Fabrication microfluidique de microcapsules noyau-coquille transportant des sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Cet article décrit l’encapsulation de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) à l’aide d’un dispositif de focalisation à flux coaxial. Nous démontrons que cette technologie d’encapsulation microfluidique permet la formation efficace de sphéroïdes hPSC.

Résumé

Les cultures tridimensionnelles (3D) ou sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) offrent les avantages d’une différenciation améliorée et d’une évolutivité améliorée. Dans cet article, nous décrivons une stratégie pour la formation robuste et reproductible de sphéroïdes hPSC où un dispositif de focalisation d’écoulement coaxial est utilisé pour piéger les hPSC à l’intérieur de microcapsules noyau-coque. La solution de base contenait une suspension unicellulaire de CSEh et a été rendue visqueuse par l’incorporation de poly(éthylène glycol) (PEG) de haut poids moléculaire et de milieux de gradient de densité. Le flux de coquille composé de maléimide de bras PEG-4 ou PEG-4-Mal et s’écoulait le long du flux de noyau vers deux jonctions pétrolières consécutives. La formation de gouttelettes s’est produite à la première jonction d’huile avec une solution de coquille s’enroulant autour du noyau. La réticulation chimique de la coquille s’est produite au deuxième carrefour d’huile en introduisant un réticulant di-thiol (1,4-dithiothréitol ou DTT) dans ces gouttelettes. Le réticulant réagit avec les groupes fonctionnels de maléimide via la chimie du clic, ce qui entraîne la formation d’une coquille d’hydrogel autour des microcapsules. Notre technologie d’encapsulation a produit des capsules de 400 μm de diamètre à raison de 10 capsules par seconde. Les capsules résultantes avaient une coquille d’hydrogel et un noyau aqueux qui permettaient aux cellules individuelles de s’assembler rapidement en agrégats et de former des sphéroïdes. Le processus d’encapsulation n’a pas eu d’effet négatif sur la viabilité des CSH, avec une viabilité de >95 % observée 3 jours après l’encapsulation. À titre de comparaison, les CSEh encapsulés dans des microparticules de gel solide (sans noyau aqueux) n’ont pas formé de sphéroïdes et avaient une viabilité de <50% 3 jours après l’encapsulation. La formation de sphéroïdes de CSEh à l’intérieur des microcapsules noyau-enveloppe s’est produite dans les 48 heures suivant l’encapsulation, le diamètre du sphéroïde étant fonction de la densité d’inoculation cellulaire. Dans l’ensemble, la technologie d’encapsulation microfluidique décrite dans ce protocole était bien adaptée à l’encapsulation des HSPC et à la formation de sphéroïdes.

Introduction

Il existe un intérêt considérable pour les cultures 3D de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) en raison de l’amélioration de la pluripotence et du potentiel de différenciation offerts par ce format^{de culture 1,2,3}. Les cSEh sont généralement formés en sphéroïdes ou en d’autres formats de culture 3D au moyen de bioréacteurs, de micropuits, d’hydrogels et d’échafaudages polymères ^4,5,6. L’encapsulation offre un autre moyen d’organiser des hPSC simples en sphéroïdes. Une fois....

Protocole

1. Fabrication de l’appareil

1. Réalisez les conceptions du dispositif de microencapsulation et du dispositif de dissociation à l’aide du logiciel de CAO^10,11.
2. Spin-coat les trois couches de résine photosensible SU-8 séquentiellement sur une plaquette de silicium (Figure 2A) pour obtenir des structures avec les hauteurs souhaitées: 60, 100 et 150 μm.
   REMARQUE: Le processus pour les moules supérieur et inférieur est identique.
   1. Spin coat une plaquette de silicium propre de 10 cm avec la résine photosensible négative SU-8 2025 à 1 100 tr/min pour créer la ....

