Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

Résumé

Les ADN méthyltransférases sont des cibles potentielles de médicaments anticancéreux. Ici, un protocole est présenté pour évaluer les petites molécules pour l’inhibition de l’ADN méthyltransférase. Ce test utilise une endonucléase pour coupler la méthylation de l’ADN à la génération de fluorescence et permet de surveiller l’activité enzymatique en temps réel.

Résumé

La méthylation de l’ADN, une forme de régulation épigénétique des gènes, est importante pour la fonction cellulaire normale. Dans les cellules, des protéines appelées ADN méthyltransférases (DNMT) établissent et maintiennent le schéma de méthylation de l’ADN. Les changements dans le schéma normal de méthylation de l’ADN sont liés au développement et à la progression du cancer, ce qui fait des DNMT des cibles potentielles pour les médicaments anticancéreux. Ainsi, l’identification et la caractérisation de nouvelles petites molécules inhibitrices de ces enzymes sont d’une grande importance. Cet article présente un protocole qui peut être utilisé pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase. Le test cinétique couplé continu permet de déterminer les vitesses initiales de méthylation de l’ADN en présence et en l’absence d’inhibiteurs potentiels de petites molécules. Le test utilise l’endonucléase méthyl-sensible Gla I pour coupler la méthylation d’un substrat d’ADN hémiméthylé à la génération de fluorescence.

Ce test continu permet de surveiller l’activité enzymatique en temps réel. La réalisation du test en petits volumes dans des plaques de microtitrage réduit le coût des réactifs. À l’aide de ce test, un petit exemple de dépistage a été effectué pour les inhibiteurs de DNMT1, l’isozyme DNMT le plus abondant chez l’homme. Le produit naturel anthraquinone hautement substitué, l’acide laccaïque A, est un puissant inhibiteur de DNMT1 compétitif pour l’ADN. Ici, nous examinons trois inhibiteurs potentiels de petites molécules – anthraquinones ou molécules semblables à l’anthraquinone avec un à trois substituants – à deux concentrations pour décrire le protocole de dosage. Les vitesses initiales sont utilisées pour calculer le pourcentage d’activité observé en présence de chaque molécule. L’un des trois composés examinés présente une inhibition dépendante de la concentration de l’activité DNMT1, ce qui indique qu’il s’agit d’un inhibiteur potentiel de DNMT1.

Introduction

La méthylation de l’ADN est une marque épigénétique importante qui régule l’expression des gènes et la structure de la chromatine. La méthylation se produit principalement dans les dinucléotides CpG - cytosine suivie de guanosine; Le groupe méthyle est ajouté à la position 5 de la cytosine. Des schémas de méthylation corrects de l’ADN, et donc une expression génique appropriée, sont nécessaires pour un développement et une fonction cellulaires appropriés. De nombreux états pathologiques ont été associés à des modifications du schéma normal de méthylation ^1,2,3. Par exemple, i....

Protocole

1. Préparer les solutions de dosage pour le criblage

NOTE: Les concentrations de substrats utilisés dans ce test peuvent être adaptées. Pour le DNMT1 dépourvu de RFTS, les valeurs K_m déterminées expérimentalement pour le substrat d’ADN en épingle à cheveux et SAM sont de 1–2 nM et 2 μM, respectivement^26,40.

1. Préparer 600 μL de chaque condition d’essai testée dans des tubes à microcentrifugeuses sur de la glace.
   REMARQUE : Le volume total de solution de dosage nécessaire dépend du nombre de répétitions effectuées. Chaque condition de test a été....

Résultats

Le DNMT1 actif est une condition préalable à cette analyse. Le DNMT1 dépourvu de RFTS a été exprimé dans E. coli et purifié à l’homogénéité selon les procédures précédemment publiées⁴¹. Pour s’assurer que l’enzyme purifiée était active, un test discontinu couplé à l’endonucléase a été utilisé pour examiner l’activité de méthylation de l’ADN³⁶. Ce test utilise un ADN duplex de 32 paires de bases avec un seul CpG hémiméthylé positionné dans un site de clivage Sau3A1........

Discussion

Pour identifier et caractériser les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférases, l’activité de l’enzyme doit être mesurée. Il existe plusieurs méthodes d’examen de l’activité de l’ADN méthyltransférase. L’activité est généralement surveillée à l’aide de la radioactivité; Le transfert du groupe méthyle marqué de SAM peut être quantifié 29,30,31,32,33,34<.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polystyrène noir à fond plat à 96 puits à demi-surface non traité Microplaque	Corning	3694
Plaques à fond conique en polystyrène à 96 puits	ThermoFisher	249570
Albumine sérique bovine	Composé NEB	B9000S
1	de criblage ChemBridge 5812086	remis en suspension dans le DMSO à un composé de 10 mM
2	ChemBridge	6722175	composé de criblage ; remis en suspension dans du DMSO à 10 mM composé de
tamisage 3	ChemBridge	5249376	composé ; remis en suspension dans du DMSO à 10 mM
Dithiothreitol	Sigma	D0632
Gla I	SibEnzyme	E494	endonucléase sensible au méthyle
Glycérol	RPI	G22025
Chlorure de magnésium	Sigma	M0250
(5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)	IDT	synthétisé sur mesure	en épingle à cheveux éteint en interne (substrat)
Glutamate de potassium	Sigma	G1501
S-adénosylméthionine	Sigma	A4377	cofacteur donneur de méthyle (substrat)
Tris Base	RPI	Réf. T60040