Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis

Arabidopsis est une espèce de plante diploïde appartenant à la famille des Brassicaceae. Son cycle de vie relativement court (deux mois par génération dans des conditions de croissance de longue durée), sa petite taille de plante et son autopollinisation avec la production de centaines de graines par plante en ont fait la première espèce modèle végétale fondamentale^1,2. De plus, son génome a été entièrement séquencé^3,de vastes outils de génétique inverse (ADN-T saturé, transposon et populations chimiquement mutagénisées) sont disponibles^4,5,6, et une transformation efficace médiée par Agrobacteriumest bien établie pour obtenir suffisamment de lignées transgéniques pour d’autres travaux en aval⁷ . Ainsi, au cours des deux dernières décennies, de grands progrès ont été réalisés en utilisant Arabidopsis comme espèce modèle pour disséquer divers aspects de la biologie végétale au niveau moléculaire, y compris la variation naturelle, génétique et phénotypique^8,9.

Pour caractériser fonctionnellement les gènes d’intérêt pour Arabidopsis, la stérilisation de la surface des graines pour éliminer les contaminants fongiques et bactériens est l’étape préalable à de nombreux protocoles en aval nécessitant des cultures axeniques. La transformation génétique pour la surexpression^10,le knock-down (ARN-I¹¹⁾ou le knock-out (édition du génome^12,13)de la fonction génique, la localisation subcellulaire^14,l’activité promotrice^15,16,l’interaction protéine-protéine¹⁷ et l’interaction protéine-ADN^18,pour ne citer que les applications les plus courantes, nécessitent toutes une étape de stérilisation à la surface de la graine. Ainsi, malgré sa relative simplicité, la stérilisation de surface des semences joue un rôle fondamental dans de nombreuses analyses fonctionnelles.

Jusqu’à présent, deux grandes catégories de méthodes de stérilisation de surface des semences ont été développées sur la base de la stérilisation en phase gazeuse ou liquide¹⁹. Bien que le débit de stérilisation de surface des semences en phase gazeuse soit moyen à élevé, l’utilisation du réactif dangereux chlore gazeux comme agent de stérilisation de surface a entravé son application à grande échelle. Les méthodes basées sur la stérilisation en phase liquide, au contraire, reposent sur des produits chimiques plus doux comme l’éthanol et les solutions d’eau de Javel pour la stérilisation de surface, et elles sont plus largement utilisées malgré leur débit intrinsèquement inférieur à celui de la fumigation au chlore. En général, deux méthodes différentes qui utilisent des réactifs liquides sont couramment utilisées. Une méthode largement utilisée est basée sur le lavage à l’éthanol et à l’eau de Javel à différentes concentrations pour différentes durées de temps^20,21. Une autre méthode est basée sur l’application d’eau de Javel seulement^21,22. Les deux méthodes sont principalement appliquées pour la stérilisation de surface des semences à petite échelle. Cependant, dans de nombreuses expériences, il est nécessaire de dépister de nombreuses lignées transgéniques d’Arabidopsis dérivées d’une transformation^15,23 ou de filtrer en parallèle de nombreuses lignées transgéniques générées à partir de différentes transformations^24,25. À notre connaissance, aucune méthode à base de liquide pour la stérilisation de surface des semences à haut débit n’a été publiée, ce qui constitue, bien que peu reconnu, un goulot d’étranglement important pour les approches de génomique fonctionnelle. Par conséquent, le développement de méthodes sûres, robustes et à haut débit pour la stérilisation de la surface des semences est une étape nécessaire et critique vers le succès de la caractérisation fonctionnelle de nombreux gènes à la fois.

À cette fin, dans la présente étude, une méthode améliorée de stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis est présentée. Cette méthode est sûre, peu coûteuse, très robuste et à haut débit, permettant de traiter 96 lignes indépendantes en une heure à partir du début de la stérilisation de la surface des graines jusqu’à la fin du semis dans des boîtes de Pétri. La méthode démontrée repose sur des instruments de laboratoire de base largement disponibles, tels qu’une pompe à vide, de la verrerie consommable et des articles en plastique. Cette méthode améliorée fournit à la communauté scientifique une approche sûre, simple et abordable pour rationaliser la stérilisation de la surface des semences avec un débit adéquat aux approches génomiques fonctionnelles modernes chez Arabidopsis et d’autres espèces végétales non modèles.