Résultats

En suivant le protocole mentionné ci-dessus, le lecteur sera en mesure de fabriquer des dispositifs microfluidiques et de produire des microcapsules porteuses de cellules. La figure 3A montre des exemples de microcapsules optimales et sous-optimales fabriquées à l’aide de la génération de gouttelettes microfluidiques. Différentes formulations de PEG-4-Mal ont donné lieu à des capsules de morphologies variables - les capsules ridées étaient associées à une mauvaise gélification, à une faible .......

Discussion

Le processus d’encapsulation décrit ici entraîne la formation reproductible de sphéroïdes hPSC. Le format microcapsule facilite la distribution de sphéroïdes dans les puits d’une plaque de microtitrage pour des expériences visant à améliorer / optimiser les protocoles de différenciation ou à tester des thérapies. Les sphéroïdes de cellules souches encapsulés peuvent également être utilisés dans des cultures en suspension où l’enveloppe d’hydrogel protège les cellules contre les dommages induits par le cisaillement

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 et micro ; m Filtres pour seringue	Genesee Scientific	25-244
1 ml seringue luer-lock tip	BD	309628
1x DPBS	Corning	23220003
4 bras PEG maleimide, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
Seringue de 5 ml Luer-Lock Tip	BD	309646
6-WELL NON-TREATED PLATE	USA Scientific	CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack Aquapel	Glass Treatment	47100
Logiciel de CAO	Autodesk	AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µ ; m taille des pores	cardinal	335583
Chlorotriméthylsilane	Aldrich	386529-100mL
Countess II FL Compteur de cellules automatisé	Technologie de vie	A27974
Plaque chauffante numérique	Plaque
Mélangeur vortex numérique	Fisher Scientific	215370
Eau distillée	Gibco	15230-162
Dithiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM/F12 média	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Tubes de centrifugation coniques	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifugeuse	live	13-100-675
HERACELL VIOS 160i Incubateur CO2	Thermo Scientific	50144906
Microscope motorisé à fluorescence inversée	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin Coaters	Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Kit de coloration de mammifères vivants/morts	Fisher	L3224
Ruban magique	Agrafes	483535
Micro Tube médical (0,015 » D.I. x 0,043 » D.E.)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE/2
Micro barre	d’agitation Daigger Scientific	EF3288E
MilliporePince à filtre Sigma	Fisher scientific	XX6200006P
Huile minérale	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Milieu basal	STEMCELL TECHNOLOGY	85850
Aiguilles-Acier inoxydable  ; Calibre 14	Alimentation CML	901-14-025
Aiguilles-Acier inoxydable  ; Calibre 15	Alimentation CML	901-15-050
OptiPrep	STEMCELL TECHNOLOGY	7820
Four	Thermo Scientific	HERA THERM Four
Pénicilline :Streptomycine (10 000 U/mL Pénicilline G, 10mg/mL Streptomycine)	Gemini	400-109
Petri Plat 150X20 Évent Stérile	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Système de nettoyage au plasma	Yield Engineering System, Inc.	YES-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poly(éthylène glycol) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
Aiguille PrecisionGlide 27G	BD	305109
Inhibiteur de roche Y-27632 dihydrocloride	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Plaquette de silicium 100mm	University Wafer	452
Verre à lames (75 mm et aigu ; 25 mm)	CardinalHealth	M6146
Span 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0,22 & micro ; m)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku Advanced Materials	Y111069 0500L1GL
SU-8 développeur	Kayaku Advanced Materials	Y020100 4000L1PE
Conception chirurgicale Royaltek Lames de scalpel chirurgical en acier inoxydable	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Kit d’élastomère de silicone (PDMS)	Dow Corning	2065622
Pompe à seringue	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Triéthanolamine	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tube Tygon (0,02 » D.I. x 0,06 » D.E.)	Cole-Parmer	06419-01
Tube Tygon (0,04 » D.I. x 0,07 » D.E.)	Cole-Parmer	06419-04
Nettoyeur à ultrasons FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Dessiccateur sous vide	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stéréomicroscope 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
&mu ; Enregistreur laser PG 101	Heidelberg Instruments	HI 1128