Article de méthode

Reconstitution de l’activité d’extraction Msp1 avec des composants entièrement purifiés

DOI :

10.3791/62928

⸱

10 août 2021

 , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Toledo

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la reconstitution de l’activité d’extraction msp1 avec des composants entièrement purifiés dans des protéoliposomes définis.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En tant que centre de phosphorylation oxydative et de régulation apoptotique, les mitochondries jouent un rôle vital dans la santé humaine. La fonction mitochondriale appropriée dépend d’un système de contrôle de la qualité robuste pour maintenir l’homéostasie des protéines (protéostasie). Le déclin de la protéostase mitochondriale a été lié au cancer, au vieillissement, à la neurodégénérescence et à de nombreuses autres maladies. Msp1 est une ATPase AAA+ ancrée dans la membrane mitochondriale externe qui maintient la protéostasie en éliminant les protéines mal localisées ancrées dans la queue. En utilisant des composants purifiés reconstitués en protéoliposomes, nous avons montré que Msp1 est nécessaire et suffisant pour extraire une protéine modèle ancrée dans la queue d’une bicouche lipidique. Notre système reconstitué simplifié surmonte plusieurs des barrières techniques qui ont entravé l’étude détaillée de l’extraction des protéines membranaires. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour la génération de liposomes, la reconstitution des protéines membranaires et le test d’extraction Msp1.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fonction cellulaire appropriée dépend d’un processus appelé protéostasie, qui garantit que les protéines fonctionnelles sont à la concentration et à l’emplacement cellulairecorrects 1. Les défaillances de la protéostase entraînent une altération de la fonction des organites et sont associées à de nombreuses maladies neurodégénératives2,3,4. Les protéines membranaires présentent des défis uniques pour le réseau de protéostasie car elles doivent être ciblées sur la membrane correcte tout en évitant l’agrégation des domaines transmembranaires hydrophobes (TMD)5. Par conséquent, des machines spécialisées ont évolué pour protéger le TMD hydrophobe du cytosol et faciliter le ciblage et l’insertion dans la membrane cellulaire appropriée6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Les mitochondries sont le centre métabolique de la cellule et sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que: la phosphorylation oxydative, la génération d’amas fer-soufre et la régulation apoptotique16,17. Ces organites endosymbiotiques contiennent deux membranes, appelées membrane mitochondriale interne (IMM) et membrane mitochondriale externe (OMM). Plus de 99% des 1 500 protéines mitochondriales humaines sont codées dans le génome nucléaire et doivent être transloquées sur une ou deux membranes différentes18,19. La fonction mitochondriale appropriée dépend donc d’un réseau de protéostasie robuste pour corriger toute erreur dans le ciblage ou la translocation des protéines.

Notre laboratoire se concentre sur un sous-ensemble de protéines membranaires mitochondriales appelées protéines ancrées dans la queue (TA), qui ont un seul domaine transmembranaire au terminus C20,21,22,23,24. Les protéines TA sont impliquées dans un certain nombre de processus essentiels, tels que l’apoptose, le transport des vésicules et la translocation des protéines25. La topologie unique des protéines TA nécessite une insertion post-traductionnelle, qui se produit dans le réticulum endoplasmique (ER) par l’entrée guidée des voies DU complexe protéique membranaire (CEM) ancrées dans la queue (GET) ou du réticulum endoplasmique ou dans l’OMM par une voie mal caractérisée20,26,27,28. Les propriétés biophysiques du TMD sont nécessaires et suffisantes pour guider les protéines TA vers la membrane correcte29. La reconnaissance de caractéristiques biophysiques plutôt que d’un motif de séquence défini limite la fidélité des voies de ciblage5. Ainsi, la mauvaise localisation des protéines TA est un stress commun pour les réseaux de protéostasie. Le stress cellulaire, tel que l’inhibition de la voie GET, provoque une augmentation de la mauvaise localisation des protéines à l’OMM et un dysfonctionnement mitochondrial à moins que ces protéines ne soient rapidement éliminées30,31.

