Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

La méthylation de l’ADN est une marque épigénétique importante qui régule l’expression des gènes et la structure de la chromatine. La méthylation se produit principalement dans les dinucléotides CpG - cytosine suivie de guanosine; Le groupe méthyle est ajouté à la position 5 de la cytosine. Des schémas de méthylation corrects de l’ADN, et donc une expression génique appropriée, sont nécessaires pour un développement et une fonction cellulaires appropriés. De nombreux états pathologiques ont été associés à des modifications du schéma normal de méthylation ^1,2,3. Par exemple, il existe un lien entre l’initiation et la progression du cancer et les altérations du schéma de méthylation de l’ADN. En règle générale, les cellules cancéreuses présentent des niveaux globaux plus faibles de méthylcytosine, ce qui contribue à l’instabilité du génome. Dans le même temps, la méthylcytosine présente dans le génome est concentrée dans les régions promotrices des gènes suppresseurs de tumeurs, ce qui conduit au silençage génique de ces protéines importantes. Notamment, les changements épigénétiques sont dynamiques et réversibles, contrairement aux mutations de l’ADN associées à la tumorigenèse. Cela a rendu les protéines impliquées dans la régulation des gènes épigénétiques intéressantes^{cibles médicamenteuses 2,4}.

Les ADN méthyltransférases (DNMT) sont les protéines responsables de la génération et du maintien des schémas de méthylation de l’ADN. Trois isoenzymes catalytiquement actifs, DNMT1, DNMT3a et DNMT3b, existent chez l’homme. Au cours du développement et de la différenciation, les méthyltransférases de novo, DNMT3a et DNMT3b, établissent des schémas de méthylation. Les deux enzymes peuvent lier la protéine DNMT3L catalytiquement inactive pour former des complexes qui présentent une activité accrue ^1,5. Après la division cellulaire, les cellules filles contiennent de l’ADN hémiméthylé – de l’ADN contenant de la méthylcytosine dans un seul brin du duplex – parce que l’ADN nouvellement synthétisé est dépourvu de marques de méthylation. La fonction principale de DNMT1 est de méthyler cet ADN hémiméthylé, rétablissant ainsi le schéma de méthylation complet ^1,5.

Les liens entre l’activité DNMT et le cancer sont bien établis. La surexpression de DNMT1, que ce soit par des mécanismes transcriptionnels ou post-traductionnels, est une conséquence de plusieurs voies oncogéniques courantes 6,7,8,9. Les approches génétiques visant à réduire l’activité de DNMT1 à l’aide d’allèles hypomorphiques entraînent une diminution de la formation tumorale chez les souris Apc^(Min)10. Les oligonucléotides antisens qui neutralisent DNMT1 inhibent la néoplasie dans la culture cellulaire et les modèles tumoraux^{de souris 11,12}. Ainsi, l’inhibition de l’activité DNMT1 semble être une approche prometteuse de traitement du cancer. Cependant, les rôles que jouent les isoenzymes DNMT3 ne sont pas si simples. Les mutations DNMT3a sont retrouvées dans la leucémie myéloïde aiguë¹³ et le syndrome myélodysplasique¹⁴. Il a été démontré qu’au moins une des mutations identifiées diminue l’activité de méthylation de l’ADN de l’enzyme¹⁵. Cependant, DNMT3b est surexprimé dans le cancer du sein¹⁶ et le cancer colorectal¹⁷. Les différents isoenzymes DNMT jouant différents rôles dans la cancérogenèse, l’identification des inhibiteurs spécifiques de l’isozyme sera essentielle. Non seulement ces composés seront utiles pour le développement de produits thérapeutiques, mais les inhibiteurs spécifiques à l’isozyme seraient également un outil précieux pour disséquer le rôle de chaque isozyme DNMT dans l’étiologie du cancer.

