Mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes de souris fraîchement isolés

La β-oxydation des acides gras est un processus essentiel dans le métabolisme des lipides, fournissant une voie catabolique pour équilibrer la synthèse des acides gras et l’apport de l’alimentation. Ce processus génère de l’énergie pour plusieurs organes, y compris le muscle cardiaque, le cortex rénal et le foie à jeun, et utilise les acides gras obtenus à partir de l’alimentation, la lipolyse du tissu adipeux et les réserves internes de triglycérides ^1,2.

L’oxydation des acides gras par la voie β-oxydation entraîne le raccourcissement séquentiel de la chaîne acylique grasse par deux carbones à la fois, libérés sous forme d’acétyl-CoA, et ce processus se produit à la fois dans les mitochondries et les peroxysomes. Alors que la plupart des acides gras ne subissent qu’une β-oxydation, certains sont oxydés à différents carbones avant d’entrer dans cette voie. Par exemple, les acides gras substitués au 3-méthyle, tels que l’acide phytanique, subissent l’élimination d’un carbone par α-oxydation dans les peroxysomes avant d’entrer dans la voie de β-oxydation. De même, certains acides gras sont d’abord convertis en acides gras dicarboxyliques par oxydation du groupe méthyle terminal (ω-oxydation) dans le réticulum endoplasmique avant d’être préférentiellement oxydés dans les peroxysomes par β-oxydation³.

Quel que soit l’organite spécifique, un acide gras doit d’abord être converti en un thioester de coenzyme A (CoA), ou acyl-CoA, pour être oxydé par la voie de β-oxydation. β-oxydation des acyl-CoA à longue chaîne dans la matrice mitochondriale nécessite la navette carnitine pour leur translocation, où la carnitine palmitoyltransférase 1 (CPT1) catalyse la conversion des acyl-CoAs en acylcarnitines et est l’enzyme limitant le taux dans ce processus⁴. Une fois transloqués dans la matrice mitochondriale, les acyl-CoAs sont reformés et servent de substrats à la machinerie mitochondriale β-oxydation. À jeun, l’acétyl-CoA produit par β-oxydation dans les mitochondries hépatiques est principalement canalisé vers la cétogenèse. Les peroxysomes servent de site principal pour la β-oxydation des acides gras à très longue chaîne, à chaîne ramifiée et dicarboxyliques. Les peroxysomes n’ont pas besoin de la navette carnitine pour importer des substrats d’acides gras, mais importent plutôt les acyl-CoA correspondants par l’activité des transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) ABCD1-3⁵. Dans les peroxysomes, les acyl-CoAs sont ensuite oxydés par un ensemble dédié d’enzymes, distinctes de la machinerie mitochondriale d’β-oxydation des acides gras. Les mitochondries et les peroxysomes nécessitent également un apport de NAD⁺ et de CoA libre pour oxyder les chaînes acyles grasses. Il a été démontré que les niveaux de CoA dans le foie augmentent en réponse au jeûne, ce qui favorise l’augmentation du taux d’oxydation des acides gras qui se produit dans cet état⁶. De plus, l’augmentation de la dégradation du CoA dans les peroxysomes entraîne une diminution sélective de l’oxydation des acides gras peroxysomaux⁷. Par conséquent, le processus d’oxydation des acides gras dans la cellule est régulé par les niveaux d’expression et les activités des enzymes impliquées dans l’activation, le transport et l’oxydation des acides gras, ainsi que par les concentrations de cofacteurs et d’autres métabolites dans plusieurs compartiments subcellulaires.

