Les protocoles de dosage basés sur les cellules de transfert d’énergie de résonance de Förster résolues dans le temps sont décrits pour la quantification simple, spécifique, sensible et robuste du transducteur de signal phosphorylé endogène et de l’activateur de la transcription (STAT) 1/3/4/5/6 dans les lysats cellulaires dans un format de 384 puits.
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Article de méthode
Tests de transfert d’énergie par résonance de Förster à résolution temporelle pour la mesure des protéines STAT phosphorylées endogènes dans les cellules humaines
Dans cet article
Résumé
Résumé
La voie de signalisation Janus kinase (JAK)/transducteur de signal et activateur de transcription (STAT) joue un rôle crucial dans la médiation des réponses cellulaires aux cytokines et aux facteurs de croissance. Les protéines STAT sont activées par la phosphorylation de la tyrosine médiée principalement par les JAG. L’activation anormale des voies de signalisation STAT est impliquée dans de nombreuses maladies humaines, en particulier le cancer et les affections liées au système immunitaire. Par conséquent, la capacité de surveiller la phosphorylation des protéines STAT dans l’environnement de signalisation des cellules natives est importante pour la recherche universitaire et la découverte de médicaments. Les formats de dosage traditionnels disponibles pour quantifier les protéines STAT phosphorylées comprennent le transfert western et le test immuno-enzymatique (ELISA). Ces méthodes hétérogènes sont exigeantes en main-d’œuvre, à faible débit et souvent peu fiables (spécifiques) dans le cas du Western Blotting. Des méthodes homogènes (sans lavage) sont disponibles mais restent coûteuses.
Ici, des protocoles détaillés sont fournis pour la mesure sensible, robuste et rentable dans un format de 384 puits des niveaux endogènes de STAT1 phosphorylés (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) et STAT6 (Y641) phosphorylés dans les lysats cellulaires de cellules adhérentes ou en suspension à l’aide de la nouvelle plate-forme de transfert d’énergie de résonance Förster à résolution temporelle THUNDER (TR-FRET). Le flux de travail pour le test cellulaire est simple, rapide et conçu pour le criblage à haut débit (HTS). Le protocole d’essai est flexible, utilise un échantillon à faible volume (15 μL), ne nécessite qu’une seule étape d’ajout de réactif et peut être adapté aux applications à faible débit et à haut débit. Chaque immunodosage sandwich phospho-STAT est validé dans des conditions optimisées avec des agonistes et des inhibiteurs connus et génère les valeurs attendues de pharmacologie et de facteur Z. Comme les tests TR-FRET sont ratiométriques et ne nécessitent aucune étape de lavage, ils offrent une bien meilleure reproductibilité que les approches traditionnelles. Ensemble, cette série de tests fournit de nouveaux outils rentables pour une analyse plus complète de protéines STAT phosphorylées spécifiques après un traitement cellulaire et le criblage et la caractérisation de modulateurs spécifiques et sélectifs de la voie de signalisation JAK/STAT.
Introduction
La voie de signalisation JAK/STAT joue un rôle clé dans la médiation des réponses cellulaires à diverses cytokines, interférons, facteurs de croissance et molécules apparentées1,2. La liaison de ces ligands à des récepteurs spécifiques de la surface cellulaire entraîne l’activation des JAG, qui à leur tour activent les protéines STAT par phosphorylation de résidus de tyrosine spécifiques. La phosphorylation STAT entraîne leur dimérisation et leur translocation dans le noyau, où ils exercent leur effet sur la transcription des gènes cibles régulés. La famille STAT se compose de sept membres : STAT1, STAT2, STAT....
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Protocole
1. Culture cellulaire
- Maintenir les cellules dans un incubateur et une culture de CO2 humidifié à 37 °C/5 % avec du DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) (cellules HeLa et A431) ou rpmI complété par 15 % de FBS (cellules U266B1). Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 à 80% de confluence, puis essayez-les et passez-les ou utilisez-les pour les essais.