Plusieurs inhibiteurs de DNMT ont été rapportés dans la littérature. Les inhibiteurs connus de la DNMT peuvent être divisés en deux classes : nucléosidiques et non nucléosidiques. Les inhibiteurs nucléosidiques sont généralement des analogues de la cytidine. Ces composés sont incorporés dans l’ADN et piègent par covalence les DNMT. La 5-azacytidine et la 5-aza-2'-désoxycytidine ont été approuvées pour le traitement du syndrome myélodysplasique et de la leucémie myéloïde aiguë ^4,18. La toxicité élevée, la faible biodisponibilité et l’instabilité chimique de ces composés posent des problèmes. Les travaux en cours examinent l’efficacité de la prochaine génération d’inhibiteurs nucléosidiques; SGI-110, dérivé de la 5-aza-2'-désoxycytidine, en est un exemple^19,20. Les inhibiteurs nucléosidiques ne sont pas spécifiques à l’isozyme et inactiveront tout isozyme DNMT rencontré. Par conséquent, le traitement avec un agent déméthylant des nucléosides entraîne l’épuisement de tous les isoenzymes DNMT ^4,18. Les inhibiteurs non nucléosidiques n’ont pas besoin d’être incorporés dans l’ADN pour exercer leurs effets inhibiteurs. Au lieu de cela, ces molécules se lient directement aux DNMT, introduisant la possibilité d’une inhibition spécifique de l’isozyme. Plusieurs inhibiteurs non nucléosidiques ont été découverts à ce jour, notamment SGI-1027 21, hydralazine²², procaïnamide 23, RG108 et dérivés 24, et des produits naturels, (−)-épigallocatéchine 3-gallate (EGCG)25 et acide laccaïque A^26,27. La plupart des inhibiteurs non nucléosidiques découverts à ce jour ne sont pas isozymes-sélectifs ou présentent de faibles préférences pour un isozyme DNMT. De plus, la puissance de ces molécules doit être améliorée, en particulier dans les cellules ^4,18. Il est donc nécessaire de découvrir ou de développer des inhibiteurs de DNMT isozymes-sélectifs plus puissants.

Un obstacle à la découverte de nouvelles petites molécules inhibitrices de DNMT est les tests laborieux traditionnellement utilisés pour examiner l’activité DNMT²⁸. Les tests sont généralement discontinus avec plusieurs étapes. L’activité enzymatique des DNMT est encore systématiquement dosée à l’aide de S-adénosylméthionine (SAM) radioactive29,30,31,32,33,34. Des tests non radioactifs pour la méthylation de l’ADN ont également été développés. Par exemple, des essais utilisant des endonucléases de restriction méthylsensibles et l’électrophorèse pour séparer les produits de digestion ont été décrits^35,36. Ces types de tests discontinus en plusieurs étapes ne se prêtent pas facilement à la découverte de médicaments. Depuis le milieu des années 2000, plusieurs tests de méthylation de l’ADN avec un débit plus élevé ont été développés²⁸. Un test de proximité par scintillation a été utilisé pour dépister les inhibiteurs de DNMT1³⁷. Un autre essai utilisant une endonucléase de restriction méthylsensible a été utilisé pour dépister les inhibiteurs de DNMT3a^25,38. Bien que les deux essais aient permis un débit plus élevé que les tests traditionnels de méthylation de l’ADN, les essais nécessitent plusieurs étapes et ne permettent pas d’observer l’activité de méthylation en temps réel. Plus récemment, un essai cinétique continu a été décrit qui couple la formation de S-adénosylhomocystéine (SAH), un produit de la réaction de méthylation, au changement spectroscopique à 340 nm associé à l’oxydation du NADPH³⁹. Ce test utilise trois enzymes de couplage pour générer un signal spectroscopique.

Nous avons développé un test de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase basé sur la fluorescence qui utilise une seule enzyme de couplage disponible dans le commerce et peut générer des données en temps réel (Figure 1). Un oligonucléotide en épingle à cheveux contenant trois méthylcytosines est utilisé comme substrat. L’ADN du substrat contient un fluorophore à l’extrémité 5' et un quencher à l’extrémité 3'. La méthylation du site CpG hémiméthylé génère le site de clivage de l’endonucléase Gla I — GCGC entièrement méthylée. Le clivage Gla I de l’oligonucléotide produit libère le fluorophore de l’anti-quencher et génère une fluorescence en temps réel. Le test peut être utilisé pour examiner l’activité de toute isoforme de DNMT; cependant, une activité plus élevée est observée avec DNMT1 car cet isozyme méthyle préférentiellement l’ADN hémiméthylé ^1,5. Une activité encore plus robuste est observée si le domaine autoinhibiteur de la séquence de ciblage des foyers de réplication (RFTS) est supprimé de DNMT1. Ce domaine, trouvé dans la région régulatrice N-terminale, se lie au site catalytique et empêche la liaison à l’ADN. L’élimination des premiers ~600 acides aminés donne une enzyme tronquée qui est significativement plus active que l’enzyme pleine longueur (~640 fois plus de k_cat/K_m)⁴⁰. Cette forme activée de l’enzyme, appelée DNMT1 dépourvu de RFTS (acides aminés 621-1616), permet d’identifier plus facilement les inhibiteurs en raison de son pouvoir catalytique accru. Cet article présente un protocole d’utilisation du DNMT1 dépourvu de RFTS dans les tests de dépistage des inhibiteurs potentiels de petites molécules. À l’aide du test continu couplé à l’endonucléase, la vitesse initiale est déterminée en présence et en l’absence de quelques petites molécules. Chaque inhibiteur potentiel est examiné à deux concentrations pour rechercher une inhibition du DNMT1 dépendante de la concentration. Le pourcentage d’activité observé en présence des petites molécules a été calculé dans chaque cas.

