Article de méthode

Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires

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DOI :

10.3791/62964

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25 juillet 2022

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1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48, Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care, APHP-Sorbonne university

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.

Résumé

La microglie, en tant que macrophages résidant dans le cerveau, est fondamentale pour plusieurs fonctions, y compris la réponse au stress environnemental et l’homéostasie cérébrale. La microglie peut adopter un large spectre de phénotypes d’activation. De plus, les microglies qui endossent le phénotype pro-inflammatoire sont associées à la fois à des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs. Les études in vitro sont largement utilisées dans la recherche pour évaluer les stratégies thérapeutiques potentielles dans des types cellulaires spécifiques. Dans ce contexte, l’étude de l’activation microgliale et de la neuroinflammation in vitro à l’aide de cultures microgliales primaires est plus pertinente que les lignées cellulaires microgliales ou la microglie dérivée de cellules souches. Cependant, l’utilisation de certaines cultures primaires pourrait souffrir d’un manque de reproductibilité. Ce protocole propose une méthode reproductible et pertinente d’isolement magnétique de la microglie des nouveau-nés. L’activation microgliale utilisant plusieurs stimuli après 4 h et 24 h par quantification de l’expression de l’ARNm et un dosage phagocytaire à billes de Cy3 est démontrée ici. Les travaux actuels devraient fournir une technique facilement reproductible pour isoler les microglies physiologiquement pertinentes des stades de développement juvéniles.

Introduction

Les microglies sont les cellules macrophages résidentes du système nerveux central dérivées des précurseurs érythropoïétiques du sac vitellin qui migrent vers le neuroépithélium au cours du développement embryonnaire précoce1. Outre leurs fonctions immunitaires, ils jouent également un rôle important au cours du développement neurologique, en particulier pour la synaptogenèse, l’homéostasie neuronale et la myélinisation2. À l’âge adulte, les microglies développent de longs processus cellulaires pour scanner l’environnement en continu. En cas de ruptures d’homéostasie telles qu’une lésion cérébrale ou une maladie cérébrale, les microglies peuvent modifier leur aspect morphologique pour adopter une forme amiboïde, migrer vers la zone lésée, augmenter et libérer de nombreux facteurs cytoprotecteurs ou cytotoxiques. Les microglies ont des états d’activation hétérogènes en fonction de leur stade de développement et du type de lésion subie 3,4,5. Dans cette étude, ces états d’activation sont largement classés en trois phénotypes différents : pro-inflammatoire/phagocytaire, anti-inflammatoire et immuno-régulateur, en gardant à l’esprit qu’en réalité, la situation est susceptible d’être plus complexe6.

L’étude in vivo de l’activation microgliale et le dépistage des stratégies neuroprotectrices aux premiers stades du développement du cerveau peuvent être difficiles en raison (1) de la fragilité des animaux avant le sevrage et (2) du faible nombre de cellules microgliales. Par conséquent, les études in vitro sur la microglie sont largement utilisées pour la toxicité 7,8,9, les stratégies neuroprotectrices 5,10,11,12,13,14 et les co-cultures 15,16,17,18,19,20,21 . Les études in vitro peuvent utiliser soit des lignées cellulaires microgliales, soit des microglies dérivées de cellules souches, soit une culture microgliale primaire. Toutes ces approches ont des avantages et des inconvénients, et le choix dépend de la question biologique initiale. Les avantages de l’utilisation de cultures microgliales primaires sont le fond génétique homogène, l’histoire exempte d’agents pathogènes et le contrôle du moment où les microglies sont stimulées après la mort de l’animal22.

