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Article de méthode

Imagerie à molécule unique de condensats EWS-FLI1 assemblés sur de l’ADN

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DOI :

10.3791/62974

⸱

8 septembre 2021

 ,  , 
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons l’utilisation de la méthode d’imagerie à molécule unique, les rideaux d’ADN, pour étudier le mécanisme biophysique des condensats EWS-FLI1 assemblés sur l’ADN.

Résumé

Les gènes de fusion résultant de la translocation chromosomique ont été trouvés dans de nombreuses tumeurs solides ou leucémies. EWS-FLI1, qui appartient à la famille des oncoprotéines de fusion FUS/EWS/TAF15 (FET), est l’un des gènes de fusion les plus fréquemment impliqués dans le sarcome d’Ewing. Ces protéines de fusion de la famille FET hébergent généralement un domaine de faible complexité (LCD) de la protéine FET à leur extrémité N et un domaine de liaison à l’ADN (DBD) à leur extrémité C. Il a été confirmé que EWS-FLI1 forme des condensats biomoléculaires à ses loci de liaison cibles en raison des interactions LCD-LCD et LCD-DBD, et ces condensats peuvent recruter l’ARN polymérase II pour améliorer la transcription des gènes. Cependant, la façon dont ces condensats sont assemblés sur leurs sites de liaison reste incertaine. Récemment, une méthode biophysique à molécule unique, DNA Curtains, a été appliquée pour visualiser ces processus d’assemblage des condensats EWS-FLI1. Ici, le protocole expérimental détaillé et les approches d’analyse des données sont discutés pour l’application des rideaux d’ADN dans l’étude des condensats biomoléculaires assemblés sur l’ADN cible.

Introduction

La régulation transcriptionnelle est une étape cruciale pour l’expression précise des gènes dans les cellules vivantes. De nombreux facteurs, tels que la modification chromosomique, les facteurs de transcription (TF) et les ARN non codants, participent à ce processus compliqué 1,2,3. Parmi ces facteurs, les TF contribuent à la spécificité de la régulation transcriptionnelle en reconnaissant et en se liant à des séquences d’ADN spécifiques appelées promoteurs ou amplificateurs, puis en recrutant d’autres protéines fonctionnelles pour activer ou réprimer la transcription 4,5,6,7. La façon dont ces TF parviennent à rechercher leurs sites cibles dans le génome humain et à interagir avec l’ADN recouvert d’histones et de protéines non liant l’ADN aux histones a laissé les scientifiques perplexes pendant des décennies. Au cours des dernières années, plusieurs modèles classiques pour le mécanisme de recherche de cibles des TF ont été construits pour décrire comment ils « glissent », « sautent », « sautent » ou « transfèrent entre segments » le long de la chaîne d’ADN 8,9,10,11. Ces modèles sont axés sur le comportement de recherche sur l’ADN d’une seule molécule TF. Cependant, des études récentes montrent que certains TF subissent une séparation en phase liquide-liquide (LLPS) soit seuls dans le noyau, soit avec le complexe Mediator12. Les gouttelettes observées de TF sont associées aux régions promotrices ou amplificateurs, mettant en évidence le rôle de la formation de condensats biomoléculaires dans la transcription et le génome tridimensionnel13,14,15. Ces condensats biomoléculaires sont liés à des compartiments dépourvus de membrane in vivo et in vitro. Elles sont formées via LLPS, dans lesquelles les biomacromolécules modulaires et les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) des protéines sont deux forces motrices principales des interactions multivalentes16. Ainsi, les TF non seulement recherchent l’ADN, mais fonctionnent également en synergie au sein de ces condensats 4,17,18. À ce jour, la propriété biophysique de ces condensats de transcription sur l’ADN reste incertaine.

