Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis

Summary

Un protocole à haut débit pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) est fourni, optimisant les étapes de manipulation des liquides avec un simple dispositif d’aspiration construit avec une pompe à vide. Des centaines d’échantillons de semences peuvent être stérilisés en surface en une journée.

Abstract

Arabidopsis est de loin l’espèce modèle végétale la plus largement utilisée pour les études fonctionnelles. La stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis est une étape fondamentale nécessaire à cette fin. Ainsi, il est primordial d’établir des méthodes de stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis à haut débit pour traiter des dizaines à des centaines d’échantillons (par exemple, des lignées transgéniques, des écotypes ou des mutants) à la fois. Une méthode de stérilisation de la surface des graines basée sur l’élimination efficace du liquide dans les tubes avec un dispositif d’aspiration fait maison construit à partir d’une pompe à vide commune est présentée dans cette étude. En réduisant considérablement le temps de travail intensif avec cette méthode, il est possible de traiter plusieurs centaines d’échantillons en une journée avec peu d’effort. Les analyses chronologiques en série ont en outre indiqué une plage de temps très flexible de stérilisation de surface en maintenant des taux de germination élevés. Cette méthode pourrait être facilement adaptée à la stérilisation de surface d’autres types de petites graines avec une simple personnalisation du dispositif d’aspiration en fonction de la taille de la graine et de la vitesse souhaitée pour éliminer le liquide.

Introduction

Arabidopsis est une espèce de plante diploïde appartenant à la famille des Brassicaceae. Son cycle de vie relativement court (deux mois par génération dans des conditions de croissance de longue durée), sa petite taille de plante et son autopollinisation avec la production de centaines de graines par plante en ont fait la première espèce modèle végétale fondamentale^1,2. De plus, son génome a été entièrement séquencé^3,de vastes outils de génétique inverse (ADN-T saturé, transposon et populations chimiquement mutagénisées) sont disponibles^4,

Protocol

1. Réactifs et préparation des milieux

1. Préparer une solution d’éthanol à 70 % : Ajouter 737 mL d’éthanol technique à 95 % à 263 mL d’eau distillée. Mélanger.
   REMARQUE: Préparer une solution d’éthanol à 70% sur un banc de travail non stérile.
   ATTENTION : L’éthanol est très inflammable et peut causer une irritation grave des yeux. Tenir à l’écart des flammes et des sources de chaleur. En cas de contact avec les yeux, rincer abondamment à l’eau.
2. Préparer une solution d’eau de Javel à 5 % : Ajouter 5 mL d’eau de Javel domestique (contenant environ 3,5 % d’hypochlorite de sodium, NaClO) à 95 mL d’eau distillée stérile. Ajouter quelques gouttes de ....

Results

Afin d’évaluer le temps requis pour l’ensemble de la procédure de stérilisation des semences, les différences de temps pour la manipulation de liquides de 96 échantillons dans le protocole actuel ont été calculées et comparées aux méthodes de pipetage traditionnelles. Le résultat indique que le protocole actuel permet de gagner du temps, en réduisant le temps de manipulation du liquide à un quart de celui des protocoles traditionnels(tableau 1). Le tableau souligne en outre que le temps d’élimination des.......

Discussion

La stérilisation des graines est l’étape fondamentale des études fonctionnelles chez Arabidopsis. Bien qu’elle soit fréquemment réalisée à de nombreuses fins différentes, des études limitées sur la stérilisation de surface des semences à haut débit chez Arabidopsis sont disponibles.

Jusqu’à présent, l’une des méthodes avec le débit le plus élevé consiste à utiliser du chlore gazeux généré par le mélange d’eau de Javel avec du HCl concentré. Bien que cette méthode nécessite un temps pratique li.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Valve d’aquarium	Amazon	B074CYC5SD	Kit comprenant 2 valves et des tubes à paroi mince. La valve empêche les liquides de retourner à l’extrémité stérile
Graines de type sauvage Arabidopsis Col-0	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	Graines de type sauvage (sensibles à la kanamycine)
Lignée transgénique Arabidopsis Graines AdoIspS-79 NA		NA Ligne	transgénique surexprimant un gène de l’isoprène synthase d’Arundo donax transformé dans le fond Col-0, résistant à la kanamycine (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&ndash ; 2599). Disponible sur demande auprès des auteurs
Microcentrifugeuse	Eppendorf	EP022628188	Microcentrifugeuse de paillasse utilisée pour faire tourner les graines
Murashige & Milieu Skoog avec vitamines	Duchefa	M0222	Milieu standard pour la culture stérile de plantes
Contrôleur de pipette	Marque	26300	Utilisé pour faire fonctionner la pipette sérologique
Tube en polyéthylène 1	Roth	9591.1	Tube pour le raccordement de la pompe à vide à la bouteille de décantation (diamètre intérieur : 7 mm ; diamètre extérieur : 9 mm)
Tube en polyéthylène 2	Roth	9587.1	Tube pour le raccordement de la bouteille de décantation à la valve de l’aquarium (diamètre intérieur : 5 mm ; diamètre extérieur : 7 mm)
Bouchon à vis avec connecteurs	Roth	PY86.1	Bouchon à vis distributeur 2 voies GL45 en polypropylène pour bouteille de décantation
Pipette sérologique	Marque	27823	Pipette sérologique en verre gradué (réutilisable). Les pipettes jetables peuvent être utilisées à la place
Shakeret al.	Qiagen	85300	TissueLyser II Broyeur à billes utilisé normalement pour l’homogénéisation des tissus. Sans l’ajout de billes aux tubes, il fonctionne comme un agitateur.
Éthanol technique	ITW Reagents (Nova Chimica Srl)	212800	Éthanol 96 % v/v partiellement dénaturé qualité technique
Tween 20	Merck Millipore	655205	Détergent non ionique agissant comme tensioactif
Connecteurs de tubes universels	Roth	Y523.1	Peut être utilisé pour améliorer/simplifier les raccords de tubes
Pompe à vide	Merck Millipore	WP6222050	Utilisé pour Fabrication du dispositif d’aspiration