sélectionner les FPE indigènes. Par conséquent, la méthode de l’appât du sol combinée au système d’appât d’insecte (ver de farine, mouoliteur Tenebrio) a été utilisée dans cette étude avec quelques modifications. Les EPF isolés ont ensuite été soumis au test de virulence contre le ravageur agricole Spodoptera litura. De plus, les souches EPF potentielles ont été soumises à des identifications morphologiques et moléculaires. En outre, la production de conidies et le test de thermotolérance ont été effectués pour les souches EPF prometteuses et comparés; ces données ont ensuite été substituées dans la formule du nombre de conidies effectives (ECN) pour le classement en laboratoire. Le système appât-ver de farine du sol et la formule ECN peuvent être améliorés en remplaçant les espèces d’insectes et en intégrant plus de facteurs de stress pour l’évaluation de la commercialisation et l’application sur le terrain. Ce protocole fournit une approche rapide et efficace pour la sélection des FPE et améliorera la recherche sur les agents de lutte biologique.
Introduction
Actuellement, les champignons entomopathogènes (FPE) sont largement utilisés dans la lutte microbienne contre les ravageurs agricoles, forestiers et horticoles. Les avantages de l’EPF sont ses larges gammes d’hôtes, sa bonne adaptabilité environnementale, sa nature écologique et le fait qu’il peut être utilisé avec d’autres produits chimiques pour montrer l’effet synergique de la lutte intégrée contre les ravageurs1,2. Pour l’application en tant qu’agent antiparasitaire, il est nécessaire d’isoler un grand nombre d’EPF des insectes malades ou de l’environnement naturel.
L’échantillo....
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Protocole
REMARQUE : L’organigramme complet est illustré à la figure 1.
1. Isolement et sélection des champignons entomopathogènes potentiels (FPE)
- Prélever l’échantillon de sol
- Retirez 1 cm du sol de surface, puis recueillez le sol à une profondeur de 5 à 10 cm à l’aide d’une pelle de chaque site d’échantillonnage.
NOTE : Les sites d’échantillonnage seraient des montagnes, des forêts ou des zones peu peuplées afin d’éviter la contamination des souches de FPE pulvérisées artificiellement. Assurez-vous que les zones de collecte des échantillons de sol sont recouvertes de mauvaises herbes à la surface.....
- Retirez 1 cm du sol de surface, puis recueillez le sol à une profondeur de 5 à 10 cm à l’aide d’une pelle de chaque site d’échantillonnage.
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Résultats
Isolement et sélection de champignons entomopathogènes potentiels (EPF)
En utilisant la méthode de construction de la bibliothèque de champignons entomopathogènes à médiation molitoreuse (EPF) de Tenebrio, le nombre de champignons sans activité de destruction d’insectes serait exclu; ainsi, l’efficacité de l’isolement et la sélection du FPE pourraient être largement augmentées. Au cours de l’application de cette méthode, les informations sur les sites d’échan.......
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Discussion
Les champignons entomopathogènes (EPF) ont été utilisés pour la lutte contre les insectes. Il existe plusieurs méthodes pour isoler, sélectionner et identifier les FPE30,31,32. En comparant les différents types de méthodes d’appâts à insectes, Beauveria bassiana et Metarhizium anisopliae ont été couramment trouvés dans les appâts à insectes6,12,13,14.
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts impliqué dans ce travail.
Remerciements
Cette recherche a été soutenue par la subvention 109-2313-B-005 -048 -MY3 du ministère de la Science et de la Technologie (MOST).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Gélose de qualité bactériologique | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Convient à la plupart des applications de culture cellulaire/moléculaire, de biologie. |
| AGAROSE, qualité biotechnologie | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | Pour l’électrophorèse de l’ADN. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Perceur de liège en laiton | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | Pour une morphologie de colonie de souche record |
| Incubateur à température constante | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Élevage de champignons. |
| cubee Mini-centrifugeuse | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Système d’image numérique sur gel | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 à 2 & micro ; L Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 à 10 & micro ; L Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 à 100 & micro ; L Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 à 1000 & micro ; L Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 à 20 & micro ; L Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 à 200 & micro ; L Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR | Kit Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Cylindre gradué Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Mesurez le volume des réactifs. |
| Compteur de pointage manuel | SDI | NO.1055 | |
| Hémocytomètre | bioman | AP-0650010 | Calculer le nombre de spores |
| Boucle d’inoculation | Dogger | D8GA-23000 | |
| couvercle | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro verre de couverture | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Système d’imagerie microscope | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Lames de microscope | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus Électrophorèse sur gel d’ADN | ADVANCE | AD110 | |
| Microscope optique Nikon | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Gobelet en plastique | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Kit de levure | Geneaid | GYBY300 | Kit d’extraction d’ADN génomique fongique |
| Bouillon de dextrose Sabouraud (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences | Company M033 | Utilisé pour la culture de levures, de moisissures et de micro-organismes aciduriques. |
| Lame de scalpel n°23 | Swann-Morton | 310 | |
| Manche de scalpel n°4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Pelle | Save & Sûr | A ;-1580242 ;-00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Tensioactif |
| Sorvall Legend Micro 17 Micro 17 Microcentrifugeuse | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Pince à épiler en acier | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Boîte de Pétri stérile | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Récipients cylindriques peu profonds avec couvercles ajustés, spécialement conçus pour la microbiologie ou la culture cellulaire. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Congélateur | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX-80 | ° ; C stocké. |
| Armoire à plancher vertical | Chih Chin | BSC-3 | Opération fongique de culture. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Sacs de rangement à fermeture éclair | Save & Sûr | A ;-1248915 ;-00 | |
| 100 bp Échelle d’ADN | Geneaid | DL007-20 | |
| ° ; C Congélateur | FRIGIDAIRE | Frigidaire | FFFU21M1QW-20° ; C et réactifs expérimentaux stockés. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
Références
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Flor....
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Réimpressions et autorisations