Par conséquent, cette étude visait à appliquer une méthode à molécule unique - DNA Curtains - pour imager directement la formation et la dynamique des condensats de transcription formés par les TF sur l’ADN in vitro. DNA Curtains, une plate-forme d’imagerie in vitro à haut débit pour étudier l’interaction entre les protéines et l’ADN, a été appliquée à la réparation de l’ADN 19,20,21, à la recherche de cibles22 et à LLPS 17,23,24. La cellule d’écoulement des rideaux d’ADN est recouverte de bicouches lipidiques biotinylées pour passiver la surface et permettre aux biomolécules de diffuser à la surface. Les motifs en zigzag nanofabriqués limitent le mouvement de l’ADN. Les substrats d’ADN lambda biotinylé peuvent s’aligner le long des bords de la barrière et être étirés par le flux tampon orienté. Les mêmes séquences de début et de fin de toutes les molécules permettent le suivi de la protéine sur l’ADN et décrivent la distribution de position des événements de liaison25,26. De plus, la combinaison de rideaux d’ADN avec la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM) aide à minimiser le bruit de fond et à détecter les signaux au niveau d’une seule molécule. Ainsi, les rideaux d’ADN pourraient être une méthode prometteuse pour étudier la dynamique de la formation de condensats de transcription sur les motifs d’ADN. Cet article décrit l’exemple d’une oncoprotéine de fusion familiale FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, générée par translocation chromosomique. L’ADN lambda contenant 25× GGAA - la séquence de liaison de EWS-FLI127 - a été utilisé comme substrat d’ADN dans les expériences DNA Curtains pour observer comment les molécules EWS-FLI1 subissent LLPS sur ADN. Ce manuscrit traite en détail du protocole expérimental et des méthodes d’analyse des données.

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Protocole

1. Préparation du mélange maître bicouche lipidique

  1. Rincer les flacons en verre avec de l’eau bidistillée (ddH2O) et de l’éthanol à 99 % et les sécher dans une étuve de séchage à 60 °C.
  2. Préparer le mélange principal lipidique en dissolvant 1 g de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 100 mg de lipides à réaction au polyéthylèneglycol (PEGylated) (18:1 de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy (polyéthylèneglycol)-2000] (sel d’ammonium) (PEG2000 DOPE) et 25 mg de lipides biotinylés (18:1 de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(capsule biotinyl) (sel de sodium) (Biotinyl Cap DOPE)) dans 10 mL de chloroforme.
  3. Préparer 1 mL d’aliquotes du mélange maître lipidique par flacon et les conserver à -20 °C dans des flacons en verre propre.
    REMARQUE: Conservez les lipides dissous dans des flacons en verre et couvrez le bouchon du flacon avec un parafilm pendant le stockage.

2. Préparation de la solution liposomique

  1. Rincer un flacon en verre de 2 ml avec duddH2Oet de l’éthanol à 99 % et sécher soigneusement dans une étuve de séchage à 60 °C.
  2. Rincer une seringue en verre de 250 μL avec du chloroforme, puis transférer 200 μL du mélange principal lipidique dans le flacon en verre sec.
  3. Utilisez un pistolet pulvérisateur d’azote pour faire circuler doucement N2 tout en tournant continuellement le flacon dans une direction.
    REMARQUE: LeN2 aidera à évaporer le chloroforme et les lipides résiduels formeront un film mince sur la paroi du flacon en verre. Ajustez le jet d’azote pour qu’il soit très doux au début et augmentez le débit lorsqu’un film blanc apparaît dans le flacon; Terminez ce processus d’évaporation en 5 minutes.
  4. Transférer le flacon en verre dans une étuve de séchage sous vide à température ambiante (RT) pendant 16-24 h pour éliminer complètement le chloroforme des lipides.
  5. Ajouter 2 mL de tampon lipidique frais (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) et 100 mM de NaCl) dans le flacon en verre et dissoudre les lipides à TA pendant 2 h. Tourbillonner la solution plusieurs fois et la transférer dans un tube de culture en polypropylène de 5 mL.
  6. Sonicer la solution lipidique sur glace avec un sonicateur micro-tip pour former de petites vésicules unilamellaires, en utilisant les réglages suivants: 6 s on-12 s off (20% d’amplitude) pendant 6 cycles, puis 6 s on-6 s off (30% d’amplitude) pendant 3 cycles, enfin 10 s on (40% d’amplitude).
    REMARQUE: L’augmentation de la température pendant la sonication pourrait entraîner l’éclatement de la mousse et détruire les liposomes. Par conséquent, vérifiez l’état de la mousse et la température et reconstituez la glace fréquemment.
  7. Filtrer les liposomes à travers un filtre à seringue en nylon de 0,22 μm, aliquote, et les conserver à 4 °C.
    REMARQUE: Comme leur mobilité diminue avec un stockage prolongé, les liposomes doivent être utilisés dans 2-3 mois ou préparés fraîchement avant utilisation.

