Protocole d’analyse et de consolidation des sorties TrackMate pour la mesure de la motilité cellulaire bidimensionnelle à l’aide du suivi nucléaire

Résumé

Ce protocole de mesure à haut débit de la motilité cellulaire dans les kératinocytes HaCaT décrit les méthodes de collecte et de traitement des images des noyaux cellulaires et de suivi des particules à l’aide du plugin ImageJ TrackMate.

Résumé

La migration cellulaire collective joue un rôle clé dans de nombreux processus biologiques fondamentaux, notamment le développement, la cicatrisation des plaies et les métastases cancéreuses. Pour comprendre la régulation de la motilité cellulaire, nous devons être en mesure de la mesurer facilement et de manière cohérente dans différentes conditions. Nous décrivons ici une méthode de mesure et de quantification de la motilité unicellulaire et globale des kératinocytes HaCaT à l’aide d’une coloration nucléaire. Cette méthode inclut un script MATLAB pour analyser les fichiers de sortie TrackMate afin de calculer les déplacements, les taux de motilité et les angles de trajectoire dans des cellules uniques et en masse pour un site d’imagerie. Ce script d’analyse de motilité permet une analyse rapide, simple et évolutive des taux de motilité cellulaire à partir des données TrackMate et pourrait être largement utilisé pour identifier et étudier la régulation de la motilité dans les cellules épithéliales. Nous fournissons également un script MATLAB pour réorganiser les vidéos de microscopie collectées au microscope et les convertir en piles TIF, qui peuvent être analysées en masse à l’aide du plug-in ImageJ TrackMate. En utilisant cette méthodologie pour explorer les rôles des jonctions adhérentes et de la dynamique du cytosquelette d’actine dans la régulation de la motilité cellulaire dans les kératinocytes HaCaT, nous démontrons que l’activité Arp2/3 est nécessaire pour la motilité élevée observée après la déplétion en α-caténine dans les kératinocytes HaCaT.

Introduction

Une régulation précise et réactive de la motilité cellulaire dans les cellules épithéliales est cruciale pour la cicatrisation des plaies et pour le reconstituement de la couche épithéliale. L’incapacité à maintenir la motilité peut entraîner des problèmes de développement embryonnaire et de cicatrisation des plaies¹ et la signalisation de motilité hyperactive est un contributeur clé aux métastases cancéreuses².

La compréhension du contrôle cellulaire de la motilité dans les kératinocytes HaCaT offre des informations importantes sur ces processus. Les procédur....

Protocole

1. Préparation de plaques de culture cellulaire et d’imagerie

1. Cultiver des cellules HaCaT dans un milieu de culture cellulaire (milieu d’Eagle modifié de Dulbecco complété par 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin) à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié.
2. Amorcez le nombre souhaité de cellules par puits (nous utilisons 5000 à 20 000 cellules/puits) dans une plaque d’imagerie à 96 puits, telle qu’une microplaque de polystyrène noir à 96 puits. Dans trois puits, ajoutez uniquement du milieu (pas de cellules).

Résultats

Pour nous assurer que notre script d’analyse était fiable et cohérent, nous avons mesuré la motilité des kératinocytes HaCaT dans trois expériences indépendantes. Nous avons constaté que si l’écart-type des motilités cellulaires était variable d’une expérience à l’autre (peut-être en raison de la sensibilité des cellules HaCaT à la confluence et aux stimuli mécaniques), la motilité moyenne était systématiquement répliquée dans plusieurs expériences sans différences statistiquement significatives entre les répétitions sel.......

Discussion

La méthodologie et les outils d’analyse décrits ci-dessus fournissent un moyen simple et évolutif de mesurer et de quantifier la motilité des kératinocytes HaCaT qui utilise MATLAB et nécessite une expérience minimale en programmation. Ce protocole demande que les noyaux des cellules soient colorés et imagés pendant au moins 5 h. Bien que la collecte de données puisse être effectuée sur n’importe quel microscope approprié, ce protocole fournit un script pour le traitement des images coll.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microplaques plates à fond transparent en polystyrène noir traitées TC, emballées individuellement, avec couvercle, stériles	Corning	3603
Dulbecco’s modified eagle medium (D-glucose élevé)	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	12800-082
Sérum fœtal bovin	Sigma-Aldrich Inc	F0926
Fluorobrite Dulbecco’s modified eagle medium (D-glucose élevé, 3,7 g/L de bicarbonate de sodium, pas de L-glutamine, pas de rouge de phénol)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	A18967-01
GlutaminePlus	R& D Systems Inc.	R90210
Hoechst 33342, chlorhydrate trihydraté	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific	H21492
Pénicilline streptomycine	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	15140-122
Solution saline tamponnée au phosphate	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14190-144