Un thème commun dans la protéostasie membranaire est l’utilisation de protéines AAA+(ATPase Associée avec des ctivités cellulaires A)pour éliminer les protéines anciennes, endommagées ou mal localisées de la bicouche lipidique1,32,33,34,35,36,37,38 . Les protéines AAA+ sont des moteurs moléculaires qui forment des anneaux hexamériques et subissent des mouvements dépendants de l’ATP pour remodeler un substrat, souvent par translocation à travers un pore axial étroit39,40. Bien que de grands efforts aient été consacrés à l’étude de l’extraction des protéines membranaires par les AAA+ ATPases, les reconstitutions sont complexes ou impliquent un mélange de lipides et de détergent41,42, ce qui limite le pouvoir expérimental d’examiner le mécanisme d’extraction du substrat de la bicouche lipidique.

Msp1 est une ATPase AAA+ hautement conservée ancrée dans l’OMM et les peroxysomes qui joue un rôle essentiel dans la protéostasie membranaire en éliminant les protéines TA mal localisées43,44,45,46,47. Il a également été récemment démontré que Msp1 soulageait le stress lié à l’importation de protéines mitochondriales en éliminant les protéines membranaires qui calent lors de la translocation à travers l’OMM48. La perte de Msp1 ou de l’homologue humain ATAD1 entraîne une fragmentation mitochondriale, des échecs dans la phosphorylation oxydative, des convulsions, une augmentation des blessures après un accident vasculaire cérébral et une mort prématurée31,49,50,51 ,52,53,54,55,56.

Nous avons montré qu’il est possible de co-reconstituer des protéines TA avec Msp1 et de détecter l’extraction de la bicouche lipidique57. Ce système simplifié utilise des protéines entièrement purifiées reconstituées en liposomes définis qui imitent l’OMM (Figure 1)58,59. Ce niveau de contrôle expérimental peut répondre à des questions mécanistes détaillées d’extraction de substrat qui sont expérimentalement insolubles avec des reconstitutions plus complexes impliquant d’autres protéines AAA +. Ici, nous fournissons des protocoles expérimentaux détaillant nos méthodes de préparation des liposomes, la reconstitution des protéines membranaires et le test d’extraction. Nous espérons que ces détails expérimentaux faciliteront l’étude plus approfondie du processus essentiel mais mal compris de la protéostasie membranaire.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation des liposomes