REMARQUE: Les milieux de culture contenaient du rouge phénolique. Aucune famine sérique n’a été effectuée pour aucune lignée cellulaire avant d’effectuer les essais.
2. Titrage du stimulateur ou de l’inhibiteur à l’aide du protocole de d....
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Résultats
Chaque test THUNDER TR-FRET a été validé pharmacologiquement en traitant des cellules adhérentes (HeLa ou A431) ou en suspension (U266B1) avec des activateurs ou des inhibiteurs spécifiques à la voie JAK/STAT, puis en mesurant les niveaux de TAG phosphorylés et totaux spécifiques, le cas échéant. Les essais ont été effectués en format 384 puits en utilisant le protocole de transfert à deux plaques et des conditions de dosage pré-optimisées. La figure 3, la figure 4
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Discussion
Comparé aux méthodes conventionnelles d’analyse des phosphoprotéines telles que le western blotting et les méthodes BASÉES SUR ELISA, le flux de travail pour un test cellulaire THUNDER TR-FRET est simple et rapide, utilise un échantillon à faible volume (15 μL), est conçu pour HTS dans un format 384 puits et se prête parfaitement à l’automatisation. Le protocole d’essai est flexible et peut facilement être adapté aux applications à débit moyen et élevé. Les tests peuvent être exécutés à l’aide d’un protocole de transfert.......
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Déclarations de divulgation
Intérêts concurrents : Jaime Padros, Mireille Caron et Geneviève Chatel sont des employés de BioAuxilium Research, qui fabrique les kits de dosage THUNDER TR-FRET utilisés dans cette étude. De plus, Jaime Padros et Mireille Caron sont actionnaires de BioAuxilium Research. Cela ne modifie pas l’adhésion des auteurs à toutes les politiques de JoVE sur le partage de données et de documents.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microplaque à 96 puits, transparente, à fond plat, polystyrène, traitée par culture tissulaire, stérile | Corning | 3595 | Il s’agit de la plaque pour la culture des cellules lors de l’utilisation du protocole de test à deux plaques. D’autres plaques de culture cellulaire à 96 puits peuvent être utilisées |
| Microplaque à 384 puits, blanche, à faible volume | 6007290 | Il s’agit de la plaque pour la détection TR-FRET lors de l’utilisation des protocoles de test à deux ou une plaques. D’autres plaques blanches à 384 puits de faible volume peuvent être utilisées | |
| Lignée cellulaire A431 | ATCC | CRL-1555 | |
| Joint adhésif pour microplaques | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco' s medium Eagle modifié (DMEM) | Wisent | 319-005-CL ; | THUNDER TR-FRET est compatible avec les milieux de culture contenant du rouge de phénol |
| EnVision Xcite Lecteur de plaques multi-étiquettes | PerkinElmer | 2104-0020A | Les dosages peuvent être effectués sur une variété de lecteurs de plaques équipés de l’option TR-FRET |
| Chlorhydrate d’erlotinib | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon flacons traités pour culture tissulaire | Fisher | 13-680-65 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| Lignée cellulaire HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibiteur 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Agitateur de plaques orbitales | Nombreuses options disponibles | Non applicable | |
| EGF humain recombinant | PeproTech | AF-100-15 | |
| IFN&alpha humain recombinant ; 2b | ProSpec | CYT-460 | |
| IL-4 humaine recombinante | R& D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET est compatible avec les milieux de culture contenant du rouge de phénol |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling | Assay Kit BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay | Kit BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET Kit de dosage de signalisation cellulaire | BioAuxilium Research | KIT-STAT4P-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Kit de dosage de signalisation cellulaire | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Kit de dosage de signalisation cellulaire | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsine/EDTA 0,05 % | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 lignée cellulaire | ATCC | TIB-196 | |
| Eau ultrapure | NA | NA | Utilisation d’eau de qualité Milli-Q (18 M&Omega ;. cm) pour diluer le tampon de lyse et le tampon de détection |
Références
- Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its brea....
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Réimpressions et autorisations