3. Clonage de séquence et biotinylation de l’ADN lambda

  1. Insertion des motifs de liaison dans l’ADN Lambda
    1. Digérez le fragment cible contenant les motifs de liaison et l’ADN lambda avec NheI et XhoI. Libellez le fragment cible avec de l’ADN lambda en utilisant la T4 ligase pendant la nuit à RT.
    2. Culture de cellules E. coli VCS257 dans un milieu LB sans antibiotique jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,6. Conservez les bactéries à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
    3. Chauffer la solution de ligature à 65 °C pendant 20 min pour dénaturer la T4 ligase.
    4. Décongeler l’extrait de phage Lambda, le mélanger délicatement avec le produit ligaturé en le pipetant avec des pointes émoussées, et incuber le mélange à TA pendant 2 h.
    5. Ajouter 500 μL de tampon SM (50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl et 8 mM de MgCl2, filtré à travers un filtre de 0,22 μm) et 20 μL de chloroforme dans le mélange d’emballage à partir de l’étape 3.1.4, bien mélanger et centrifuger la solution.
      NOTE: L’activité de l’extrait d’emballage peut être maintenue à 4 ° C pendant des périodes prolongées.
    6. Préparer le mélange réactionnel en mélangeant 10 μL d’extrait d’emballage avec 90 μL de tampon SM et 100 μL de cellules VCS257 (à partir de l’étape 3.1.2) ensemble, et incuber le mélange à 37 °C pendant 15 min.
      NOTE: La concentration de la solution d’emballage dépend de la densité des plaques de phage le lendemain; Il peut être dilué ou ajouté au besoin.
    7. Prendre ~5 mL de gélose supérieure fondue (22 g/L de bouillon NZCYM avec 15 g/L d’agar) dans un tube de 15 mL. Dès que la gélose supérieure refroidit à ~42 °C, ajouter lentement le mélange réactionnel (à partir de l’étape 3.1.6) à l’aide d’une pipette à extrémité émoussée et verser le liquide sur une plaque de gélose LB sans antibiotique. Conservez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.
    8. Confirmer les plaques positives parmi les plaques de phages transparentes sur la plaque de gélose supérieure par PCR. Transférer les plaques positives sur une nouvelle plaque de gélose supérieure à l’aide d’une pipette et conserver la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.
    9. Ajouter 400 μL de cellules VCS257 dans 400 μL de tampon contenant 10 mM MgCl2 et 10 mM CaCl2, inoculer une plaque dans ce mélangecellulaire et l’incuber dans un agitateur à 37 °C à 250 rpm pendant 15 min.
    10. Ajouter 800 μL de cette suspension contenant la plaque de phage à 200 mL de bouillon NZCYM dans une fiole de 2 L et l’incuber dans un agitateur à 37 °C à 125 tr/min.
    11. Mesurer OD600 de la suspension bactérienne après ~4 h de culture. Gardez à l’esprit que la valeur OD600 augmentera d’abord, puis tombera à un creux à ~0,2. Arrêtez l’incubation lorsque la valeur OD 600 est sur le point d’augmenter à nouveau, ajoutez500 μL de chloroforme et agitez à 80 tr/min pendant encore 5 minutes.
      NOTE: L’augmentation de OD600 après le creux se produira rapidement; par conséquent, la valeur OD600 doit être mesurée plus souvent lorsqu’elle diminue à 0,3 pour éviter une croissance excessive des cellules VCS257 dans la culture.
    12. Transférer la culture de phages dans une bouteille de 500 mL, ajouter 11,7 g de NaCl et agiter le flacon. Incuber la bouteille sur de la glace pendant 10 min.
    13. Transférer la suspension également dans quatre tubes de 50 mL. Centrifuger les tubes à 12 000 x g pendant 10 min.
      NOTA: Toutes les étapes de centrifugation décrites au point 3.1 doivent être effectuées à 4 °C.
    14. Transférer les surnageants dans quatre nouveaux tubes de 50 ml et centrifuger à nouveau à la même vitesse pendant 5 min.
    15. Recueillir les surnageants, ajouter 10% (p/v) de poudre PEG8000 et faire tourner à 4 °C pour incuber pendant 30 min.
    16. Centrifuger les suspensions de l’étape 3.1.15 à 12 000 x g pendant 15 min pour obtenir les granulés de phage.
