La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique essentielle responsable de la génération d’énergie dans de nombreux types de cellules, y compris les hépatocytes. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer l’oxydation β des acides gras dans des hépatocytes primaires fraîchement isolés en utilisant de l’acide palmitique marqué 14C.
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Article de méthode
Mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes de souris fraîchement isolés
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique clé pour répondre aux besoins énergétiques du foie et fournir des substrats et des cofacteurs pour des processus supplémentaires, tels que la cétogenèse et la gluconéogenèse, qui sont essentiels pour maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps et soutenir la fonction extra-hépatique des organes à jeun. La β-oxydation des acides gras se produit dans les mitochondries et les peroxysomes et est régulée par de multiples mécanismes, y compris l’absorption et l’activation des acides gras, les niveaux d’expression enzymatique et la disponibilité de cofacteurs tels que la coenzyme A et le NAD +. Dans les essais qui mesurent la β-oxydation des acides gras dans les homogénats hépatiques, la lyse cellulaire et l’ajout commun de niveaux supraphysiologiques de cofacteurs masquent les effets de ces mécanismes de régulation. De plus, l’intégrité des organites dans les homogénats est difficile à contrôler et peut varier considérablement d’une préparation à l’autre. La mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes primaires intacts surmonte les pièges ci-dessus. Ce protocole décrit une méthode de mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés incubés avec de l’acide palmitique marqué 14C. En évitant les heures à les jours de culture, cette méthode a l’avantage de mieux préserver les niveaux d’expression des protéines et l’activité de la voie métabolique du foie d’origine, y compris l’activation de l’β-oxydation des acides gras observée dans les hépatocytes isolés de souris à jeun par rapport aux souris nourries.
Introduction
La β-oxydation des acides gras est un processus essentiel dans le métabolisme des lipides, fournissant une voie catabolique pour équilibrer la synthèse des acides gras et l’apport de l’alimentation. Ce processus génère de l’énergie pour plusieurs organes, y compris le muscle cardiaque, le cortex rénal et le foie à jeun, et utilise les acides gras obtenus à partir de l’alimentation, la lipolyse du tissu adipeux et les réserves internes de triglycérides 1,2.
L’oxydation des acides gras par la voie β-oxydation entraîne le raccourcissement séquentiel de la chaîne acylique grasse par deu....
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Protocole
Toutes les procédures expérimentales sur des souris (C57BL/6J, mâles, âgés de 9 à 11 semaines) ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Virginie-Occidentale.
1. Isolement des hépatocytes
- Préparation
- Dans les jours précédant l’isolement des hépatocytes, préparer les tampons et les milieux de culture cellulaire énumérés dans le tableau 1. Installez un bain-marie dont la température est réglée à 37 °C près de l’endroit où la chirurgie sera effectuée.
- Le jour de l’isolement hépatocytaire, sous une hotte à écoulement laminaire....
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Résultats
La perfusion hépatique décrite ici donne généralement 30 à 40 millions de cellules/foie avec une viabilité moyenne de 80 %, telle qu’estimée par l’exclusion du bleu de trypan (Figure 2). La concentration typique de glucose dans le tampon Krebs-Henseleit (KHB), qui est utilisé pour préparer les tampons de perfusion 1 et 2, est de 11 mM. Lors de la mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes isolés de souris à jeun, la concentration de glucose dans le KHB peut être abaissée p.......
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Discussion
Pendant la perfusion hépatique, il est essentiel d’éviter l’introduction de bulles d’air, car elles bloquent les microcapillaires dans le foie, empêchant ou restreignant la circulation tampon et diminuant globalement le rendement en hépatocytes et la viabilité20,21. Des précautions, telles qu’une inspection minutieuse de la conduite d’entrée remplie de tampon avant la canulation de la CIV et éviter de soulever la conduite d’entrée du tube contenant le tampon 1 po.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la subvention R35GM119528 des National Institutes of Health à Roberta Leonardi.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Sel sodique (R)-(+)-étomoxir | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Acide palmitique, 50&ndash ; 60 mCi/mmol, 0,5 mCi/mL | Produits chimiques radiomarqués américains | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, stérile | Corning | 25060CI | |
| 10 µ ; L capillaires/pistons jetables pour pipette à déplacement positif | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 & micro ; L, 200 et micro ; L, et 10 & micro ; Pipettes et pointes | |||
| Pipettes | |||
| Tubes à centrifuger stériles de 50 mL | CellTreat | 229421 | |
| 70 % d’acide perchlorique | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, sans acides gras | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydraté | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Système de filtration, 0.22 &mu ; m Filtre PES, 500 mL, CellTreat | stérile 229707 | ||
| Sulfate de gentamicine | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6,5 mL flacons à scintillation | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hémocytomètre | |||
| Aiguilles hypodermiques 22 G, 1,5 po | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | ||
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Mélange défini de collagénase I et II purifiée avec une concentration moyenne de thermolysine |
| M199 | moyenne MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifugeuse | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Ciseaux de microdissection | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | ||
| Acide palmitique | MilliporeSigma | P0500 | |
| Pénicilline/streptomycine (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Pipette à déplacement positif MR-10, 10 µ ; L | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Centrifugeuse réfrigérée avec inserts pour tubes coniques de 50 mL | Eppendorf | 5810 R | |
| Tubes à essai de culture en polypropylène à fond rond, 14 mL | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Compteur à scintillation | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Bain-marie à secousses, capacité de 30 L | New Brunswick Scientific | ; Modèle G76 | |
| Crépines à cellules stériles, 100 & micro ; m | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Pince à pansement pour le pouce | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Pompe péristaltique à débit variable | Fisher Scientific | 138762 | |
| Bains-marie, 2&ndash ; Capacité de |
Références
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (....
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