  1. Combinez les stocks de chloroforme de lipides dans des proportions appropriées pour imiter la membrane mitochondriale externe.
    1. Préparer 25 mg de mélange lipidique. Nous utilisons un mélange précédemment établi de lipides qui imitent les membranes mitochondriales, constitué d’un rapport molaire de 48:28:10:10:4 de phosphatidylcholine (PC), de phosphatidyléthanolamine (PE) d’œuf de poule, de phosphatidyl inositol (PI) du foie bovin, de 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-phospho-L-sérine synthétique (DOPS) et de 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycérol synthétique (TOCL)58,59. Des exemples de calculs sont présentés dans le tableau 1.
    2. Amenez tous les stocks lipidiques à température ambiante avant de les ouvrir, car cela limitera la condensation. Comme la plupart des laboratoires n’ont pas de moyen précis de mesurer la concentration des lipides, toute eau absorbée par le stock de chloroforme modifiera la concentration du stock lipidique et donc le rapport des lipides utilisés dans le test.
    3. Comme les stocks de lipides se présentent dans des ampoules en verre, transférez la quantité requise de lipides dans un flacon en verre à l’aide d’une seringue de 1 mL. Ajouter 2 mg de dithiothréitol (DTT) au flacon pour éviter l’oxydation des lipides. Travaillez rapidement car l’évaporation du chloroforme modifiera la concentration du lipide.
    4. Transférer tout lipide restant dans un flacon en verre séparé et l’adapter à un septa PFTE. Ajouter 2 mg de TNT au flacon, envelopper avec un parafilm et conserver à -20 °C pour éviter l’oxydation des lipides. Essayez d’utiliser les lipides dans les 3 mois suivant le transfert dans les flacons. Pour éviter une contamination potentielle des stocks de chloroforme par le ruissellement des marqueurs, transférez les autocollants des ampoules d’origine aux flacons en verre plutôt que de les étiqueter avec un marqueur.
  2. Évaporer le chloroforme sous un flux d’azote très doux tout en faisant tourner le flacon de verre en continu à la main dans une hotte aspirante, agissant essentiellement comme un rotovap manuel. Faites tourner le flacon à une vitesse constante (20-40 tr/min) à la main pour maintenir les lipides en mouvement. L’objectif est d’évaporer tout le chloroforme et d’obtenir un revêtement uniforme de lipides sur l’ensemble du flacon en verre.
    ATTENTION: Le chloroforme est neurotoxique et cette étape doit être effectuée dans la hotte.
    1. Fixez une pipette Pasteur fraîche au tube d’azote. Ne laissez aucun des lipides s’éclabousser hors du flacon ou sur la pipette Pasteur. Dirigez la pointe au fond du flacon afin que l’air rebondisse sur le fond et pousse les lipides vers le centre du flacon. Obtenez un revêtement uniforme sur tout le flacon tout en évitant toute accumulation dans les coins ou par le bouchon. L’ensemble de ce processus prend environ 5 minutes.
    2. Au fur et à mesure que le mélange s’épaissit en une « perle » de lipides, guidez-le au centre du flacon en changeant l’angle du flacon. Une fois que la perle commence à devenir plus petite, remontez légèrement le flux d’azote pour disperser la perle, en veillant à ce qu’aucun des lipides ne souffle hors du flacon.
  3. Enlevez tout chloroforme restant sous vide.
    1. Placez le flacon en verre sur une pompe à vide ou à membrane pendant 1 heure pour éliminer la majorité du chloroforme résiduel. Ces vides ne sont généralement pas assez forts pour éliminer tout le chloroforme, mais ils peuvent tolérer de petites quantités de solvant mieux que les aspirateurs rotatifs.
    2. Mettre le flacon sous vide (<1 mTorr) pendant 12-16 h pour éliminer tout le chloroforme résiduel. Assurez-vous d’éviter de heurter le flacon pendant ce processus.
  4. Remettre en suspension les lipides dans 1,25 mL de tampon liposome (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 15% glycérol, 1 mM DTT). Comme nous avons commencé avec 25 mg de lipides, il en résulte une concentration de 20 mg / mL. Ressuspendez complètement les lipides sans morceaux visibles. Si les lipides s’accumulent dans le coin du flacon, cela peut être un long processus.
    1. Vortex le flacon vigoureusement jusqu’à ce que l’échantillon soit lisse et laiteux. Nous constatons que si l’évaporation du chloroforme a été faite correctement la nuit précédente, ce processus prend environ 5-10 minutes.
    2. Pour assurer une remise en suspension complète des lipides, tournez sur une roue à température ambiante pendant 3 heures à ~80 tr/min. Retirer le flacon de la roue une fois toutes les heures pendant 1 minute de vortex pour assurer un mélange uniforme.
  5. Transférer soigneusement les lipides dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 mL. Effectuez 5 cycles de congélation-décongélation en utilisant de l’azote liquide pour geler et un bloc thermique de 30 °C pour décongeler. Cette étape aide à convertir les vésicules multilamellaires en vésicules unilamellaires.
  6. Extruder les lipides.
    1. Pendant les cycles de congélation-décongélation, préparez la mini-extrudeuse. Assemblez la mini-extrudeuse avec des supports filtrants de 10 mm et une membrane en polycarbonate de la taille de pores souhaitée (nous utilisons 200 nm). La taille du filtre affectera la taille du liposome, ce qui affectera la concentration de protéines nécessaires à la reconstitution (Étape 2.3).
    2. Placez la mini-extrudeuse sur une plaque chauffante et portez la température de l’extrudeuse jusqu’à 60 °C.
    3. Aspirer les lipides dans une seringue en verre étanche aux gaz de 1 mL et placer soigneusement dans une extrémité de la mini-extrudeuse. Placez la seringue étanche aux gaz vide de l’autre côté de la mini-extrudeuse. Laissez les lipides s’équilibrer à la température de maintien de l’extrudeuse pendant 5 à 10 minutes.
    4. Transférez les lipides dans la seringue alternative en poussant doucement le piston de la seringue remplie. Poussez la solution de la seringue alternative dans la seringue d’origine. Répétez ce processus de va-et-vient 15 fois, de sortequ’au 15ème passage, les lipides se terminent dans la seringue alternative. Surveillez le volume à chaque passage pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites.
  7. Préparer les aliquotes à usage unique des lipides, congeler dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C. Les liposomes sont stables à -80 °C pendant plusieurs mois. Les reconstitutions nécessitent 10 μL de liposomes à la fois (Étape 2.3.4), il est donc pratique de préparer des aliquotes de 10 μL ou 20 μL.