Les procédures utilisant des homogénats tissulaires pour mesurer l’oxydation des acides gras détruisent l’architecture cellulaire régulant et soutenant ce processus, conduisant à une collecte de données qui ne reflètent pas avec précision le métabolisme in vivo. Alors que les techniques utilisant des hépatocytes primaires plaqués préservent ce système, la culture de cellules isolées pendant de longues périodes entraîne une perte du profil d’expression génique in vivo qui était présent dans les cellules lorsqu’elles vivaient encore chez l’animal ^8,9. Le protocole suivant décrit une méthode pour isoler les hépatocytes primaires et tester leur capacité à β-oxydation des acides gras immédiatement après l’isolement et en suspension, en utilisant l’acide [^1-14C]palmitique. Le dosage est basé sur la mesure de la radioactivité associée aux métabolites solubles dans l’acide (ASM) ou à des produits, comme l’acétyl-CoA, produits par la β-oxydation de l’acide [^1-14C]palmitique^10,11.

Toutes les procédures expérimentales sur des souris (C57BL/6J, mâles, âgés de 9 à 11 semaines) ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Virginie-Occidentale.

1. Isolement des hépatocytes

1. Préparation
   1. Dans les jours précédant l’isolement des hépatocytes, préparer les tampons et les milieux de culture cellulaire énumérés dans le tableau 1. Installez un bain-marie dont la température est réglée à 37 °C près de l’endroit où la chirurgie sera effectuée.
   2. Le jour de l’isolement hépatocytaire, sous une hotte à écoulement laminaire, transférer 35 mL de Buffer 1 dans un tube centrifuge stérile de 50 mL et 70 mL de Buffer 2 dans un bécher ou une bouteille stérile de 100 mL.
   3. Ajouter les antibiotiques gentamicine (50 μg/mL) et pénicilline/streptomycine (1x) aux deux tampons.
   4. Transférer 20 mL de Tampon 2 tel que préparé à l’étape 1.1.3 dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm et placer sur de la glace.
   5. Transférer les 50 mL restants de Buffer 2 dans un tube de centrifugeuse stérile de 50 mL. Placer les tubes de 50 mL contenant les tampons 1 et 2 supplémentés en antibiotiques dans un bain-marie réglé à 37 °C et les laisser se réchauffer pendant au moins 15 min avant de commencer la perfusion.
      REMARQUE: Si vous effectuez plusieurs isolements d’hépatocytes au cours d’une séance, augmentez le nombre d’aliquotes supplémentées aux antibiotiques des tampons 1 et 2 pour vous préparer en conséquence.
   6. Décongeler une aliquote de solution de collagénase et garder sur la glace.
      REMARQUE: S’il est correctement stocké, il n’y a pas de perte significative d’activité enzymatique dans les solutions de collagénase congelées et décongelées jusqu’à 3 fois et utilisées dans les 3 semaines suivant la préparation.
   7. Préparez les instruments chirurgicaux et la pompe péristaltique. Stériliser les conduites de la pompe péristaltique en faisant circuler 15 mL d’éthanol à 70 %, suivis de 15 mL d’eau stérile.
   8. Connectez une aiguille de 22 G à la ligne de sortie (Figure 1A). Le filtre évidé d’un cathéter fonctionne bien comme connecteur. Remplissez les lignes avec le tampon 1 et inspectez les lignes, le connecteur et l’aiguille pour vous assurer qu’aucune bulle d’air n’est piégée.

