Préparation des échantillons et quantification relative à l’aide de la méthylation réductrice des amines pour les études peptidomiques

Summary

Cet article décrit une méthode de préparation d’échantillons basée sur l’inactivation thermique pour préserver les peptides endogènes en évitant la dégradation post-mortem, suivie d’une quantification relative utilisant le marquage isotopique plus LC-MS.

Abstract

La peptidomique peut être définie comme l’analyse qualitative et quantitative des peptides dans un échantillon biologique. Ses principales applications comprennent l’identification des biomarqueurs peptidiques de la maladie ou du stress environnemental, l’identification des neuropeptides, des hormones et des peptides intracellulaires bioactifs, la découverte de peptides antimicrobiens et nutraceutiques à partir d’hydrolysats de protéines, et peut être utilisé dans des études pour comprendre les processus protéolytiques. Les progrès récents dans la préparation des échantillons, les méthodes de séparation, les techniques de spectrométrie de masse et les outils informatiques liés au séquençage des protéines ont contribué à l’augmentation du nombre de peptides identifiés et des peptidomes caractérisés. Les études peptidomiques analysent fréquemment les peptides naturellement générés dans les cellules. Ici, un protocole de préparation d’échantillon basé sur l’inactivation thermique est décrit, ce qui élimine l’activité de la protéase et l’extraction dans des conditions douces, de sorte qu’il n’y a pas de clivage des liaisons peptidiques. En outre, la quantification relative des peptides à l’aide du marquage isotopique stable par méthylation réductrice des amines est également montrée. Cette méthode d’étiquetage présente certains avantages car les réactifs sont disponibles dans le commerce, peu coûteux par rapport aux autres, chimiquement stables et permettent l’analyse de jusqu’à cinq échantillons en une seule série LC-MS.

Introduction

Les sciences « omiques » sont caractérisées par l’analyse approfondie d’un ensemble de molécules, telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, les peptides, les métabolites, etc. Ces ensembles de données générés à grande échelle (génomique, transcriptomique, protéomique, peptidomique, métabolomique, etc.) ont révolutionné la biologie et conduit à une compréhension avancée des processus ^biologiques1. Le terme peptidomique a commencé à être introduit au début du ^20ème siècle, et certains auteurs l’ont appelé une branche de la protéomique2. Cependant, la peptidomique présente des particularités distinctes, où l’intérê....

Protocol

La procédure suivante pour l’extraction peptidique et la méthylation réductrice a été adaptée des procédures précédemment ^{publiées24,25,26,27}. Ce protocole suivait les directives du Conseil national pour le contrôle de l’expérimentation animale (CONCEA) et a été approuvé par la Commission d’éthique pour l’utilisation animale (CEUA) de l’Institut des biosciences de l’Université d’État de Sao Paulo. Les étapes du protocole sont illustrées à la figure 1.

REMARQUE: Préparer toutes les sol....

Results

Les résultats obtenus à partir des exécutions effectuées sur le spectromètre de masse sont stockés dans des fichiers de données brutes qui peuvent être ouverts dans le logiciel du spectromètre de masse. Dans les spectres MS, il est possible d’observer des groupes de pics représentant des peptides marqués selon le schéma de marquage utilisé, allant de 2 à 5 étiquettes. Par exemple, dans la figure 2, des paires de pics détectés dans un temps chromatographique sont représentées dans une expérie.......

Discussion

Dans la plupart des études peptidomiques, l’une des étapes critiques est, sans aucun doute, la préparation de l’échantillon qui doit être soigneusement effectuée pour éviter la présence de fragments peptidiques générés par les protéases après quelques minutes post-mortem. Les premières études sur les extraits cérébraux préparés à partir d’échantillons non micro-ondes ont montré la présence d’un grand nombre de fragments de protéines dans les microfiltrats de 10 kDa. Différentes approches ont été décrites pour éviter les .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtres de coupure 10 kDa	Merck Millipore	UFC801024	Amicon Ultra-4, membrane PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
acétone	Sigma-Aldrich	179124
bicarbonate d’ammonium	Sigma-Aldrich	11213
colonne analytique (EASY-Column)	EASY-Column	(SC200)	; 10 cm, ID75 & micro ; m, 3 et micro ; m, C18-A2
Méthanesulfonate de 3-aminobenzoate d’éthyle	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Fluorescamine	Sigma-Aldrich	F9015
Solution de formaldéhyde	Sigma-Aldrich	252549
Formaldéhyde-13C, d2, solution	Sigma-Aldrich	596388
Formaldéhyde-d2 solution	Sigma-Aldrich	492620
Acide formique	Sigma-Aldrich	33015
Hotte	Quimis	Q216
Acide chlorhydrique - HCl	Sigma-Aldrich	258148
LoBind-Protein	tubes de rétention Eppendorf	EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific	LTQ Velos
Four à micro-ondes	Panasonic	NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLC	Thermo Fisher Scientific	LC140
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions Inc.	VERSION 8.5
Solution saline tamponnée au phosphate	Invitrogen	3002	comprimés
précolonne (EASY-Column)	Thermo Fisher Scientific	(SC001)	2 cm, ID100 µ ; m, 5 et micro ; m, C18-A1
Centrifugeuse réfrigérée	Hermle	Z326K	pour tubes coniques
Centrifugeuse réfrigérée	Vision	VS15000CFNII	pour microtubes
Colonnes de nettoyage en phase inverse  ;   ; (Cartouche Oasis HLB 1 cc)	Waters	186000383	Oasis HLB 1 cc
Cartouche Cyanoborodeutéride de sodium - NaBD3CN	Sigma-Aldrich	190020
Cyanoborohydrure de sodium - NaBH3CN	Sigma-Aldrich	156159
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	S9763	REMARQUE : 0,2 M PB= 0,1 M tampon phosphate pH 6,8 (26,85 mL de Na2HPO3 1M) plus 0,1 M tampon phosphate pH 6,8 (23,15 mL de NaH2PO3 1M) à 250 ml d’eau
Phosphate de sodium monobasique	Sigma-Aldrich	S3139
Sonicateur	Qsonica Qsonica	Q55-110
Peptide standard	Proteimax		: LTLRTKL
Tampon triéthylammonium - TEAB 1 M	Sigma-Aldrich	T7408
Acide trifluoroacétique - TFA	Sigma-Aldrich	T6508
Eau ultra purifiée	Milli-Q	Direct-Q 3UV
Centrifugeuse sous vide	GeneVac	MiVac Concentrateur
Bain-marie	Cientec	266
Xcalibur	Logiciel ThermoFisher Scientific	OPTON-30965