Figure 1 : Essai de méthylation de l’ADN. Un ADN d’épingle à cheveux hémiméthylé avec un fluorophore à l’extrémité 5' et un désincant à l’extrémité 3' est utilisé comme substrat. DNMT1 catalyse le transfert du groupe méthyle de la S-adénosylméthionine au site CpG non méthylé, générant de la S-adénosylhomocystéine et de l’ADN entièrement méthylé. Le produit d’ADN contient le site de clivage de l’endonucléase Gla I, qui clive les sites GCGC entièrement méthylés. Le clivage de l’ADN du produit libère le fluorophore 5' de l’anti-quencher 3', générant une fluorescence. Abréviations : Fl = fluorophore; Q = quencher; DNMT1 = ADN méthyltransférase 1; SAM = S-adénosylméthionine; HSA = S-adénosylhomocystéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparer les solutions de dosage pour le criblage

NOTE: Les concentrations de substrats utilisés dans ce test peuvent être adaptées. Pour le DNMT1 dépourvu de RFTS, les valeurs K_m déterminées expérimentalement pour le substrat d’ADN en épingle à cheveux et SAM sont de 1–2 nM et 2 μM, respectivement^26,40.

1. Préparer 600 μL de chaque condition d’essai testée dans des tubes à microcentrifugeuses sur de la glace.
   REMARQUE : Le volume total de solution de dosage nécessaire dépend du nombre de répétitions effectuées. Chaque condition de test a été exécutée en trois exemplaires pour ce protocole.
   1. Ajouter du tampon de méthylation ddH2O2 et 5x (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutamate de_{potassium, 5} mM dithiothréitol (DTT), 25% glycérol) à chaque tube pour obtenir une concentration finale de 1x tampon. Pour les dosages contenant 20 μM composé, ajouter 472 μL de_ddH2Oet 120 μL de tampon 5x. Pour les dosages contenant 50 μM composé, ajouter 470 μL de_ddH2Oet 120 μL de tampon 5x.
   2. Ajouter 3,15 μL de 20 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) à chaque échantillon.
   3. Ajouter 2 μL de substrat d’ADN en épingle à cheveux de 3,15 μM et 1,33 μL de SAM de 4,75 mM à chaque échantillon.
      NOTE: La concentration des substrats dans le mélange de solution d’essai est de 1,05 fois les concentrations finales souhaitées.
   4. Ajouter l’inhibiteur à une concentration finale de 21 μM (1,26 μL de 10 mM) ou 52,5 μM (3,15 μL de 10 mM) aux échantillons appropriés. Ajouter une quantité équivalente de diméthylsulfoxyde (DMSO) à un échantillon témoin.
      REMARQUE: La concentration d’inhibiteur utilisé dans le dépistage peut varier. La concentration finale maximale de DMSO devrait être de ≤5 % (v/v). Des concentrations de DMSO allant jusqu’à 5 % (v/v) n’ont aucun effet sur l’activité observée dans le test²⁶.
2. Mélanger les solutions en tourbillonnant (3 000 tr/min) pendant 3 s. Faites tourner les échantillons pendant quelques secondes dans une mini-centrifugeuse de table (1 200 × g) pour vous assurer que la solution est recueillie au fond du tube.
3. Aliquote 95 μL de chaque solution d’essai dans 6 puits consécutifs dans une plaque noire de 96 puits en demi-zone (figure 2).
   REMARQUE : Ces tests de dépistage ont été effectués en deux lots. Tout d’abord, 20 échantillons d’inhibiteurs μM (4 conditions totales) ont été examinés, suivis des échantillons d’inhibiteurs de 50 μM (4 conditions totales).

Figure 2 : Configuration de la plaque de dosage. Chaque solution d’essai est aliquote dans six puits dans la plaque noire de 96 puits : témoin DMSO (bleu), composé 1 (vert), composé 2 (rouge) et composé 3 (jaune). DNMT1 et Gla I dépourvus de RFTS seront ajoutés à trois puits. En tant que contrôle, seul Gla I sera ajouté aux trois autres puits. Abréviations : RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = ADN méthyltransférase 1; DMSO = diméthylsulfoxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Préparer des solutions enzymatiques pour le dépistage

REMARQUE : Le DNMT1 dépourvu de RFTS peut être exprimé dans E. coli et purifié jusqu’à homogénéité. Les procédures d’expression et de purification du DNMT1 dépourvu de RFTS ont été décrites précédemment⁴¹. Le volume d’enzyme nécessaire dépend du nombre de tests effectués. Ici, quatre tests différents sont effectués dans chaque série; Chaque essai est complété en trois exemplaires.