2 Reconstitution de la protéine Msp1 et modèle TA

  1. Préparer le tampon de reconstitution : 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM d’acétate de potassium, 7 mM d’acétate de magnésium, 2 mM de TNT, 10 % de saccharose, 0,01 % d’azoture de sodium, 0,2-0,8 % de Désoxy Big Chaps (DBC).
    1. Optimiser les conditions de reconstitution pour le nouveau lot de liposomes. La concentration de DBC et de biobilles nécessaires à une reconstitution optimale varie en fonction du lot de liposomes utilisé. Pour limiter la variabilité de la préparation à la préparation, utilisez le même lot de DBC pour toutes les expériences. Lorsque vous modifiez beaucoup de DBC, répétez le processus d’optimisation.
    2. Mettre en place une série de reconstitutions avec différentes concentrations de DBC (0,2% - 0,8%) et de biobilles (25 mg - 100 mg) chaque fois qu’un nouveau lot de liposomes est préparé. Il est important de ne pas abaisser le DBC en dessous de la concentration micellaire critique (CMC) d’environ 0,12%. Une fois les conditions optimisées, nous vous recommandons de collecter toutes les données en utilisant les mêmes conditions de préparation et de reconstitution des liposomes.
    3. Mesurer l’efficacité des différentes conditions de reconstitution en utilisant le test d’extraction décrit à l’étape 3.
  2. Préparer des biobilles à une concentration finale de 250 mg/mL.
    1. Peser 2,7 g de biobilles séchées et remettre en suspension dans un tube de centrifugeuse de 50 mL de méthanol à 100 % (environ 45 ml) pour mouiller les billes. Mouillez d’abord les biobilles dans du méthanol pour éviter que l’air ne soit piégé dans les pores des perles. Une fois dans le méthanol, gardez les biobilles humides car tout air piégé par les biobilles modifiera leur capacité à absorber le détergent.
    2. Retirer le méthanol en lavant les billes 8x avec environ 45 mL d’eau ultrapure (18,2 mΩ), ci-après dénommée ddH2O. Perles de granulés en filant à 3 200 x g pendant 1 minute. Décanter le liquide et remettre en suspension dans ddH2O.
    3. Après le lavage, remettre en suspension dans 10 ml de ddH2O avec 0,02% d’azoture de sodium et conserver à 4 °C. Les biobilles peuvent être conservées à 4 °C pendant plusieurs mois. Ce stock est de 250 mg / mL car on suppose que ~ 0,2 g est perdu pendant les étapes de lavage.
  3. Calculer la taille du liposome et le nombre souhaité de molécules de protéine TA et Msp1 par liposome. Cela déterminera la concentration de msp1 et de protéine TA nécessaire à la reconstitution.
    1. Tout d’abord, calculez le nombre de molécules lipidiques par liposome unilamellaire(Ntotal)en utilisant figure-protocol-1 l’équation où d est le diamètre du liposome, h est l’épaisseur de la bicouche et a est la zone du groupe lipidique.
      1. Mesurez le diamètre du liposome par DLS. Dans notre exemple, une valeur de 70 nm pour le diamètre du liposome (d) a été obtenue.
      2. Utilisez une valeur de 5 nm pour h et de 0,71 nm2 pour a, qui est la taille du groupe de tête pour la phosphatidylcholine. Dans cette situation particulière, letotal N est de 37 610.
    2. Ensuite, calculez la concentration molaire du lipide MLipid en utilisant le poids moléculaire moyen des lipides dans le mélange. Dans cet exemple, la concentration de lipides est de 20 mg/mL (Étape 1.4) et le poids moléculaire moyen des lipides est de 810 g/mol (Tableau 1). Il en résulte une valeur de 0,0247 M pour MLipid.
    3. Ensuite, calculez la concentration molaire des liposomes, MLiposome, en utilisant l’équation figure-protocol-2 où M Lipid est la concentration molaire de lipides de l’étape 2.3.2, et Ntotal est le nombre total de lipides par liposome calculé à l’étape 2.3.1. Dans cet exemple, la concentration de 20 mg/mL de liposomes sur le stock est d’environ 660 nM.
    4. Calculer la quantité de protéines Msp1 et TA nécessaires pour une réaction de reconstitution de 100 μL.
      REMARQUE: La concentration finale de lipides dans la reconstitution est de 2 mg / mL, ce qui représente une dilution 10x du stock de liposomes. Cela donne une concentration finale de liposomes de 66 nM. La concentration finale de Msp1 est de 792 nM, ce qui donne une moyenne de 12 copies totales (2 hexamères fonctionnels) par liposome. La concentration finale de la protéine TA est de 660 nM, ce qui donne une moyenne de 10 copies par liposome.
  4. Dans un tube PCR, mélanger ensemble msp1 purifié, protéine TA et liposomes dans un tampon de reconstitution. L’ordre d’addition est le tampon, les protéines et les liposomes durent. Le volume total est de 100 μL. Laissez le mélange reposer sur la glace pendant 10 minutes. Purifier les protéines Msp1 et TA comme décrit précédemment57.