Au fil des ans, différentes méthodes (cytométrie en flux, agitation ou marquage magnétique) ont été développées pour cultiver la microglie primaire de rongeurs, nouveau-nés et adultes 23,24,25,26,27,28,29. Dans le présent travail, l’isolement de la microglie à partir de bébés nouveau-nés de souris est effectué à l’aide de la technologie de tri cellulaire activée magnétique décrite précédemment à l’aide de CD11b25,27,29 anti-souris enrobé de microbilles. CD11b est un récepteur intégrine exprimé à la surface des cellules myéloïdes, y compris la microglie. Lorsqu’il n’y a pas de défi inflammatoire dans le cerveau, presque toutes les cellules CD11b+ sont des cellules microgliales30. Par rapport à d’autres méthodes publiées précédemment 23,24,25,26,27,28,29, le présent protocole équilibre les analyses d’activation microgliale ex vivo immédiates et la culture microgliale primaire in vitro commune. Ainsi, les microglies sont (1) isolées au jour postnatal (P)8 sans élimination de la myéline, (2) cultivées sans sérum, et (3) exposées soit à des siRNA, des miARN, des composés pharmacologiques et/ou des stimuli inflammatoires seulement 48 h après l’isolement cérébral. Chacun de ces trois aspects rend le protocole actuel pertinent et rapide. Tout d’abord, l’utilisation de la microglie pédiatrique permet d’obtenir des cellules viables dynamiques et réactives en culture sans nécessiter une étape de démyélinisation supplémentaire qui pourrait potentiellement modifier la réactivité microgliale in vitro. Le présent protocole vise à se rapprocher le plus possible de l’environnement physiologique de la microglie. En effet, les microglies ne rencontrent jamais de sérum, et ce protocole ne nécessite pas non plus l’utilisation de sérum. De plus, exposer les microglies dès 48 h après la culture les empêche de perdre leurs facultés physiologiques.

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Protocole

Le protocole a été approuvé et tous les animaux ont été manipulés conformément aux directives institutionnelles de l’Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, France). L’isolement magnétique de la microglie à partir du cerveau de 24 bébés souris OF1 (mâles et femelles) à P8, divisés en plaques à 6 puits, 12 puits ou 96 puits, est présenté. Le travail expérimental a été effectué sous une hotte pour maintenir des conditions stériles.

1. Préparation de solutions stériles pour l’isolement et la culture cellulaire

  1. Préparer 50 ml de 1x solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) sans Ca 2+ et Mg2+ (HBSS-/-) à partir de la solution 10x disponible dans le commerce (voir le tableau des matières).
  2. Préparer le mélange de dissociation selon la composition fournie au tableau 1 à l’aide d’une trousse de dissociation tissulaire disponible dans le commerce (voir le tableau des matières).
  3. Préparer 200 ml de 1x HBSS avec Ca 2+ et Mg2+ (HBSS+/+) à partir de la solution 10x disponible dans le commerce.
  4. Préparez 200 ml de 1x PBS + 0,5% BSA (appelé tampon de tri cellulaire).
  5. Préparer les microbilles CD11b conformément au tableau 2.
  6. Préparer 500 mL de milieu de culture sans sérum (SFM) sans macrophages + 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S). Fabriquer des aliquotes de tubes de 50 mL et les conserver à 4 °C. C’est ce qu’on appelle le milieu microglial plus loin dans le texte.
    NOTE: Toutes les solutions d’isolement doivent être fraîchement préparées dans des conditions stériles le jour de l’expérimentation et conservées sur la glace. Le milieu de culture cellulaire microglia peut être préparé, aliquote dans des tubes de 50 ml et conservé à 4 °C pour une utilisation ultérieure. La filtration n’est pas nécessaire.