1. Préparer 75 μL de chaque solution enzymatique dans des tubes à microcentrifugation sur de la glace.
   NOTE: Deux solutions enzymatiques seront nécessaires. Une solution contiendra DNMT1 et Gla I; l’autre ne contiendra que Gla I.
   1. Ajouter du tampon de méthylation ddH2O2 et 5x (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutamate de potassium, 5 mMDTT_{, 25}% glycérol) à chaque tube pour obtenir une concentration finale de 1x tampon. Pour la solution enzymatique Gla I, ajouter 15 μL de tampon 5x et 58,8 μL de_ddH2O. Pour la solution enzymatique DNMT1+Gla I, ajouter 15 μL de tampon 5x et 58,2 μL de_ddH2O.
   2. Ajouter 1,2 μL de 10 U/μL Gla I à chaque solution pour une concentration finale de 0,16 U/μL.
   3. Ajouter 0,6 μL de DNMT1 dépourvu de RFTS 5 μM pour une concentration finale de 40 nM à la solution DNMT1+Gla I.
2. Tapotez doucement pour mélanger les solutions. Faites tourner les échantillons pendant quelques secondes dans une mini-centrifugeuse de table (1 200 × g) pour vous assurer que la solution est recueillie au fond du tube.
3. Aliquote 12 μL de chaque solution enzymatique dans 6 puits dans une plaque conique de 96 puits (Figure 3).

Figure 3 : Configuration de la plaque enzymatique. Les solutions Gla I (gris) et DNMT1+Gla I (bleu) sont chacune aliquotes dans six puits dans la plaque de 96 puits. À l’aide d’une pipette multicanal, l’enzyme peut être ajoutée simultanément à une rangée de solutions de dosage. Pour chaque condition d’essai (six puits), trois puits recevront DNMT1+Gla I, et trois puits recevront Gla I seul. Abréviation : DNMT1 = ADN méthyltransférase 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Exécutez le test et analysez les données.

1. Préchauffez le lecteur de plaques à 37 °C. Insérez la plaque noire contenant les solutions de dosage. Agiter la plaque (double orbitale à 425 cpm pendant 5 s) et lire la fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 528 nm. Incuber la plaque à 37 °C pendant 5 min.
   REMARQUE: Alternativement, des filtres avec des coupures de longueur d’onde appropriées peuvent être utilisés pour les lectures de fluorescence.
2. Retirez la plaque de dosage. Ajouter 5 μL de solution enzymatique à chaque puits et mélanger en pipetant de haut en bas.
   Remarque : Utilisez des pipets multicanaux afin qu’une rangée d’échantillons puisse être lancée simultanément.
3. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques. Enregistrer la fluorescence toutes les 53 s pendant 30 min. Agiter la plaque (double orbitale à 425 cpm pendant 4 s) avant chaque lecture.
4. Tests moyens de contrôle Gla I triplicate pour chaque condition. Soustrayez la trace moyenne de réaction de contrôle contenant du Gla I des traces triplicates obtenues en présence de DNMT1 dépourvu de RFTS. Déterminer l’erreur moyenne et l’erreur-type de la moyenne pour les répétitions corrigées.
5. Tracez la trace de réaction corrigée moyenne et ajustez la partie linéaire initiale à une ligne pour déterminer la vitesse initiale.
6. Déterminer le pourcentage d’activité en divisant la vitesse observée en présence d’un composé par la vitesse observée dans la réaction de contrôle contenant du DMSO et en multipliant par 100.