1. Réactifs et préparation des milieux

1. Préparer une solution d’éthanol à 70 % : Ajouter 737 mL d’éthanol technique à 95 % à 263 mL d’eau distillée. Mélanger.
   REMARQUE: Préparer une solution d’éthanol à 70% sur un banc de travail non stérile.
   ATTENTION : L’éthanol est très inflammable et peut causer une irritation grave des yeux. Tenir à l’écart des flammes et des sources de chaleur. En cas de contact avec les yeux, rincer abondamment à l’eau.
2. Préparer une solution d’eau de Javel à 5 % : Ajouter 5 mL d’eau de Javel domestique (contenant environ 3,5 % d’hypochlorite de sodium, NaClO) à 95 mL d’eau distillée stérile. Ajouter quelques gouttes de détergent non ionique (p. ex., Tween 20) et bien mélanger.
   REMARQUE: Préparez une solution d’eau de Javel à 5% à l’intérieur de la hotte laminaire.
   ATTENTION : L’hypochlorite de sodium, le composant actif de l’eau de Javel, est très irritant. Il est très corrosif et peut causer de graves dommages au tractus gastro-intestinal. En cas de contact, rincer immédiatement à l’eau abondante. En cas d’ingestion, appelez le centre antipoison ou un médecin pour obtenir des conseils de traitement.
3. Préparer le Murashige et le Skoog (1/2 MS) moyen²⁶.
   1. Ajouter 2,2 g de poudre moyenne MS (y compris les vitamines) et 10 g de saccharose dans 800 mL d’eau distillée. Ajuster le pH de la solution à l’aide de 1 M KOH et porter le volume à 1 L à l’aide d’eau distillée. Aliquote 500 mL dans une bouteille de 1 L et ajouter 4g de gélose pour préparer un milieu solide. Autoclavez la solution.
   2. Après l’autoclavage, refroidir le fluide à 50-53 °C au bain-marie et le verser dans des boîtes de Pétri sous la hotte à flux laminaire. Pour préparer le milieu sélectif, ajouter 1000 μL/L de 50 mg/mL de solution mère de kanamycine (mélanger 500 mg de sulfate de kanamycine monohydraté dans 10 mL d’eau distillée, filtrer stériliser et conserver à -20 °C) au milieu (50-53 °C). Bien mélanger en tourbillonnant et verser dans des boîtes de Petri comme mentionné précédemment.

2. Configuration de l’aspirateur

REMARQUE : La configuration de l’instrument est résumée à la figure 1.

1. Connectez l’entrée de la pompe à vide à une extrémité d’un tube en polyéthylène (PE) de taille appropriée. Connectez l’autre extrémité du tube à la sortie du couvercle bidirectionnel de la bouteille de décantation. Enveloppez hermétiquement la jonction du tube avec un film d’étanchéité(Table des matériaux)pour assurer une connexion étanche à l’air.
2. Connectez un deuxième tube PE à l’entrée (le trou faisant saillie à l’intérieur de la bouteille) du bouchon à vis sur la bouteille de décantation. Placez l’autre côté du tube à la sortie d’une valve d’aquarium. Si nécessaire, enveloppez avec un film d’étanchéité le long de la jonction pour éliminer les fuites d’air.
3. Juste avant utilisation, placez une pointe de pipette stérile de 200 μL à l’entrée du filtre de l’aquarium sous la hotte à flux laminaire.

Figure 1: Schéma du dispositif d’aspiration pour l’élimination à haut débit des liquides de stérilisation. Pour plus de clarté, les parties individuelles ne sont pas dessinées à l’échelle. La lettre (A) indique la pompe à vide, (B) la bouteille réservoir pour recueillir les liquides (éthanol, eau de Javel ou eau stérile), (C) la valve pour éviter le reflux des liquides, (D) la pointe stérile de la pipette de 200 μL, et (E) le tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant des graines et du liquide de stérilisation. Les flèches indiquent la direction du flux d’air. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Stérilisation de surface liquide à haut débit des semences

REMARQUE : La procédure globale et le temps minimal requis pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis thaliana (L.) Heynh de type sauvage (Col-0) (Arabidopsis) avec 96 échantillons indépendants sont résumés à la figure 2.