    1. Utilisez la protéine TA modèle bien caractérisée His-Flag-Sumo-Sec22 comme substrat témoin positif lors de l’établissement du test. Cette construction a une étiquette His pour une purification facile, une étiquette 3x-Flag pour la détection par transfert western, un domaine Sumo pour une solubilité accrue et le TMD de la protéine ER-TA Sec22 pour la reconstitution et la reconnaissance par Msp1.
    2. S’assurer que les solutions mères de Msp1 et de la protéine TA sont d’environ 100 μM afin de minimiser l’effet du N-Dodécyl β-D-maltoside (DDM) de la purification de la protéine sur la reconstitution. Le Msp1 purifié est en 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM de chlorure de sodium, 0,1 mM de chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), 0,05 % de DDM alors que la protéine TA purifiée est dans 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM de chlorure de sodium, 10 mM de chlorure de magnésium, 5 mM de β-mercaptoéthanol, 10 % de glycérol, 0,1 % de DDM. Des solutions mères d’environ 100 μM de protéine TA et de monomère Msp1 garantissent que ces composants constitueront < 5 % du volume de reconstitution final, ce qui entraînera une dilution du DDM en dessous du CMC.
  5. Ajouter la quantité désirée de biobilles à l’échantillon pour enlever le détergent.
    1. Coupez l’extrémité d’une pipette p200 à environ 1/8de pouce de diamètre afin que les perles puissent passer à travers la pointe. Vortex le tube de biobilles à fond pour obtenir un mélange uniforme et retirer rapidement le couvercle et pipeter le volume avant que les biobilles ne se déposent. Transférer les biobilles dans un tube PCR vide.
    2. Lorsque la reconstitution a terminé son incubation de 10 minutes sur de la glace, utilisez une pointe de pipette non coupée pour éliminer tout le liquide des biobilles. Transférez ensuite la reconstitution de 100 μL dans le tube avec les biobilles. Cela doit être fait rapidement afin que les biobilles ne piègent pas l’air, ce qui fera flotter les perles.
  6. Laissez la reconstitution tourner sur une roue à ~80 tr/min pendant 16 heures à 4 °C.
  7. Retirer les matières reconstituées des biobilles. Faites une rotation rapide dans un picofuge pour granuler les biobilles, puis utilisez une pointe de pipette non coupée pour transférer le matériau reconstitué dans un tube PCR propre. Répétez ce processus 1 à 2 fois jusqu’à ce qu’il ne reste plus de biobilles dans l’échantillon. Gardez la reconstitution sur la glace.
  8. Pré-dégager le matériau reconstitué pour éliminer toutes les protéines qui n’ont pas réussi à se reconstituer dans les liposomes.
    1. Préparer le tampon d’extraction: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM d’acétate de potassium, 7 mM d’acétate de magnésium, 2 mM de TNT, 100 nM de chlorure de calcium.
    2. Équilibrez les colonnes de spin du glutathion avec le tampon d’extraction selon les instructions du fabricant. Cela implique généralement 3 tours de lavage avec 400 μL de tampon, puis une centrifugation à 700 x g pendant 2 minutes à température ambiante pour éliminer le tampon.
    3. Ajouter 5 μM de chaque chaperon (GST-SGTA et GST-Calmoduline) au matériau reconstitué. Ces chaperons se lieront au TMD de toutes les protéines qui n’ont pas réussi à se reconstituer dans les liposomes. La purification des chaperons a été décrite précédemment6,57.
      REMARQUE: Ces accompagnateurs sont disponibles dans le commerce, mais nous préférons purifier à la maison pour contrôler le coût et la qualité. Les deux protéines sont dans 20 mM Tris pH 7,5, 100 mM de chlorure de sodium et 0,1 mM TCEP, et ont une concentration de stock d’environ 160 μM. SGTA reconnaît les substrats avec un TMD hautement hydrophobe tandis que la calmoduline lie les TMD avec une hydrophobicité modérée6,29. Ensemble, ce cocktail chaperon peut reconnaître une large gamme de substrats.
    4. Ajouter 100 μL de tampon d’extraction au matériau reconstitué, ce qui porte le volume à 200 μL. Ajoutez ceci aux colonnes de spin de glutathion équilibrées. Notez que les colonnes de spin du glutathion fournissent la récupération d’échantillon la plus élevée lorsque le volume de pré-nettoyage est de 200 à 400 μL.
    5. Branchez les colonnes de rotation et faites pivoter à ~80 tr/min à 4 °C pendant 30 minutes pour permettre aux chaperons de se lier à la résine.
    6. Faire tourner les colonnes à 700 x g pendant 2 minutes à température ambiante. L’écoulement est un matériau pré-nettoyé qui est appauvri en protéines agrégées. Conservez le matériau sur la glace et procédez directement au test d’extraction.