4. Contrôle supplémentaire du dosage — addition séquentielle d’enzymes

1. Préparer 550 μL de solution d’essai dans un tube à microcentrifugation sur de la glace. Ajouter 110 μL de tampon de méthylation 5x, 3,88 μL de substrat d’ADN en épingle à cheveux 3,15 μM, 6,43 μL de 47,5 mM SAM, 3,06 μL de BSA 20 mg/mL et 426,6 μL de ddH₂O.
2. Mélanger la solution en tourbillonnant (3 000 tr/min) pendant 3 s. Faites tourner les échantillons pendant quelques secondes dans une mini-centrifugeuse de table (1 200 × g) pour vous assurer que la solution est recueillie au fond du tube.
3. Aliquote 90 μL de la solution d’essai dans 6 puits consécutifs dans une plaque noire de 96 puits en demi-zone.
4. Préparer les solutions enzymatiques DNMT1 sur glace. Ajouter 4 μL de tampon de méthylation 5x, 0,76 μL de DNMT1 dépourvu de RFTS 5 μM et 15,24 μL de_ddH2Odans un tube. Ajouter 4 μL de tampon de méthylation 5x et 16 μL de_ddH2Odans un autre tube.
5. Tapotez doucement pour mélanger les solutions. Faites tourner les échantillons pendant quelques secondes dans une mini-centrifugeuse de table (1 200 × g) pour vous assurer que la solution est recueillie au fond du tube.
6. Ajouter 5 μL de la solution contenant du DNMT1 à trois puits dans la plaque noire de 96 puits. Ajouter 5 μL de la solution de contrôle tampon aux trois autres puits.
7. Placer la plaque de microtitrage dans le lecteur de plaque préchauffé à 37 °C. Agiter la plaque (double orbitale à 425 cpm pendant 3 s) et lire la fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 528 nm. Répétez le shake et lisez toutes les 60 s pendant 30 minutes.
8. Pendant que la plaque d’essai est dans le lecteur de plaque, préparer la solution de Gla I sur de la glace. Ajouter 8 μL de tampon de méthylation 5x, 0,64 μL de Gla I 10 U/μL et 31,4 μL de_ddH2Odans un tube microcentrifugé. Tapotez doucement pour mélanger la solution. Faites tourner l’échantillon pendant quelques secondes dans une mini-centrifugeuse de table (1 200 × g) pour vous assurer que la solution est recueillie au fond du tube.
9. Aliquote 6 μL de la solution de Gla I dans 6 puits dans une plaque conique de 96 puits.
10. Après la lecture initiale de 30 minutes, retirez la plaque noire du lecteur de plaques. Ajouter 5 μL de solution de Gla I aux 6 puits et mélanger en pipetant de haut en bas.
    REMARQUE: Utilisez une pipette multicanal afin que tous les puits puissent être démarrés simultanément.
11. Replacez la plaque noire dans le lecteur de plaques. Enregistrer la fluorescence toutes les 35 s pendant 35 min. Agiter la plaque (double orbitale à 425 cpm pendant 3 s) avant chaque lecture.

Le DNMT1 actif est une condition préalable à cette analyse. Le DNMT1 dépourvu de RFTS a été exprimé dans E. coli et purifié à l’homogénéité selon les procédures précédemment publiées41. Pour s’assurer que l’enzyme purifiée était active, un test discontinu couplé à l’endonucléase a été utilisé pour examiner l’activité de méthylation de l’ADN36. Ce test utilise un ADN duplex de 32 paires de bases avec un seul CpG hémiméthylé positionné dans un site de clivage Sau3A1. Sau3A1 peut cliver l’ADN du substrat hémiméthylé; cependant, le clivage est bloqué lorsque l’ADN est complètement méthylé. DNMT1 dépourvu de RFTS a été ajouté aux tests contenant 1 μM d’ADN et 0,5 mM de SAM, et les aliquotes ont été retirées et surgelées pendant 30 minutes. Les échantillons ont ensuite été digérés avec Sau3A1 et les produits ont été séparés par électrophorèse sur gel. Comme le montre la figure 4, l’ADN est protégé du clivage à mesure que le temps de réaction augmente, ce qui indique que DNMT1 dépourvu de RFTS méthyle l’ADN hémiméthylé. La majeure partie de l’ADN du substrat de 1 μM présent à l’origine dans le test a été convertie en produit au cours de la période de 30 minutes.

Le test couplé à l’endonucléase décrit dans cet article permet d’observer l’activité de méthylation de l’ADN en temps réel sous forme d’augmentation de la fluorescence. La clé du succès de ce test est la sensibilité méthylique de l’endonucléase Gla I. Gla I ne clive pas efficacement l’ADN du substrat hémiméthylé mais clive l’ADN du produit entièrement méthylé (Figure 1). Le clivage de l’ADN en épingle à cheveux est nécessaire pour libérer le fluorophore de l’étouffer et générer une augmentation de la fluorescence. Pour démontrer que les enzymes fonctionnent comme prévu, une réaction de contrôle a été menée dans laquelle les enzymes, DNMT1 et Gla I dépourvues de RFTS, ont été ajoutées séquentiellement plutôt que simultanément. Si le test couplé fonctionne correctement, l’ajout de DNMT1 ne devrait pas avoir d’impact sur la fluorescence, car la méthylation du substrat d’ADN ne devrait pas avoir d’impact sur la fluorescence de fond de l’ADN en épingle à cheveux trempé en interne. Cependant, l’ajout ultérieur de Gla I aux dosages contenant la méthyltransférase devrait entraîner une génération de fluorescence due au clivage de l’ADN en épingle à cheveux entièrement méthylé. Le substrat d’ADN en épingle à cheveux hémiméthylé lui-même a une fluorescence de fond (Figure 5); ces tests contenaient 20 nM d’ADN en épingle à cheveux et 500 μM de SAM. Un DNMT1 ou tampon sans RFTS a été ajouté aux essais, et la fluorescence a été suivie pendant 30 minutes.