1. Étiqueter avec un marqueur permanent deux lots de tubes de microcentrifugation de 48 x 1,5 mL avec des numéros progressifs.
2. Ajouter 100-200 graines d’Arabidopsis à chacun des 96 tubes stériles de 1,5 mL de microcentrifugation (environ 1-2 mm au-dessus du fond de l’extrémité conique du tube).
3. Aliquote environ 1000 μL d’éthanol à 70% dans chaque tube à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL à l’intérieur de la hotte à flux laminaire (lot de graines un, 48 tubes) et fermez soigneusement les couvercles.
   REMARQUE: La distribution des solutions n’a pas besoin d’être extrêmement précise, tant que le volume distribué est plusieurs fois supérieur au volume des graines. Alternativement, effectuez cette étape à l’extérieur de la hotte laminaire (état non stérile).
4. Agiter les tubes à une fréquence d’oscillation de 8,0 Hz pendant au moins 3 min dans un agitateur.
5. Retirez les adaptateurs du shaker et transférez-les dans le panier d’une microcentrifugeuse de paillasse.
6. Faites tourner rapidement les graines à l’aide de la fonction d’impulsion (présente dans la plupart des centrifugeuses de paillasse) pour atteindre 1880 x g (~ 15 s).
   REMARQUE: Des forces de centrifugation plus longues ou plus élevées affectent négativement la germination des graines.
7. Transférez les 48 tubes des adaptateurs dans un rack et ouvrez tous les tubes sous la hotte à flux laminaire. Évitez les contaminations en ne touchant pas la partie des couvercles qui s’insère dans les tubes. Si les couvercles sont trop proches les uns des autres, divisez les tubes en deux racks pour une manipulation plus facile.
8. Installez une pointe jaune stérile de 200 μL sur l’entrée de la vanne d’aquarium de l’aspirateur fait maison sous la hotte à flux laminaire et allumez la pompe.
9. Insérez la pointe jaune juste au-dessus du niveau des graines pour éviter de toucher les graines lors de la succion du liquide. Alternativement, positionnez rapidement la pointe au bas du tube; si une graine bloque l’aspiration du liquide, éliminez la pointe jaune et insérez-en une nouvelle.
10. Aliquote dans chaque tube environ 1000 μL d’eau de Javel à 5% à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL à l’intérieur de la hotte à écoulement laminaire.
11. Fermez hermétiquement tous les couvercles et remettez tous les tubes dans les adaptateurs de secoueur. Agiter les tubes à une fréquence d’oscillation de 8,0 Hz pendant au moins 3 min dans le shaker.
12. Faites tourner rapidement les graines à l’aide de la fonction d’impulsion de la centrifugeuse de paillasse pendant le temps nécessaire pour atteindre 1880 x g (~ 15 s).
13. Installez une nouvelle pointe jaune stérile de 200 μL sur la vanne de l’aquarium connectée à la pompe à vide sous la hotte à flux laminaire et allumez la pompe.
14. Insérez la pointe jaune au-dessus du niveau des graines pour éviter de toucher les graines lors de la succion de la solution d’eau de Javel.
15. Aliquote dans chaque tube environ 1000 μL de_H2O stérilisé à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL dans la hotte à écoulement laminaire.
    REMARQUE: Combinez les deux lots de graines pour minimiser le temps de fonctionnement.
16. Installez une nouvelle pointe jaune stérile de 200 μL sur la vanne de l’aquarium connectée à la pompe à vide sous la hotte à flux laminaire et allumez la pompe.
17. Insérez la pointe jaune juste au-dessus du niveau des graines pour éviter de toucher les graines lors de la succion du H₂O.
18. Aliquote dans chaque tube environ 500 μL de_H2O stérilisé à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL et fermer tous les couvercles de la hotte à écoulement laminaire. Les graines sont prêtes à être semées. Si nécessaire, maintenez les tubes à température ambiante pendant quelques heures maximum ou à 4 °C pendant la nuit.
19. Remplissez la bouteille de réservoir utilisée pour recueillir le liquide avec une quantité adéquate d’eau et autoclavez-la. Ensuite, jetez le liquide dans un évier normal.
    REMARQUE: Autoclavez le liquide pour tuer toutes les graines à l’intérieur du réservoir.