Figure 1 : Appareil de perfusion et foie perfusé. (A) Pompe péristaltique avec ligne de sortie reliée à l’aiguille utilisée pour canuler et perfuser le foie. (B) Une canulation réussie est indiquée par un blanchiment immédiat et homogène du foie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Perfusion et dissociation du foie
   1. Anesthésier une souris par inhalation d’isoflurane avec de l’air de qualité médicale comme gaz porteur, en utilisant 4% d’isoflurane pour l’induction et 1,5% d’isoflurane pour maintenir l’anesthésie. Vérifier la profondeur de l’anesthésie en évaluant la perte du réflexe de pédale.
   2. Lorsqu’il n’y a pas de réponse au pincement des orteils, placez la souris en position couchée sur une planche de chirurgie, étirez les membres et fixez-les à la planche avec des épingles.
   3. Vaporisez généreusement l’abdomen et la poitrine de la souris avec de l’éthanol à 70%.
   4. À l’aide d’une pince, remontez la peau et la paroi abdominale près de la base de l’abdomen et coupez latéralement, de chaque côté de la ligne médiane et jusqu’au diaphragme, pour exposer les organes.
   5. Exposez la veine cave inférieure (IVC) en déplaçant les intestins vers le côté droit et en retournant doucement les lobes du foie vers le haut. Insérez un petit objet cylindrique, tel qu’un capuchon d’aiguille, sous l’arrière de la souris pour incliner légèrement la CIV et faciliter sa canulation (Figure 1B).
   6. Démarrez la pompe à la vitesse la plus basse et, avec le tampon 1 en cours d’écoulement, insérez l’aiguille dans le CIV.
   7. Coupez la veine porte pour soulager la pression et permettre le drainage du sang et des tampons de perfusion, puis augmentez immédiatement le débit à 7 mL / min. Si cela est fait correctement, le foie blanchira uniformément en quelques secondes (Figure 1B).
   8. Pour des résultats plus cohérents, maintenez l’aiguille en position à la main pendant toute la durée de la perfusion.
   9. Perfuser le foie avec un tampon chaud 1. Pour éviter l’introduction de bulles d’air, assurez-vous que la conduite insérée dans le tube contenant le tampon 1 reste continuellement immergée.
   10. Pendant la perfusion, ajouter 130 μL de solution de collagénase au tampon 2 et mélanger en pipetant de haut en bas ou en remuant avec une pipette sérologique de 5 mL ou 10 mL.
   11. Lorsque le volume dans le tube contenant le tampon 1 diminue à environ 5 mL, ajoutez lentement 5 mL de tampon 2 au tampon 1 en pipetant sur le côté du tube. L’objectif est d’éviter d’introduire des bulles d’air dans la ligne tout en passant du tampon 1 au tampon 2.
   12. Attendez que le volume diminue à nouveau à 5 mL et ajoutez lentement 5 mL supplémentaires de buffer 2. Répétez une fois de plus. Comme le tampon 2 remplace le tampon 1 et que la dissociation commence, le foie va gonfler.
   13. Ajoutez le tampon 2 restant au tube contenant à l’origine le tampon 1. Arrêtez la perfusion lorsqu’il reste environ 5 à 10 mL de tampon 2 dans le tube.
       REMARQUE: Alors que le tampon 2 infuse le foie, la veine porte peut être serrée par intermittence avec une pince pendant 5 s. Cette étape est facultative, mais l’augmentation de la pression qui en résulte dans tout le foie peut améliorer sa dissociation et, par conséquent, le rendement final en hépatocytes.
   14. Excisez soigneusement le foie et transférez-le dans la boîte de culture de 100 mm contenant les 20 mL de tampon 2 glacé mis de côté à l’étape 1.1.4.
   15. Sous la hotte à écoulement laminaire, séparez doucement le foie à l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler.
   16. Ajouter environ 20 mL de M199 glacé à la suspension hépatocytaire et filtrer à travers une passoire cellulaire de 100 μm à l’aide du piston d’une seringue pour favoriser doucement la libération d’hépatocytes supplémentaires à partir de morceaux de foie plus gros.
   17. Lavez le plat de culture de 100 mm et la passoire cellulaire avec du M199 supplémentaire jusqu’à ce que le tube de collecte soit plein.
   18. Centrifuger la suspension à 50 x g pendant 2 min à 4 °C. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre doucement en suspension la pastille d’hépatocyte dans 30 mL de M199 froid en faisant tourbillonner.
   19. Pelleter les hépatocytes comme mentionné à l’étape 1.2.18. Répétez le lavage une fois de plus.
   20. Remettre en suspension les hépatocytes dans 10 mL de M199 chaud et déterminer la viabilité et le rendement à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan et d’un hémocytomètre¹².
   21. Diluer les cellules dans M199 réchauffées à 37 ºC à une concentration finale de 1,0 x 10⁶ cellules viables/mL et commencer immédiatement le dosage.