2. Dissection cérébrale

  1. Décapitaisez la tête du chiot à l’aide de gros ciseaux sans anesthésie générale préalable.
  2. Couper la peau du cou au nez en suivant la suture sagittale (15-20 mm) avec de petits ciseaux (Figure 1A-C).
  3. Insérez une petite pointe de ciseaux dans le foramen magnum parallèle au crâne. Couper soigneusement de chaque côté jusqu’aux yeux (Figure 1D,E).
  4. Coupez entre les yeux avec de petits ciseaux pour détacher le crâne et le cerveau de la tête (Figure 1F).
  5. À l’aide de deux pinces, saisissez le crâne près des bulbes olfactifs et déchirez-le soigneusement, en prenant soin de ne pas endommager le cerveau sous-jacent (Figure 1G-I).
  6. Retirez le cervelet et le bulbe olfactif à l’aide d’une lame de rasoir et coupez le cerveau en deux morceaux (Figure 1J).
  7. Placez les morceaux de cerveau dans une boîte de Petri contenant 30 à 40 ml de HBSS-/- (Figure 1K).

3. Dissociation cérébrale et isolement microglial magnétique

REMARQUE: Toutes les manipulations et resuspensions de cellules doivent être effectuées avec une pipette de 1 000 μL avec une grande prudence. L’application d’une action mécanique élevée peut activer ou tuer les cellules microgliales.

  1. Transférer 12 morceaux de cerveau (~1,2 g) par tube de dissociation contenant un mélange de dissociation conformément au tableau 1. Pour 24 petits, quatre tubes C étaient nécessaires (figure 2A-B).
  2. Placez les tubes C sur le dissociateur (avec le mode de chauffage). Démarrez le programme NTDK optimisé dans l’équipement conformément aux instructions du fabricant (Figure 2D).
  3. Centrifuger à 300 x g pendant 20 s (à 4 °C) pour recueillir toutes les cellules. Complétez la dissociation mécanique en pipetant trois fois de haut en bas avec une pipette de 1 000 μL (figure 2E).
  4. Transférer les cellules dans quatre tubes de 15 ml + crépines. Rincer les crépines avec 10 ml de HBSS+/+ (Figure 2F).
  5. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 10 mL de HBSS+/+ (Figure 2G).
  6. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 6 mL de tampon de tri (étape 1.4) (figure 2H).
  7. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Ajouter 200 μL de solution de microbilles CD11b (étape 1.5) par tube et remettre en suspension délicatement (figure 2I).
  8. Incuber les tubes pendant 15-20 min à 4 °C. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 6 mL de tampon de tri (figure 2I-J).
  9. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 8 mL de tampon de tri (figure 2K).
  10. Suivez le programme POSSEL sur le séparateur (voir le tableau des matériaux) pour préparer huit colonnes. Transférer des cellules de 1 mL par 1 mL sur la colonne. Attendez que toutes les cellules passent avant d’ajouter une autre ml. Cellules élutées CD11b+ sur plaque d’élution stérile avec 1 mL de tampon de tri (Figure 2L).
  11. Regrouper les cellules CD11b+ dans un nouveau tube de 50 ml (figure 2M).
  12. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 10 mL de milieu microglial froid (étape 1.6) (Figure 2N).
  13. Comptez les cellules CD11b+. À P8, on devrait obtenir ~650 000 cellules par cerveau.
    REMARQUE : Dans le présent protocole, les cellules étaient comptées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matières).
  14. Resuspendre les cellules dans un milieu microglial froid jusqu’à une concentration finale de 650 000 à 700 000 cellules/ml et les distribuer dans des plaques de culture cellulaire.
    REMARQUE : Les plaques à 6 puits sont destinées au transfert Western (2 mL par puits); les plaques de 12 puits sont destinées à l’analyse RT-qPCR (1 mL par puits) et les plaques à 96 puits sont destinées à l’analyse phagocytaire (250 μL par puits); Tous les trois ont été utilisés pour ce travail. Cependant, dans ce manuscrit, les résultats de l’analyse Western Blot ne sont pas présentés, mais il est possible de le faire avec ce protocole.
  15. Placer les plaques à 37 °C avec 5% de CO2 pendant la nuit. Changez soigneusement le milieu avec une pipette de 1 000 μL avec un milieu microglial préchauffé.
  16. Placer les plaques à 37 °C avec 5% de CO2 pendant la nuit avant la stimulation.
    REMARQUE: L’isolement de la microglie de plus de 36 petits et après P9 n’est pas recommandé. Cela augmentera le risque de contamination et d’accumulation de débris cellulaires pour activer la microglie.