3. Essai d’extraction

  1. Préparez les tubes pour l’analyse SDS PAGE. Chaque réaction aura 4 tubes: INPUT (I), FLOW THROUGH (FT), WASH (W) et ELUTE (E).
    1. Ajouter 45 μL d’échantillon de ddH2O au tube INPUT, 40 μL de ddH2O au tube FLOW THROUGH et 0 μL aux tubes WASH et ELUTE.
      REMARQUE: Le meilleur rapport signal / bruit dans ce test est obtenu lorsque les échantillons WASH et ELUTE sont concentrés 5x par rapport aux échantillons INPUT et FLOW THROUGH. En raison des dilutions au cours de l’essai, cela nécessite de prélever 5 μL d’échantillon pour l’échantillon INPUT, 10 μL d’échantillon pour l’échantillon FLOW THROUGH et 50 μL d’échantillon pour les échantillons WASH et ELUTE.
    2. Ajoutez 16,6 μL de tampon de chargement SDS PAGE 4x à chaque tube. Le volume total de chaque échantillon est de 50 μL avant le tampon de chargement SDS PAGE. Le volume final est de 66,6 μL (échantillon de 50 μL + 16,6 μL de tampon de chargement 4x SDS PAGE).
  2. Assemblez le test d’extraction.
    1. Préparer la réaction d’extraction contenant 60 μL de protéoliposomes pré-nettoyés, 5 μM de GST-SGTA, 5 μM de GST-Calmoduline et 2 mM d’ATP. Combinez tous les réactifs à l’exception de l’ATP, qui est utilisé pour initier la réaction. Porter à un volume final de 200 μL avec le tampon d’extraction.
      REMARQUE: Comme 60 μL d’échantillon sont utilisés pour chaque essai d’extraction, une reconstitution peut être utilisée pour trois essais d’extraction différents. Effectuer des contrôles positifs et négatifs (+ATP et -ATP) sur le matériau issu de la même reconstitution.
    2. Essai d’extraction préchauffé dans un bloc chauffant à 30 °C pendant 2 minutes.
  3. Initiez le test d’extraction en ajoutant de l’ATP à la concentration finale de 2 mM et en accélérant le démarrage.
    1. Donnez un tour de 5 secondes dans un picofuge pour mélanger l’ATP dans la réaction. Incuber la réaction à 30 °C pendant 30 minutes.
    2. Pendant l’incubation, prendre 5 μL de la réaction et ajouter au tube INPUT. Le calendrier est flexible.
    3. Pendant cette période d’incubation, équilibrez une colonne de spin de glutathion pour chaque échantillon du test d’extraction.
  4. Effectuez une traction sur les chaperons pour isoler le matériel extrait.
    1. Une fois l’incubation de 30 minutes terminée, ajoutez 200 μl de tampon d’extraction au tube pour porter le volume total à 400 μL. Ajouter à la résine de glutathion équilibrée et laisser se lier sur la roue à 4°C pendant 30 minutes.
    2. Faites tourner les colonnes à 700 x g pendant 2 minutes à température ambiante pour recueillir le flux. Prendre 10 μL pour le tube FLOW THROUGH. Cet échantillon contient des substrats qui sont encore intégrés dans la bicouche lipidique.
    3. Lavez la résine deux fois avec 400 μL de tampon d’extraction, en éliminant le flux. Lors du troisième lavage, maintenez le débit et prenez 50 μL pour le tube WASH.
    4. Préparer 5 mL de tampon d’élution en ajoutant du glutathion réduit à une concentration finale de 5 mM dans le tampon d’extraction. Préparez ce tampon frais à chaque fois.