2. Dosage de β-oxydation des acides gras

REMARQUE: Le test est effectué en trois exemplaires et chaque mélange réactionnel contient 750 000 cellules, 1,35 mg / mL d’albumine sérique bovine (BSA), 100 μM d’acide palmitique et 0,4 μCi [^1-14C]palmitique dans un volume final de 2 mL.
ATTENTION : Les composés radioactifs sont dangereux. Acheter, manipuler, stocker et éliminer les matières radioactives conformément aux réglementations institutionnelles, étatiques et fédérales.

1. Préparation
   1. Dans les jours précédant le dosage, préparer les solutions d’acide palmitique et de BSA (tableau 1) et les conserver à -20 °C.
   2. Le jour du test, complétez les étapes 2.1.3-2.1.9 avant de commencer la perfusion hépatique.
   3. Décongeler les solutions d’acide palmitique et de BSA. Préparez le mélange de substrat pour plusieurs réactions plus un excès de 20% à 30%, avec une configuration d’essai typique illustrée dans le tableau 2.
   4. Aliquote 13,5 μL de solution de BSA par réaction dans un tube de microcentrifugation et chaud à 41 °C, puis ajouter 1 μL de la solution d’acide palmitique de 200 mM (BSA: rapport molaire de l’acide palmitique = 1:5) par réaction.
      REMARQUE: Il est préférable de distribuer des solutions préparées à l’aide de solvants organiques, tels que les solutions d’acide palmitique radioactif et non radioactif, avec une pipette à déplacement positif et des embouts appropriés.
   5. Vortex vigoureusement et incuber à 41 °C pour faciliter la formation de l’acide palmitique soluble : complexe BSA. Vortex occasionnellement pendant la période d’incubation.
   6. Le mélange apparaîtra initialement trouble mais se clarifiera complètement après 20-30 min d’incubation à 41 °C. Conservez-le à 41 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à déclencher les réactions.
   7. Aliquote 133 μL d’acide perchlorique 1 M dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL pour arrêter les réactions.
      ATTENTION : L’acide perchlorique est un acide fort et un oxydant puissant. Un équipement de protection approprié est nécessaire pour manipuler ce composé.
   8. Aliquote 485,5 μL de M199 par réaction dans un tube et le maintenir à 37 °C pour diluer le BSA radioactif: complexe d’acide palmitique préparé aux étapes 2.1.4-2.1.6 avant de commencer les réactions.
   9. Distribuer 750 μL de M199 dans autant de tubes à fond rond de 14 mL que les échantillons. Si vous le souhaitez, ajoutez des inhibiteurs de la β-oxydation des acides gras, tels que l’étomoxir, la roténone et l’antimycine, y compris un contrôle du véhicule (tableau 2).
   10. Pendant les étapes de lavage des hépatocytes, 10-15 min avant de commencer les réactions, transférer les tubes préparés à l’étape 2.1.9 dans un bain-marie agité réglé à 37 °C et agiter à 180-200 tr / min.
2. Démarrage, arrêt et analyse des réactions d’β-oxydation des acides gras
   1. Si la viabilité des hépatocytes est acceptable (généralement ≥ 75 %, figure 2), transférer pour chaque réaction 0,8 μL d’acide [1-14 C]palmitique (0,5 mCi/mL) dans le tube microcentrifuge contenant la solution d’acide palmitique BSA clarifiée (étapes 2.1.4-2.1.6). Vortex et retour au bain-marie à 41 °C.
   2. Pour équilibrer les hépatocytes à 37 °C et les pré-incuber avec des inhibiteurs (le cas échéant), immédiatement après la remise en charge finale des hépatocytes (étape 1.2.21), transférer 750 μL de la suspension hépatocytaire avec une pipette de 1 mL dans chacun des tubes à fond rond de 14 mL dans le bain-marie (étapes 2.1.9-2.1.10) et vortex brièvement à basse vitesse pour mélanger.
   3. Échelonner chaque ajout de 30 s et incuber pendant 15 min. Pour conserver un échantillon pour la détermination des protéines, transférer une autre aliquote d’hépatocytes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et tourner à 3 000 x g pendant 5 min.