    17. Remettez les pastilles en suspension dans 1 mL de tampon de dilution de phage (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl et 10 mM de MgCl2) dans quatre tubes et versez les 4 mL de ces mélanges dans un tube de 50 mL.
    18. Ajouter la RNase A (10 mg/mL) et la DNase I (4 mg/mL) à des concentrations finales de 20 μg/mL et 5 μg/mL et incuber à 37 °C pendant 30 min pour dégrader les acides nucléiques en excès.
    19. Ajouter 4,5 mL de Tris-HCl 300 mM (pH 7,5), 2,76 mL d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) 0,5 M, 1,67 mL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % et 75 μL de protéinase K (10 mg/mL) dans le tube et incuber à 65 °C pendant 10 min.
    20. Ajouter 4,5 mL d’acétate de potassium 3 M prérefroidi et incuber sur de la glace pendant 10 min.
    21. Centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min, et faire tourner le surnageant pendant 5 minutes supplémentaires à 10 000 x g.
    22. Ajouter 70% de volume d’isopropanol dans le surnageant recueilli (à partir de l’étape 3.1.21) en mélangeant suffisamment, incuber à TA pendant 2 min, puis centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min. Jeter l’isopropanol et essorer à nouveau pendant 5 min.
      NOTE: La pastille d’ADN sera étalée avant les 10 premières minutes de centrifugation; La pastille sera concentrée au fond du tube après la deuxième centrifugation de 5 minutes.
    23. Laver l’ADN précipité avec 2-3 mL d’éthanol à 70% et tourner à nouveau pendant 1 min. Sécher la pastille à 4 °C pendant 2 h, puis remettre l’ADN en suspension dans 500 μL de tampon TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) et 1 mM EDTA) pendant une nuit à TA.
    24. Transférer l’ADN dans un tube de 1,5 mL et le faire tourner à 18 000 x g pendant 3 min. Transférer l’ADN dans un nouveau tube de 1,5 mL. Aliquote l’ADN lambda purifié et stockez-le à -20 °C.
  2. Préparation d’ADN Biotine-Lambda
    1. Faire fondre 50 μL d’ADN lambda purifié avec motifs clonés à 65 °C pendant 10 min.
      REMARQUE: Comme l’ADN lambda mesure ~ 48 kbp de long, il doit être chauffé avant le pipetage pour éviter les cassures de l’ADN.
    2. Mélanger 50 μL d’ADN lambda, 1 μL d’apprêt biotine (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) et 54 μL deddH2Oensemble. Co-incuber le mélange à 65 °C pendant 5 min et le laisser refroidir sur le banc pour refroidir à TA.
    3. Ajouter 12 μL de tampon 10x T4 ligase et 3 μL de T4 ligase, et incuber à TA pendant plusieurs heures ou toute la nuit.
    4. Ajouter un volume égal de mélange phénol-chloroforme (1:1) au produit de ligature, bien mélanger immédiatement et centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min à TA.
    5. Transférer soigneusement la phase aqueuse supérieure contenant l’ADN dans un nouveau tube, ajouter un volume égal de chloroforme, bien mélanger, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min.
    6. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube, ajouter un volume égal d’isopropanol et 10% du volume d’acétate de sodium 3 M et incuber à TA pendant 2 min. Centrifuger le mélange à 12 000 x g pendant 5 min.
    7. Retirer le surnageant, laver la pastille avec de l’éthanol à 75%, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min.
    8. Retirer l’éthanol à 75%, sécher l’ADN à l’air libre à TA pendant 10 minutes et utiliser 120 μL de tampon TE pour dissoudre l’ADN.
    9. Ajouter 60 μL de tampon A (30 % (p/v) PEG8000 et 30 mM MgCl 2) à 120 μL de la solution à partir de l’étape3.2.8, et faire tourner à 4 °C pendant 20-24 h.
    10. Centrifuger le mélange à 18 000 g pendant 5 min, et retirer le surnageant.
    11. Utilisez 180 μL d’éthanol prérefroidi à 75 % pour laver la pastille et répétez l’étape 3.2.10.
    12. Sécher la pastille à TA et utiliser 100 μL de tampon TE150 pour dissoudre l’ADN.