4. Stimulations cellulaires

  1. Préparer les réactifs de stimulation conformément au tableau 3 en utilisant les réactifs disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
  2. Ajouter le volume approprié dans chaque puits stimulé.
    REMARQUE : Le volume approprié dépend de la concentration du stimulus et de la taille du puits.
  3. Placer les plaques à 37 °C avec 5% de CO2jusqu’à la fin de la stimulation à 6 h, 24 h ou 48 h.
  4. Pour l’analyse Western Blot, aspirer le surnageant et ajouter 50 μL de tampon de lyse protéique (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’une pipette. À l’aide de pointes, grattez le fond de la plaque pour détacher les cellules lysées et transférez-les dans des tubes de 1,5 mL. Conserver à -80 °C.
    NOTE: Les plaques de culture peuvent être conservées pendant des années à -80 ° C si le surnageant est aspiré correctement.
  5. Pour l’analyse RT-qPCR 6,31, aspirer le surnageant et stocker les plaques de culture directement à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARNm (étape 5).
  6. Pour le dosage phagocytaire, veuillez consulter l’étape 6.

5. Extraction d’ARNm et analyse RT-qPCR

  1. Effectuer l’extraction de l’ARN, la RT-PCR et la RT-qPCR en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux). Voir le tableau 4 pour les séquences d’amorces 5,6,31.
  2. Effectuez une analyse RT-qPCR en suivant le rapport publié précédemment5.

6. Dosage phagocytaire

  1. Stimuler les cellules et effectuer un dosage phagocytaire pendant les 3 dernières heures de la stimulation. Par exemple, pour une stimulation de 6 h, commencez le test phagocytaire après 3 h de stimulation; et pour une stimulation de 12 h, commencer le test phagocytaire 9 h après le début de la stimulation.
  2. Calculez le nombre de billes nécessaires à la préparation en tenant compte du ratio (1 cellule : 50 perles). Pour un puits de la plaque de 96 puits, 8,1 x 106 perles sont nécessaires. Préparer le mélange de billes conformément au tableau 5.
    REMARQUE: Vortex soigneux le flacon de billes avant de les ajouter au mélange PBS / FBS.
  3. Incuber pendant 1 h au bain-marie à 37 °C. Vortex toutes les 10 min.
  4. Calculez le volume de solution à ajouter à chaque puits. Ajouter la solution et incuber pendant 3 h.
  5. Rincez les puits trois fois avec 1x PBS. Lire l’émission de fluorescence à 550 nm (longueur d’onde d’émission Cy3).

7. Contrôle de la qualité de la pureté

  1. Évaluer la pureté de l’isolement magnétique CD11b par cytométrie en flux (FACS) (avant et après le tri cellulaire), puis effectuer la RT-qPCR.
    1. Compter les cellules et les remettre en suspension dans le tampon FACS (PBS + 2 mM d’EDTA + 0,5% d’albumine sérique bovine) afin d’obtenir une dilution de 10 x 106 cellules/mL après les étapes 3.5 et 3.14.
    2. Après 15 min du Fc conventionnel bloquant 32,33, incuber les cellules pendant 15 min avec une sonde de viabilité (FVS780) et des anticorps conjugués fluorophore contre la souris CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 ou leurs isotypes témoins correspondants32,33 à la concentration recommandée par les fabricants (voir tableau des matériaux).
    3. Laver les cellules avec un tampon FACS, fixer et perméabiliser avec un kit de perméabilisation disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
    4. Effectuer à nouveau le blocage de Fc sur les cellules perméabilisées, puis incuber avec un anticorps conjugué fluorophore contre NeuN (voir Tableau des matériaux) ou son isotype témoin pendant 15 min.
    5. Effectuez une analyse FACS après le lavage avec le tampon FACS.
    6. Après avoir exclu les doublets et les cellules mortes en fonction des paramètres morphologiques et de la coloration FVS780, respectivement, sélectionnez la stratégie de déclenchement pour l’expression de surface de CX3CR1 (microglie), ACSA-2 (astrocytes), O4 (oligodendrocytes) et la présence intracellulaire de NeuN (neurones) pour l’analyse du pourcentage de cellules positives.
  2. Après l’étape 5, extraire l’ARNm et effectuer la RT-qPCR pour quantifier Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysine et ARNm Gfap . Normalisez Cq en utilisant l’ARNm Rpl13a comme rapporteur et effectuez une expression relative à l’ARNm Itgam .