Comme le montre la figure 5, la fluorescence n’est pas affectée par le DNMT1 dépourvu de RFTS en l’absence de l’enzyme de couplage (les nuances bleues contenaient 10 nM de DNMT1 sans RFTS tandis que les nuances rouges sont le contrôle tampon). Ainsi, la méthylation du site CpG hémiméthylé par DNMT1 ne modifie pas sensiblement le signal de fluorescence. Cependant, lorsque Gla I a été ajouté à tous les puits, une génération de fluorescence robuste n’a été observée que dans les essais contenant du DNMT1 dépourvu de RFTS (Figure 5). Ceci montre que la méthylation de l’ADN du substrat hémiméthylé par DNMT1 est nécessaire pour le clivage du Gla I et la génération de fluorescence. Il convient de noter que l’augmentation de la fluorescence observée dans cet essai de contrôle reflète l’activité de Gla I lorsque les enzymes ont été ajoutées séquentiellement. Alternativement, ces mélanges réactionnels pourraient être digérés avec Gla I, et les oligonucléotides résultants pourraient être séparés par électrophorèse pour visualiser le clivage et s’assurer que les enzymes fonctionnent comme prévu.

Pour utiliser ce test couplé afin de déterminer directement les vitesses initiales de DNMT1, les deux enzymes, DNMT1 et Gla I dépourvues de RFTS, doivent être ajoutées simultanément. Tant que le taux de clivage Gla I de l’ADN du produit est plus rapide que le taux de méthylation de l’ADN par DNMT1, le signal de fluorescence généré reflétera l’activité de méthylation de l’ADN. Pour s’assurer que l’activité de DNMT1 limite la vitesse, la concentration de DNMT1 peut être modifiée tout en maintenant toutes les autres conditions d’essai constantes. Le taux de génération de fluorescence doit être proportionnel à la concentration de DNMT1. Cela a déjà été démontré pour le DNMT1 dépourvu de RFTS dans les conditions utilisées ici40. Lors de l’utilisation de ce test couplé pour examiner l’activité DNMT, une réaction de contrôle contenant du Gla I est effectuée en plus de la réaction qui contient à la fois DNMT1 et Gla I (Figure 6A). Le contrôle Gla I a plusieurs fonctions. La soustraction de la trace de réaction de contrôle Gla I de la trace de réaction contenant du DNMT permet de prendre en compte à la fois le clivage lent du substrat d’ADN hémiméthylé et la fluorescence de fond. Les traces réactionnelles corrigées générées reflètent l’activité de méthylation de l’ADN de DNMT1. L’ajustement de la partie linéaire initiale de la trace de réaction corrigée permet de déterminer la vitesse initiale (figure 6B). Avec un substrat d’ADN en épingle à cheveux de 10 nM et une SAM de 10 μM, une vitesse initiale de 113 ± 2 RFU/min a été obtenue.

Il a déjà été démontré que les anthraquinones substituées inhibent l’activité de DNMT1. Le produit naturel, l’acide laccaïque A, une anthraquinone hautement substituée, est un puissant inhibiteur de DNMT127 compétitif pour l’ADN. Quelques composés avec des structures plus simples, un ou deux substituants sur le noyau anthraquinone, dont un étant un substituant aromatique volumineux, ont également été montrés pour inhiber DNMT1 d’une manière compétitive pour l’ADN41. Ici, la capacité de trois anthraquinones substituées ou molécules de type anthraquinone à inhiber l’activité DNMT1 dépourvue de RFTS dans le test couplé Gla I a été examinée comme exemple de la façon de mener ces tests de dépistage. Ces composés contenaient un à trois substituants, tous d’un côté du noyau d’anthraquinone (tableau 1). Les concentrations de substrat (ADN 10 nM et 10 μM SAM) utilisées pour ces essais sont ~5x plus élevées que le Km pour chaque substrat. Le signal généré dans le test provient directement de l’ADN du substrat. Pour cette raison, il est difficile de doser à des concentrations proches ou inférieures à Km; Il n’y a tout simplement pas assez de signal à détecter. Ces concentrations de substrat ont été choisies parce qu’une activité robuste est observée dans ces conditions en l’absence d’inhibiteurs (Figure 6B). D’autres concentrations de substrat pourraient être utilisées dans les essais de dépistage. Par exemple, la réalisation d’un dépistage à des concentrations de MAS saturées pourrait être utilisée comme stratégie pour biaiser la recherche par rapport aux inhibiteurs de la SAM compétitive.