4. Barrières en zigzag nanofabriquées

  1. Nettoyez les lames d’acétone pendant 20 minutes par sonication et transférez-les dans un nouveau récipient en verre avec 1 M NaOH pour la sonication pendant 20 minutes supplémentaires. Mélanger 90 mL de H2SO4 avec 30 mL deH2O2, et immergerles lames dans ce mélange pendant 30 min. Rincer les lames avec de l’acétone et de l’isopropanol et sécher les lames avec N2.
    NOTE: Le mélange de H2SO4 et H2O2est un procédé exothermique; prendre les mesures de sécurité adéquates pendant l’opération.
  2. Enduisez successivement la lame nettoyée de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) 25 kDa, de PMMA de 49,5 kDa et de la couche supérieure de revêtement protecteur conducteur. Utilisez la lithographie par faisceau d’électrons pour écrire les barrières en zigzag (Figure 1A).
  3. Lavez les lames avec ddH2O pour enlever le revêtement protecteur conducteur et séchez les lames avec duN2.
  4. Déposer une couche de chrome (Cr) de 30 nm à l’aide d’une machine de pulvérisation magnétron et retirer les couches de PMMA restantes avec de l’acétone.
    REMARQUE: Une cellule de flux peut être réutilisée pour plus de 20 expériences de rideaux d’ADN. Pour réutiliser la cellule d’écoulement, lavez-la avec de l’éthanol, du détergent et du NaOH.

5. Purification de la protéine EWS-FLI1

REMARQUE: L’observation de 500 nM EWS-FLI1 sur de l’ADN lambda avec des motifs GGAA 25× sert de bon exemple pour l’application de rideaux d’ADN à la formation de condensats. EWS-FLI1 est une protéine de fusion combinant le N-terminal de EWSR1 (1-265) et le C-terminal de FLI1 (220-453). Une étiquette mCherry a été fusionnée à la N-terminale de la protéine de fusion EWS-FLI1 pour la visualisation.

  1. Cloner le gène EWS-FLI1 dans un vecteur pRSF reconstitué ou tout autre vecteur d’expression procaryote approprié.
  2. Transformer le plasmide codant 7x pour His-mCherry-EWSFLI1 en souche E. coli BL21(DE3); cultiver une seule colonie dans 5 mL de milieu LB à 37 °C pendant la nuit. Lorsque la valeur OD600 atteint 0,6-0,8 après transfert dans 2 L de milieu LB, ajouter 0,5 mM IPTG et agiter la culture cellulaire à 18 °C pendant 16-18 h.
  3. Centrifuger la culture pour éliminer le surnageant et remettre les cellules en suspension avec un tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M KCl; 1 M urée; 10 mM imidazole; 1,5 mM bêta-mercaptoéthanol (β-ME); et 5% glycérol).
  4. Après sonication et centrifugation à 18000 × g pendant ~30 min, charger le surnageant sur de la résine Ni-NTA équilibrée dans un volume 5 fois de tampon de lyse, puis laver la résine avec un volume 10 fois de tampon de lavage (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M d’urée, 40 mM d’imidazole, 1,5 mM β-ME et 5% de glycérol).
  5. Éluer la protéine liée avec 15 mL de tampon d’élution (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M urée, 500 mM imidazole, 1,5 mM β-ME et 5% glycérol) et concentrer l’élution à ~500 μL.
  6. Charger la solution protéique concentrée sur une colonne de filtration sur gel et analyser les produits par électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide. Congeler rapidement la protéine purifiée dans de l’azote liquide et la conserver à -80 °C.