      REMARQUE: Lors de la distribution, la suspension d’hépatocytes doit être continuellement tourbillonnée ou agitée doucement avec la pipette de distribution de 1 mL pour éviter la sédimentation et la grande variabilité du nombre de cellules entre les échantillons.
   4. Retirer le surnageant et conserver la pastille à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à mesurer la quantité totale de protéines dans l’échantillon afin de normaliser les résultats (figure 3).
   5. Pendant que les hépatocytes sont en pré-incubation à 37 °C, ajouter le complexe radioactif BSA: acide palmitique au milieu chaud en 2.1.8, et maintenir à 37 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à déclencher les réactions. Il s’agit du mélange final de substrats.
   6. Pour commencer les réactions, retirez les hépatocytes du bain-marie et ajoutez 500 μL de mélange de substrat.
   7. Vortex à basse vitesse pendant 5 s pour remettre complètement en suspension les cellules et retourner au bain-marie. Répétez avec tous les échantillons, en échelonnant de 30 s.
   8. Incuber pendant 15 min. Commencez un ensemble de réactions et arrêtez-vous immédiatement (voir les étapes 2.2.10 à 2.2.11) pour déterminer la radioactivité de fond (tableau 2).
   9. Transférer les aliquotes en double (200-250 μL) du mélange de substrat restant dans des flacons de scintillation de 6 mL et réserver pour compter. Utilisez ces comptes pour calculer la radioactivité correspondant aux nmoles totaux d’acide palmitique disponibles pour l’oxydation dans 500 μL de mélange de substrat.
   10. Pour arrêter les réactions, retirez les hépatocytes du bain-marie, remettez les hépatocytes en vortex à vitesse modérée, puis transférez 400 μL de la suspension d’hépatocytes dans les tubes de microcentrifugation contenant de l’acide perchlorique.
   11. Boucher immédiatement les tubes. Répétez cette séquence pour tous les échantillons, en échelonnant de 30 s.
   12. Vortexer vigoureusement les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et les faire tourner vers le bas des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à 13 000 x g pendant 10 min.
   13. Transférer 300 μL du surnageant dans un flacon de scintillation de 6 mL, ajouter 4 mL de liquide de scintillation et compter la radioactivité dans les échantillons et les aliquotes du mélange de substrat (étape 2.2.9) dans un compteur de scintillation.
       ATTENTION : Après centrifugation, ouvrez les tubes sous une hotte pour éviter de respirer le ¹⁴C-CO₂ produit par l’oxydation complète du ¹⁴C-acétyl-CoA généré par l’acide gras β-oxydation et libéré par les conditions acides.

Tableau 1 : Tampons, milieux et autres solutions nécessaires à l’isolement des hépatocytes et au dosage de la β-oxydation des acides gras

Tableau 2 : Exemple de configuration expérimentale pour une suspension hépatocytaire dosée en triple exemplaire en présence et en l’absence d’étomoxir.

La perfusion hépatique décrite ici donne généralement 30 à 40 millions de cellules/foie avec une viabilité moyenne de 80 %, telle qu’estimée par l’exclusion du bleu de trypan (Figure 2). La concentration typique de glucose dans le tampon Krebs-Henseleit (KHB), qui est utilisé pour préparer les tampons de perfusion 1 et 2, est de 11 mM. Lors de la mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes isolés de souris à jeun, la concentration de glucose dans le KHB peut être abaissée pour mieux représenter l’état à jeun. Comme le montre la figure 2, l’abaissement de la concentration de glucose à 5,6 mM n’a aucun effet négatif sur le rendement ou la viabilité des hépatocytes.