Chaque test contenait le substrat d’ADN en épingle à cheveux, le cofacteur donneur de méthyle SAM et un inhibiteur potentiel ou DMSO comme témoin pour le dépistage. Nous générons régulièrement des solutions de criblage de composés de 10 mM dans le DMSO pour une utilisation dans des essais. Les anthraquinones telles que celles examinées ici présentent une faible solubilité dans les solutions aqueuses. Ainsi, pour générer des stocks concentrés, le DMSO est utilisé comme solvant. L’ajout de DMSO jusqu’à une concentration finale de 5 % (v/v) n’a pas d’impact sur l’activité dans le test26. Toutefois, lorsqu’il s’agit de composés à faible solubilité en solution aqueuse, il faut veiller à ce que le composé soit soluble à la ou aux concentrations finales choisies pour le criblage.

Pour chaque condition examinée dans le criblage, un test témoin contenant du Gla I est effectué. En plus de tenir compte de la fluorescence de fond et du clivage lent de l’ADN en épingle à cheveux du substrat, ce contrôle permet de déterminer si l’inhibiteur potentiel interfère avec le signal spectroscopique (p. ex., il est fluorescent). Après avoir initié la réaction en ajoutant des enzymes, la fluorescence a été mesurée pendant 30 minutes avec un intervalle de temps de 53 s dans les données de dépistage. Il s’agit de l’intervalle de temps le plus rapide disponible sur le lecteur de plaques dans ce laboratoire lors de la lecture d’une plaque entière de 96 puits. D’autres intervalles de temps pourraient être utilisés pour générer les traces de réaction. Un intervalle de temps approprié dépendra de l’instrument utilisé et du nombre de puits lus. Pour assurer la reproductibilité, chaque essai est effectué en trois exemplaires. La trace de contrôle moyenne contenant du Gla I est soustraite des traces de réaction observées en présence de DNMT1 dépourvu de RFTS. La vitesse initiale de la réaction peut être déterminée en ajustant la partie linéaire initiale des traces de réaction corrigées.

Initialement, l’impact de trois inhibiteurs potentiels sur la génération de fluorescence a été examiné à une concentration finale de 20 μM. Des concentrations plus élevées des inhibiteurs potentiels ont été choisies pour le dépistage pour deux raisons. Tout d’abord, les concentrations de substrat dans l’essai sont toutes deux supérieures à leurs valeurs respectives de Km . Cela peut rendre plus difficile la détection de l’inhibition dans les tests cinétiques, en particulier si les inhibiteurs sont compétitifs. Deuxièmement, les composés de type anthraquinone utilisés dans ce criblage ont une structure significativement plus simple que l’inhibiteur connu, l’acide laccaïque A. Comme ces molécules ne contiennent que quelques substituants autour de la structure du noyau, nous avons anticipé des interactions plus faibles. Dans le test témoin contenant du DMSO, une vitesse initiale de 111 ± 5 RFU/min a été obtenue (figure 7A). Il est à noter que ce taux est très similaire au taux déclaré précédemment en l’absence de DMSO et confirme que l’ajout de faibles quantités de DMSO n’a pas d’incidence sur l’activité observée. L’ajout de deux composés a diminué la vitesse initiale observée, tandis que l’ajout du troisième composé n’a eu aucun effet sur l’activité. Les vitesses initiales ont été utilisées pour déterminer le pourcentage d’activité observé en présence de chaque composé. À 20 μM, l’ajout des composés 1 et 2 a entraîné un pourcentage d’activité de ~80%, tandis que 100% d’activité a été observé en présence du composé 3, indiquant que cette molécule n’inhibe pas l’enzyme (tableau 1).

On s’attend à ce que les inhibiteurs présentent une inhibition dépendante de la concentration. Ensuite, ces molécules ont été réexaminées à une concentration encore plus élevée de 50 μM. Pour cet ensemble d’essais, le test témoin contenant du DMSO avait une vitesse initiale de 125 ± 7 RFU/min (Figure 7B). Cette vitesse est légèrement supérieure aux taux précédemment déterminés; Cependant, ces vitesses sont toutes relativement proches dans l’erreur. Encore une fois, le composé 3 a eu peu d’effet sur la vitesse initiale, tandis que l’ajout des composés 1 et 2 a diminué la vitesse initiale observée. Comme prévu, à la concentration plus élevée, le composé 1 avait un impact plus important sur l’activité. À 50 μM, l’ajout du composé 1 a donné un pourcentage d’activité de ~60 % (tableau 1). Cependant, l’ajout d’une concentration plus élevée du composé 2 n’a pas entraîné une inhibition plus robuste. Le pourcentage d’activité observé en présence de 50 μM de composé 2 était à nouveau proche de 80%.