Figure 2: Vue d’ensemble de la procédure et temps minimal requis pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis avec 96 échantillons indépendants. Dans l’expérience présentée, 96 échantillons indépendants sont manipulés en deux lots de taille égale. L’ensemble de la procédure est le même pour les deux lots, et ils sont traités en parallèle, mais le lot deux est traité avec un délai d’une étape par rapport au lot un. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Placage et notation d’Arabidopsis sur 1/2 plaques MS

1. Transférer les graines et 300-400 μL de_H2Ostérile dans une boîte de Pétri par pipetage doux avec une pipette de 1000 μL.
2. Après avoir transféré 10 tubes, verser dans chaque plaque environ 1,5 à 2,0 mL de milieu fondu 1/2 MS sans antibiotiques.
   REMARQUE: Fondez à l’avance, puis conservez le milieu fondu 1/2 MS dans un bain thermostatique réglé à 50-53 ° C pour éviter la solidification. S’assurer que la température ne dépasse pas 58 °C pour éviter de diminuer la germinabilité des graines.
3. Faites tourbillonner rapidement la plaque pour répartir les graines à l’intérieur. Collez les plaques sur les côtés opposés.
4. Enveloppez les assiettes dans une feuille de plastique ou d’aluminium, puis placez-les au réfrigérateur (4 °C) pendant 3 jours dans l’obscurité pour obtenir une germination uniforme.
5. Transférer les plaques dans une chambre de croissance fixée à 23 °C dans des conditions de longue journée (16 h de lumière/8 h d’obscurité) avec une intensité lumineuse de 100-120 μmol·m^-2·s^-1 et 60 % d’humidité relative.
6. Après deux jours, marquez les plantes par la présence de radicles. Détecter l’émergence de la radicle et la formation de cotylédon vert (ouverture complète des deux cotylédons) pour évaluer la germination des graines.

5. Analyses statistiques

REMARQUE: Ici, le test par paires de Tukey a été utilisé pour les analyses statistiques.

1. Considérez les valeurs P inférieures à 0,01 comme statistiquement significatives. Effectuez toutes les expériences au moins avec cinq répliques biologiques.

Afin d’évaluer le temps requis pour l’ensemble de la procédure de stérilisation des semences, les différences de temps pour la manipulation de liquides de 96 échantillons dans le protocole actuel ont été calculées et comparées aux méthodes de pipetage traditionnelles. Le résultat indique que le protocole actuel permet de gagner du temps, en réduisant le temps de manipulation du liquide à un quart de celui des protocoles traditionnels(tableau 1). Le tableau souligne en outre que le temps d’élimination des liquides dans le protocole actuel permet de gagner plus de temps que celui des méthodes traditionnelles, avec une réduction globale de huit fois.

Sélection de la plage de temps pour la stérilisation des semences
Des étapes de stérilisation plus longues minimisent les taux de contamination, mais peuvent affecter négativement la germination des graines. Afin de déterminer la meilleure plage de temps pour la stérilisation des semences avec les taux de germination les plus élevés sans contamination, différentes durées de chaque étape de stérilisation ont été testées, en évaluant à la fois la germination des graines et les taux d’émergence du cotylédon vert. Les analyses de germination effectuées du jour 2 au jour 4 et au jour 7 n’ont indiqué aucune différence significative entre la plage de temps de 10 min à 40 min de stérilisation à 70% à l’éthanol. Cependant, à partir de 40 min de traitement avec de l’éthanol à 70%, les taux de germination ont diminué (Figure 3). En conséquence, les taux d’émergence des cotylédones verts ont diminué (Figure 4). Comme des temps de stérilisation plus courts peuvent augmenter le débit mais augmenter les taux de contamination, le temps minimal nécessaire pour stériliser 96 échantillons de semences différents en deux lots de 48 échantillons a été évalué. De plus, étant donné la configuration préférée avec agitation effectuée dans un shaker, nous avons testé le temps minimal nécessaire à la stérilisation des semences en manipulant 96 échantillons dans deux lots de 48 échantillons chacun. Le temps minimal requis pour traiter 48 échantillons à la fois était de 3 min, permettant ainsi au deuxième ensemble de 48 échantillons d’être traité immédiatement après le premier ensemble sans aucun temps d’attente. Ainsi, 3 min pour 70% d’éthanol et 3 min pour 5% d’eau de Javel ont été appliquées comme temps minimum pour stériliser les graines (point a) de la figure 3). Ces analyses ont donné des taux de germination similaires aux taux les plus élevés sans contamination ni perte de vitalité des graines (Figure 3).

En résumé, les intervalles de temps appropriés pour maintenir le pourcentage le plus élevé de germination des graines sans contamination dérivée d’une élimination suffisante des micro-organismes sont compris entre 3 et 30 minutes pour 70% d’éthanol et entre 3 et 22,5 minutes pour 5% d’eau de Javel.