6. Préparation d’une cellule d’écoulement de rideaux d’ADN

  1. Préparez une cellule d’écoulement avec des barrières nanofabriquées en zigzag pour une expérience de rideaux d’ADN et déterminez la direction de l’écoulement. Pour ce faire, connectez les tubes d’entrée et de sortie dans la bonne direction.
  2. Laver la cellule d’écoulement avec 2,5 mL de tampon lipidique à l’aide de deux seringues de 3 mL. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulle dans la cellule d’écoulement.
  3. Retirer la seringue de la sortie et injecter 1 mL de la solution liposomique (40 μL de matériel de liposomes de la section 2 et 960 μL de tampon lipidique) trois fois avec 5 minutes d’incubation après chaque injection.
  4. Pour l’étape de guérison, laver lentement la cellule d’écoulement avec 2,5 ml de tampon lipidique et incuber à TA pendant 30 minutes.
    REMARQUE: Le temps de guérison peut être plus long si nécessaire; Si des bulles apparaissent, effectuez une double cicatrisation en répétant les étapes 5.3 et 5.4 pour supprimer les bulles.
  5. Préparer 30 mL de tampon d’albumine sérique bovine (BSA) (40 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM de MgCl2, 1 mM de dithiothréitol et 0,5 mg/mL de BSA pour la passivation de surface). Après 30 min de cicatrisation, laver la cellule de flux avec 2,5 mL de tampon BSA du côté de la sortie.
    NOTE: Le stock BSA est une solution de 20 mg / mL stockée à 4 ° C et doit être utilisée dans les 1-2 semaines. La concentration de BSA dans le tampon peut être ajustée en fonction de l’état de surface.
  6. Injecter 800 μL de tampon de streptavidine (10 μL d’un stock de streptavidine de 1 mg/mL, 790 μL de tampon BSA) dans la cellule d’écoulement du côté de l’entrée en deux étapes avec 10 minutes d’incubation après chaque étape.
    REMARQUE: La streptavidine ancre l’ADN sur les lipides en raison de sa multivalence en faisant le pont entre les lipides biotinylés et l’ADN biotinylé.
  7. Lavez la cellule d’écoulement avec 2,5 ml de tampon BSA pour éliminer toutes les molécules de streptavidine libres.
  8. Diluer l’ADN Biotine-Lambda avec les motifs clonés de la section 3 à l’aide d’un tampon BSA (2,5 μL d’ADN et 998 μL de tampon BSA). Injectez de l’ADN lambda 4 fois lentement à intervalles de 5 minutes.
  9. Allumez le microscope et le système scientifique sCMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) pendant l’injection. Laver le tube avec 10 ml de ddH 2 O. Rincer le prisme et le raccord de tuyauterie avec de l’eau, du nettoyant pour cuvette liquide à2% et de l’éthanol à 99 %. Préparer le tampon d’imagerie en ajoutant du KCl et un colorant à ADN double brin dans le tampon BSA pour obtenir des concentrations finales de 150 mM et 0,5 nM, respectivement, et absorber au moins 20 mL du tampon d’imagerie dans une seringue de 30 mL.
  10. Installez la cellule d’écoulement sur la platine du microscope et connectez-la au système microfluidique.
  11. Utilisez un débit de 0,03 mL/min pour rincer les molécules d’ADN vers la barrière pendant 10 min, incuber pendant 30 min avec le flux arrêté, puis l’éteindre pour laisser l’ADN se diffuser latéralement.
    NOTE: Le but de cette incubation de 30 minutes est de permettre à la molécule d’ADN de se répartir plus uniformément devant la barrière par simple diffusion car les molécules d’ADN ont tendance à s’accumuler du côté de la barrière qui est fermé à l’entrée où elles sont rincées. Le temps d’incubation peut être ajusté si nécessaire.

7. Imagerie de la formation de condensation EWS-FLI1 sur des rideaux d’ADN

  1. Ouvrez le logiciel d’imagerie, recherchez et marquez les positions des motifs en zigzag 3 × 3 sous fond clair.
  2. Activer le débit à 0,2 mL/min pour colorer l’ADN avec le colorant ADN double brin pendant 10 min.
  3. Diluer mCherry-EWS-FLI1 avec le tampon d’imagerie à la concentration de 100 nM dans 100 μL dans le tube.
  4. Chargez l’échantillon de protéines à travers la valve avec une seringue en verre de 100 μL et modifiez le débit à 0,4 mL/min.
  5. Allumez le laser 488 nm et pré-scannez chaque région pour vérifier l’état de distribution de l’ADN; sélectionnez la région dans laquelle les molécules d’ADN se répartissent uniformément. Réglez la puissance laser sur 10% pour le laser 488 nm et 20% pour le laser 561 nm. Utilisez le capteur de puissance pour mesurer la puissance réelle du laser près du prisme : 4,5 mW pour le laser 488 nm et 16,0 mW pour le laser 561 nm.
  6. Acquisition d’images
    1. Commencez à acquérir des images à intervalles de 2 s avec des lasers de 488 nm et 561 nm simultanément.
    2. Changez la valve du mode manuel au mode injection pour laisser le tampon d’imagerie rincer l’échantillon de protéines dans la cellule d’écoulement après 60 s.
      REMARQUE: Ce processus prendra ~30 s et le champ de vision sera recouvert de signaux mCherry dès que les protéines EWS-FLI1 atteindront la cellule d’écoulement.
    3. Pour retirer l’EWS-FLI1 libre, continuez à laver la cellule d’écoulement avec le tampon d’imagerie pendant 5 minutes avec seulement le laser 561 nm allumé. Arrêter l’écoulement et incuber à 37 °C pendant 10 min.
    4. Activez le débit à 0,4 mL/min pour laisser l’ADN s’étendre et obtenez des images à intervalles de 2 s entre différentes images pour obtenir des données à haut débit de la formation de condensat EWS-FLI1.