Le tableau 2 montre une configuration expérimentale typique pour une suspension d’hépatocytes dosée en triple exemplaire en présence et en l’absence d’étomoxir, un puissant inhibiteur de la CPT1 et donc de l’oxydation mitochondriale des acides gras10,13. En présence de cet inhibiteur ou d’autres inhibiteurs de l’oxydation des acides gras mitochondriaux, tout produit résiduel marqué 14C généré par l’oxydation de l’acide palmitique [1-14C] peut être attribué au premier cycle de β-oxydation dans les peroxysomes. Ainsi, la contribution de l’oxydation des acides gras mitochondriaux à l’oxydation totale des acides gras β peut être calculée comme la différence entre l’oxydation totale (-étomoxir) et peroxysomale (+ étomoxir) 7,14,15 (Figure 3).

Pour les hépatocytes, plus de 95% de la radioactivité associée aux produits de la β-oxydation de l’acide [1-14C]palmitique se trouve dans l’ASM, et le reste est libéré sous forme de 14C-CO210. Les comptes par minute (CPM) associés à la radioactivité de fond varient avec le lot d’acide [1-14C]palmitique. Cependant, ils sont encore significativement inférieurs au CPM obtenu dans les échantillons autorisés à incuber avec le mélange de substrat pendant 15 min (Figure 3A). Comme prévu, les hépatocytes isolés de souris à jeun montrent une forte augmentation des taux de β-oxydation des acides gras mitochondriaux et peroxysomaux, ce qui correspond à l’activation connue de ces voies 16,17,18,19.

Figure 2 : Viabilité et rendement des hépatocytes isolés à l’aide de la procédure décrite ici. Les hépatocytes ont été isolés chez des souris mâles nourries ad libitum ou à jeun pendant la nuit pendant 16 à 18 heures, avec un accès libre à l’eau. (A) Viabilité des hépatocytes et (B) rendement par foie. Les données sont rapportées comme la moyenne (barres) des mesures sur des préparations individuelles d’hépatocytes (cercles) ± SEM. Les hépatocytes isolés de souris nourries et à jeun ont été comparés à l’aide d’un test t de Student à deux queues non apparié. * p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Capacité d’oxydation β des acides gras dans les hépatocytes isolés de souris mâles nourries et à jeun et dosés en suspension. Les hépatocytes fraîchement isolés ont été pré-incubés avec de l’étomoxir (45 μM, +Eto) ou du DMSO (véhicule, -Eto) avant l’ajout du mélange de substrat. (A) CPM total introduit dans chaque essai et récupéré dans la fraction ASM des réactions mises en place pour estimer la radioactivité de fond, la radioactivité totale (-Eto), le peroxysomique (+Eto) et l’β-oxydation des acides gras mitochondriaux. Ces données sont présentées avant toute correction (pour le fond, le nombre de cellules ou les niveaux de protéines) ou tout autre calcul. (B) Données en (A) corrigées pour le fond, le volume total du test, normalisé à 1 million de cellules viables et exprimé comme la vitesse à laquelle l’acide palmitique est oxydé dans les hépatocytes isolés de souris nourries et à jeun. (C) Protéines totales correspondant aux quelque 750 000 hépatocytes/dosage utilisés. (D) Données en (A) corrigées comme en (B) mais normalisées en mg de protéines. Les données sont rapportées comme la moyenne (barres) des mesures sur des préparations individuelles d’hépatocytes (cercles) ± SEM. Les hépatocytes isolés de souris nourries et à jeun ont été comparés à l’aide d’un test t de Student à deux queues non apparié. * p < 0,05; ** p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.