    5. Ajoutez 200 μL de tampon d’élution à la colonne de spin. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Tourner à 700 x g pendant 2 minutes à température ambiante pour éluer. Gardez le flux à travers. Répétez le processus une deuxième fois pour que le volume total d’élution soit de 400 μL.
    6. Prélever 50 μL d’échantillon de l’échantillon Elution et l’ajouter au tube ELUTE.
  5. Analysez l’activité d’extraction à l’aide de SDS-PAGE et de Western Blot.
    REMARQUE: Comme un transfert western est une procédure assez standard, un protocole de base est fourni qui met en évidence quelques-uns des détails uniques à ce test.
    1. Chargez les échantillons dans un gel de polyacrylamide sans tache (4% d’empilement, 15% de séparation) et faites fonctionner à 200 V pendant 50 minutes dans un tampon tris-glycine. Si l’espace le permet, utilisez à la fois une échelle non colorée et une échelle tachée pour permettre la visualisation sur l’imageur de gel sans tache et le transfert sur la membrane PVDF respectivement. Le gel sans tache permet une visualisation quantitative des protéines contenant du tryptophane lors de l’activation avec la lumière ultraviolette, tout en permettant au gel d’être utilisé pour un transfert western.
    2. Imagez le gel sans tache pour confirmer qu’il y a une charge égale dans tous les échantillons. Il s’agit d’un contrôle essentiel qui garantit que tout changement de signal détecté par transfert western n’est pas le résultat d’une charge protéique variable. Il ne devrait y avoir que des bandes visibles pour les accompagnateurs (GST-calmoduline et GST-SGTA) dans les échantillons INPUT et ELUTION. Rappelons que l’échantillon ELUTE sera plus concentré que l’échantillon INPUT.
    3. Assemblez une cassette western blot à l’aide d’une membrane PVDF de 45 μm. Transfert à un courant constant de 300 mA pendant 60 minutes.
    4. Après avoir bloqué la membrane, liez à l’anticorps primaire pendant 16 h à 4 °C en secouant doucement ~ 15 tr / min. Éponge pour substrat avec l’Anti-FLAG de lapin à une dilution de 1:1 000.
      REMARQUE: Les anticorps primaires et secondaires utilisés seront spécifiques au substrat et la concentration à utiliser devra peut-être être optimisée.
    5. Laver la membrane et incuber avec un anticorps secondaire, anti-lapin de chèvre à une dilution de 1:10 000, en agitant doucement pendant 1 heure à température ambiante.
    6. Laver la membrane et l’image pour analyse à l’aide de l’agent de détection western blotting.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour interpréter correctement les résultats, le gel sans tache et le western blot doivent être vus ensemble. Le gel sans tache assure une charge égale sur tous les échantillons. Lors de la visualisation du gel sans taches, les accompagnateurs (GST-calmoduline et GST-SGTA) seront visibles dans les voies INPUT (I) et ELUTE (E). Vérifiez que l’intensité de ces bandes est uniforme dans tous les échantillons INPUT. De même, assurez-vous que l’intensité est uniforme dans les échantillons ELUTE. L’ELUTE est 5x plus concentré qu...