8. Analyse d’intensité pour mCherry-EWS-FLI1

  1. Importez les données sous forme de séquences d’images dans le logiciel ImageJ, choisissez la poncta sur les sites GGAA 25× dans un carré de 8× 8 pixels et enregistrez l’image dans .tif format.
  2. Calculez l’intensité comme la somme de l’intensité dans le carré de 8×8 pixels, y compris l’ensemble de la puncta, et supprimez l’arrière-plan en soustrayant l’intensité de l’arrière-plan dans une zone de même taille près du carré de 8 x 8 pixels.

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Résultats

Le schéma des rideaux d’ADN est illustré à la figure 1A, à la figure 1B et à la figure 1D. La séquence cible clonée contenant 25 répétitions ininterrompues de GGAA se trouve dans le promoteur NORB1 dans le sarcome d’Ewing. Cette séquence cible est cruciale pour le recrutement EWS-FLI128. Les molécules EWS-FLI1 ont été visualisées en détectant les signaux EWS-FLI1 marqués mCherry obtenus avec un laser...

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Discussion

Comme les approches monomoléculaires sont extrêmement sensibles au contenu du système réactionnel, des efforts supplémentaires doivent être investis pour assurer la bonne qualité de tous les matériaux et solutions lors des expériences DNA Curtains, en particulier les lipides préparés dans les sections 1 et 2 et les tampons utilisés dans la section 5. Des réactifs de plus grande pureté doivent être utilisés pour préparer les tampons, et les tampons doivent être fraîchement préparés pour le dosage d’une seule molécule.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions no 31670762 (Z.Q.) de la NSFC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Laser à semi-conducteurs 488 nm diodepompéCohérentOBIS488LS
Laser à semi-conducteurs 561 nm CohérentOBIS561LS
AgarRhawnR003215-50g
biotinylé DOPEAvanti870273P
Albumine sérique bovineSigmaA7030
ChloroformeAmresco1595C027
Revêtement Electra 92Allresist GmbHAR-PC 5090.02Le revêtement protecteur conducteur
Désoxyribonucléase I bovinSigmaD5139-2MG
DOPCAvanti850375P
DTTSigmaD9779
Lamelle en verreFisher Scientific12-544-7
Hellmanex IIISigmaZ805939-1EA
KClSigma60130
Lambda DNANEBN3013S
Lambda Packing ExtractsEpicentreMP5120
MgCl2SigmaM2670
NaClSigmas3014
NanoportIdexN-333-01
NheI-HFNEBR3131S
Nikon Microscope inverséNikonEclipse Ti
NZCYM BrothSigmaN3643-250G
PEG-2000 DOPEAvanti880130P-1G
PEG-8000Amresco25322-68-3
PMMA 200K, LACTATE D’ÉTHYLE 4 %Allresist GmbHAR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOLE 2 %Allresist GmbHAR-P 672.02
Prime 95B Caméra CMOS SCIENTIFIQUEPHOTOMETRICSPrime95B
proteinase KNEBP8107S
Lame en verre de siliceG.Finkenbeiner
Vanne d’injection à six voiesIdexMXP9900-000
StreptavidineThermoS888Dilué avec ddH2O
Pompe à seringueHarvardApparatus11 Elite
T4 DNA LigaseNEBM0202S
Tris baseSigmaT6066
XhoINEBR0146V
YOYO-1 Iodure (491/509)InvitrogenY3601Dilué avec DMSO

Références

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