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Résultats

La microglie est le macrophage résident du SNC qui s’active lorsqu’il est exposé à des défis environnementaux (traumatisme, molécules toxiques, inflammation)4,5,6,34 (Figure 3A). Les études in vitro sur la microglie sont couramment utilisées pour évaluer les mécanismes autonomes cellulaires liés à ces défis environnementaux et caractériser l’état d’activat...

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Discussion

Les travaux actuels présentent une culture cellulaire microgliale primaire utilisant des cellules CD11b+ triées magnétiquement. En plus de l’évaluation fonctionnelle microgliale (RT-qPCR et tests phagocytaires), la pureté de la culture microgliale a également été déterminée.

Les cultures classiques de cellules microgliales sont généralement générées à partir du cerveau du nouveau-né de rongeurs P1 ou P2 et co-culture avec des astrocytes pendant au moins 10 jours. Les microglies sont ensuite sé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les figurines ont été créées à l’aide de BioRender. La recherche est financée par l’Inserm, l’Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), la Fondation de France, la Fondation ARSEP, la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, la Fondation Grace de Monaco, et une subvention complémentaire d’Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS et Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti souris ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti souris CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti souris CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti souris CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti souris NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti souris O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm perméabilization kitBD Biosciences554655
Albumine sérique bovineMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglie) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Microscope confocalLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Culture cellulaire Plaque 12 puits, fond plat + couvercleDutscher353043
Falcon Culture cellulaire 96 puits, fond plat + couvercleDutscher353072
Falcon tubes 50 mLDutscher352098
Fc Blocking reagent (Souris CD16/32)BD Biosciences553142
Microscope à fluorescenceNikon ECLIPSE TE300
gentleTubes MACS C (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleDissociateur MACS Octo avec réchauffeursMiltenyi Biotec130-096-427
Solution saline équilibrée Hanks (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Solution saline équilibrée Hanks (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR  ; Vert SupermixBio-rad1725006CUST
Synthèse d’ADNc IscriptBio-rad1708890
Perles de latex, polystyrène modifié aux amines, rouge fluorescentSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) de  ; Escherichia coli  ; O55 :B5Sigma-AldrichL2880
Milieu sans sérum Macrophage-SFMThermo Scientific12065074
MACS BSA Solution MèreMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 &mu ; m), 4 x 25 piècesMiltenyi Biotec130-110-916
Souris IgG1 PEMilliporeMABC002H
Souris IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Souris IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Blocs de colonnesMiltenyi Biotec130-095-691
Séparateur MultiMACS Cell24Miltenyi Biotec
Kit de Dissociation du Tissu Neural - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Tubes à CentrifugerConiques Thermo Scientific362694
OPTILUX Boîte de Pétri - 100 x 20 mmDutscher
Pé ; nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Protéine IFN-gamma de souris recombinanteR& D System485-MI
Souris recombinante IL-10 ProtéineR& D System417-ML
Souris recombinante IL-4 Protéine R& D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Sonde de viabilité (FVS780)BD Biosciences565388
353003

Références

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286(2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819(2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297(2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378(2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463(2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748(2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769(2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15(2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237(2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166(2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242(2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651(2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22(2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428(2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809(2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545(2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99(2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277(2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561(2018).

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