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Discussion

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Le bon fonctionnement mitochondrial dépend d’un système robuste de contrôle de la qualité des protéines. En raison des limites inhérentes à la fidélité des voies de ciblage de la protéine TA, les protéines TA mal localisées sont une source constante de stress pour les mitochondries. Un composant clé du réseau de protéostasie mitochondriale est Msp1, qui est une ATPase AAA+ ancrée dans la membrane qui élimine les protéines TA mal localisées de l’OMM. Ici, nous avons décrit comment préparer des protéoliposomes, co-reconsti...

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Remerciements

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MLW a développé une partie de ce protocole pendant ses études postdoctorales avec le Dr Robert Keenan à l’Université de Chicago.

Ce travail est financé par la subvention NIH 1R35GM137904-01 à MLW.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BiobillesBio-Rad1523920
Phosphatidyl inositol de foie bovinAvanti840042CPI
Phosphatidylcholine d’oeuf de pouleAvanti840051C
PC Phosphatidyléthanolamine d’oeuf de pouleAvanti840021CPE
ECL Select réactif de détection western blotGERPN2235
Supports de filtreAvanti610014
Flacon en verreVWR60910L-1
Colonne de centrifugation au glutathionThermo FisherPI16103
Chèvre anti-lapinThermo FisherNC1050917
Mini-extrudeuseAvanti610020
Membrane polycarbonateAvanti610006200 nM
membrane PVDFThermo Fisher8851845 & micro ; M
Rabbit anti-FLAGSigma-AldrichF7245
Synthétique 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-sérineAvanti840035CDOPS
Synthétique 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycérolAvanti710335CSeringue TOCL
, 1 mLNorm-Ject53548-001
Seringue, 1 mL, étanche auxgazAvanti610017

Références

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Mots-clés

Reconstitution de prot inesAAA ATPaseprot ostasie mitochondrialeg n ration de liposomesextraction de prot ines membranairesprot ines ancrage terminalcolonnes de centrifugation au glutathioneanalyse par SDS PAGEWestern Blot

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