Comme on peut le voir dans les données présentées, le test de méthylation de l’ADN par fluorescence couplé à l’endonucléase peut être utilisé pour dépister les inhibiteurs potentiels de la DNMT. Les données indiquent que le composé 1 et le composé 2 sont des inhibiteurs potentiels, alors que le composé 3 ne l’est pas. Des études supplémentaires sont nécessaires pour valider les inhibiteurs potentiels en tant que véritables inhibiteurs de DNMT1.

Figure 4 : Contrôle de l’activité DNMT1. La méthylation de l’ADN duplex hémiméthylé protège contre le clivage Sau3A1. DNMT1 dépourvu de RFTS a été ajouté aux mélanges de dosage contenant 1 μM d’ADN et 500 μM de SAM. Les échantillons ont été prélevés aux points temporels indiqués au cours d’une incubation de 30 minutes à 37 °C, digérés avec Sau3A1 et résolus par électrophorèse sur gel sur 18% PAGE. Ici, des échantillons de 5, 10, 15 et 30 minutes sont montrés. La première voie est une commande dépourvue de DNMT1. Abréviations : DNMT1 = ADN méthyltransférase 1; RFTS = séquence de ciblage des foyers de réplication. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Contrôle du dosage basé sur la fluorescence. DNMT1 (concentration finale de 10 nM) et Gla I (0,8 U) dépourvus de RFTS ont été ajoutés séquentiellement à des essais triples contenant 20 nM de substrat d’ADN en épingle à cheveux et 500 μM de SAM. L’ajout de DNMT1 (cercles bleus) ou de tampon (cercles rouges) seul n’a eu aucun effet sur la fluorescence de fond. L’ajout de Gla I à tous les essais entraîne la génération de fluorescence dans les essais contenant DNMT1, mais pas dans les essais qui n’en contiennent pas. Abréviations : DNMT1 = ADN méthyltransférase 1; RFTS = séquence de ciblage des foyers de réplication; RFU = unités de fluorescence relative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Traces de réaction de fluorescence. Les tests triplicates contenaient 10 nM de substrat d’ADN en épingle à cheveux et 10 μM de SAM. (A) DNMT1 (2 nM) et Gla I (0,8 U) dépourvus de RFTS ont été ajoutés à trois essais (bleu), et Gla I (0,8 U) seul a été ajouté à trois essais (rouge). Une génération de fluorescence robuste n’est observée que dans les tests contenant les deux enzymes. (B) La trace moyenne de réaction Gla I a été soustraite des traces de réaction DNMT1+Gla I. La moyenne et l’erreur-type de la moyenne des données triplées sont indiquées. L’ajustement de la partie linéaire de la trace donne une vitesse initiale de 113 ± 2 RFU/min. Abréviations : DNMT1 = ADN méthyltransférase 1; RFTS = séquence de ciblage des foyers de réplication; UFR = unités de fluorescence relative; SAM = S-adénosylméthionine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Activité de méthylation de l’ADN en présence d’inhibiteurs potentiels. L’activité de méthylation de l’ADN du DNMT1 dépourvu de RFTS a été examinée en présence de DMSO (noir), composé 1 (rouge), composé 2 (bleu) ou composé 3 (vert). Des traces de réaction corrigées à 20 μM composé (A) et 50 μM composé (B) ont été ajustées pour déterminer la vitesse initiale. L’ajout des composés 1 et 2 a diminué la vitesse observée, tandis que le composé 3 a eu peu d’impact sur l’activité. L’erreur moyenne et l’erreur-type de la moyenne pour les essais en triple exemplaire sont indiquées. Abréviations : DNMT1 = ADN méthyltransférase 1; RFTS = séquence de ciblage des foyers de réplication; UFR = unités de fluorescence relative; DMSO = diméthylsulfoxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Vitesses initiales et pourcentage d’activités observées en présence d’inhibiteurs potentiels de petites molécules. La vitesse initiale a été déterminée en ajustant la partie linéaire initiale des traces de réaction corrigées à une droite; L’erreur associée à l’ajustement est signalée. Le pourcentage d’activité a été déterminé en divisant le taux déterminé en présence de composé par le taux déterminé dans la réaction de contrôle du DMSO et en multipliant par 100; L’erreur associée a été propagée. Abréviations : Cmpd = composé; DMSO = diméthylsulfoxyde; RFU = unités de fluorescence relative. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.