Afin de démontrer que les graines que nous utilisions à l’origine étaient contaminées par des micro-organismes, les graines non stériles ont été semées directement sur des plaques de SEP. Les champignons sont apparus sur les plaques après deux jours de semis et se sont répandus sur toutes les plaques après une germination de sept jours (Figure supplémentaire 1).

Évaluation de la contamination croisée entre différents génotypes de semences
Pour vérifier si l’utilisation d’une seule pointe de pipette stérile pour traiter différents échantillons de semences pouvait entraîner une contamination croisée et pour évaluer la quantité de cette contamination croisée, deux génotypes différents de graines (Col-0 de type sauvage, sensible à la kanamycine, et Arabidopsis transgénique lignée AdoIspS-79, résistante à la kanamycine24)ont été alternés au cours de la procédure de stérilisation. Après stérilisation standard des graines, elles ont été semées dans des plaques solides de SEP à demi-résistance complétées sans ou avec 50 mg/L de kanamycine. Les expériences ont été reproduites cinq fois. Ces analyses ont indiqué qu’environ 96% des graines ont germé dans des plaques MS contenant de la kanamycine, mais aucun cotylédon vert n’a été observé le 7e jour de germination dans les plaques semées avec le génotype Col-0 (Figure 5). En parallèle, les graines de Col-0 semées dans des plaques de SEP ont montré une germination d’environ 94%, et tous les cotylédons étaient verts après 7 jours de germination. Ces résultats indiquent qu’il n’y a pas de transfert de contamination entre les échantillons malgré l’utilisation d’une seule pointe de pipette pour éliminer la solution stérile.

Figure 3: Pourcentage de germination des graines après 2, 3, 4 et 7 jours de semis d’Arabidopsis avec différents temps de stérilisation indiqués par des lettres différentes. a: 3 min d’éthanol à 70% et 3 min d’eau de Javel à 5%, b: 10 min d’éthanol à 70% et 7,5 min d’eau de Javel à 5%, c: 20 min d’éthanol à 70% et 15 min d’eau de Javel à 5%, d: 30 min d’éthanol à 70% et 22,5 min d’eau de Javel à 5%, e: 40 min d’éthanol à 70% et 30 min d’eau de Javel à 5%, f: 50 min d’éthanol à 70% et 37,5 min d’eau de Javel à 5%, g: 70 min d’éthanol à 70% et 52,5 min d’eau de Javel à 5%. Deux étoiles indiquent des différences significatives selon le test par paires de Tukey (p < 0,01). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Pourcentage de cotylédon vert après 7 jours de semis de graines d’Arabidopsis avec différents temps de stérilisation indiqués par des lettres différentes. a: 3 min d’éthanol à 70% et 3 min d’eau de Javel à 5%, b: 10 min d’éthanol à 70% et 7,5 min d’eau de Javel à 5%, c: 20 min d’éthanol à 70% et 15 min d’eau de Javel à 5%, d: 30 min d’éthanol à 70% et 22,5 min d’eau de Javel à 5%, e: 40 min d’éthanol à 70% et 30 min d’eau de Javel à 5%, f: 50 min d’éthanol à 70% et 37,5 min d’eau de Javel à 5%, g: 70 min d’éthanol à 70% et 52,5 min d’eau de Javel à 5%. Deux étoiles indiquent des différences significatives selon le test par paires de Tukey (p < 0,01). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Essai de contamination croisée entre les graines de type sauvage Col-0 et les graines AdoIspS-79. Germination de Col-0 dans des plaques de SEP à demi-force (à gauche), Col-0 dans une plaque de SEP à demi-force complétée par 50 mg/L de kanamycine (au milieu) et AdoIspS-79 dans une plaque de SEP à demi-force complétée par 50 mg/L de kanamycine (à droite), barre d’écailles = 1 cm. Une image représentative de l’une des cinq répliques est montrée dans la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Résumé du temps minimal requis pour la manipulation des liquides pendant la stérilisation de 96 échantillons de semences. Le tableau énumère le temps total (min) nécessaire pour ajouter et retirer le liquide tout au long des principales étapes de la stérilisation de la surface des semences en utilisant le protocole actuel et un protocole où le pipetage traditionnel est utilisé.

Figure supplémentaire 1 : Détection de la contamination après un semis de graines d’Arabidopsis de 7 jours. L’image montre le degré de contamination des graines non stériles (rincées à l’eau; à gauche) et des graines stériles (soumises à une stérilisation de surface comme décrit dans le texte principal; à droite). Scalebar = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.