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Isolement et culture de cellules épithéliales gingivales humaines primaires à l’aide de Y-27632

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DOI :

10.3791/62978

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6 novembre 2021

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1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode modifiée pour l’isolement et la culture de cellules épithéliales gingivales humaines en ajoutant l’inhibiteur de Rock, Y-27632, à la méthode traditionnelle. Cette méthode est plus facile, prend moins de temps, améliore les propriétés des cellules souches et produit un plus grand nombre de cellules épithéliales à fort potentiel à la fois pour le laboratoire et pour les applications cliniques.

Résumé

Le tissu gingival est la première structure qui protège les tissus parodontaux et joue un rôle significatif dans de nombreuses fonctions buccales. L’épithélium gingival est une structure importante du tissu gingival, en particulier dans la réparation et la régénération du tissu parodontal. L’étude des fonctions des cellules épithéliales gingivales a une valeur scientifique cruciale, comme la réparation des défauts buccaux et la détection de la compatibilité des biomatériaux. Comme les cellules épithéliales gingivales humaines sont des cellules kératinisées hautement différenciées, leur durée de vie est courte et elles sont difficiles à passer. Jusqu’à présent, il n’existe que deux façons d’isoler et de mettre en culture des cellules épithéliales gingivales, une méthode d’explantation directe et une méthode enzymatique. Cependant, le temps nécessaire pour obtenir des cellules épithéliales en utilisant la méthode d’explantation directe est plus long et le taux de survie cellulaire de la méthode enzymatique est plus faible. Cliniquement, l’acquisition de tissu gingival est limitée, de sorte qu’un système d’isolement et de culture in vitro stable, efficace et simple est nécessaire. Nous avons amélioré la méthode enzymatique traditionnelle en ajoutant Y-27632, un inhibiteur de la kinase rho-associée (ROCK), qui peut favoriser sélectivement la croissance des cellules épithéliales. Notre méthode enzymatique modifiée simplifie les étapes de la méthode enzymatique traditionnelle et augmente l’efficacité de la culture des cellules épithéliales, ce qui présente des avantages significatifs par rapport à la méthode d’explantation directe et à la méthode enzymatique.

Introduction

La gencive humaine, la structure de défense de première ligne qui protège le tissu parodontal, n’est pas seulement une barrière physique et chimique1,mais sécrète également différentes classes de médiateurs inflammatoires qui participent aux réponses immunitaires et constituent une barrière immunitaire2,3. L’épithélium gingival joue un rôle important dans la réparation et la régénération du tissu parodontal. Par conséquent, l’étude de la défense et de l’immunité de l’épithélium gingival est d’une grande importance pour comprendre l’apparition, le diagnostic et le traitement de la parodontite. L’isolement et la culture de cellules épithéliales gingivales à partir de tissu gingival humain est la première étape nécessaire à l’étude de l’épithélium gingival. Une telle procédure nécessite des opérations de base telles que la production de cellules de semence pour l’ingénierie tissulaire, des modèles in vitro de maladies associées parodontales et des matériaux pour réparer les défauts parodontaux.

Les cellules épithéliales gingivales primaires sont caractérisées par un faible taux de division in vitro4,les chercheurs recherchent depuis des décennies une méthode optimale d’isolement et de culture. À ce jour, deux techniques différentes, une méthode d’explantation directe et une méthode enzymatique, sont couramment utilisées en laboratoire pour obtenir des cellules primaires de l’épithélium gingival in vitro4,5. La méthode d’explantation directe présente des avantages tels que l’exigence d’une quantité plus faible d’échantillons de tissus et d’une procédure d’isolement simple, mais elle présente les inconvénients d’un temps de culture plus long et d’une susceptibilité à la contamination5. Bien que la méthode enzymatique raccourcisse le temps de culture requis, l’efficacité est relativement faible et varie en fonction des enzymes et du milieu utilisés. Kedjarune et al.6 ont montré que la méthode de l’explantation directe, qui nécessite plus de temps avant la sous-culture (2 semaines), semblait être plus efficace pour la culture des cellules épithéliales gingivales que la méthode enzymatique. Cependant, en comparant ces deux méthodes, Klingbeil et al.7 ont constaté que la méthode enzymatique avait les meilleurs résultats pour les cultures primaires de cellules épithéliales orales, et qu’il était possible d’obtenir le rendement cellulaire optimal dans les plus brefs délais (11,9 jours contre 14,2 jours).

Par conséquent, il était important de développer une méthode plus pratique et efficace pour l’isolement et la culture des cellules épithéliales orales4. Nous avons précédemment rapporté que l’ajout de Y-27632, un inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK), simplifie la procédure d’isolement des cellules épidermiques primaires humaines et des kératinocytes des tissus cutanés adultes8,9,10. Nous avons développé le milieu G, un nouveau milieu d’inoculation conditionné qui sépare spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques et soutient la croissance et le rendement des cellules épidermiques primaires8,9,10. Dans la présente étude, nous avons développé une nouvelle technique d’isolement et de culture sans sérum pour les cellules épithéliales gingivales en combinant le milieu G avec Y-27632. En substance, notre méthode est basée sur une simplification de la méthode enzymatique traditionnelle en deux étapes, nous avons donc comparé notre nouvelle méthode avec la méthode d’explantation directe. Cette méthode enzymatique modifiée raccourcit considérablement le temps nécessaire pour séparer les cellules épithéliales gingivales du tissu gingival et augmente l’efficacité de la culture des cellules épithéliales gingivales.

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Protocole

Les tissus humains utilisés dans ce protocole sont des tissus gingivaux adultes frais jetés à partir d’extractions de dents touchées dans le département de chirurgie maxillo-faciale conformément aux lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche humaine de l’institution (Protocole No. GR201711, Date: 27-02-2017).

1. Préparatifs

  1. Prélever les tissus gingivaux adultes frais dans des tubes de 15 mL contenant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) complétée par 3 % de pénicilline/streptomycine (P/S) et maintenir les tissus à 4 °C.
    REMARQUE: Traiter les tissus comme détaillé ci-dessous dans les 24 heures suivant l’excision.

2. Préparer les réactifs et le milieu de culture

  1. Préparer la solution de lavage : 3 % P/S. Mélanger 50 mL de PBS avec 1,5 mL de pénicilline (100 U/mL) et 1,5 mL de streptomycine (100 mg/L).
  2. Préparer 500 mL de milieu contenant du facteur de croissance (appelé milieu G) : milieu DMEM/F12 (3:1) contenant 1 % de P/S, 2 % de supplément de B27, 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF), 40 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2) et 40 μg/mL de fongicide.
  3. Préparer des solutions de digestion enzymatique pour la nouvelle méthode: Dissoudre 125 mg de poudre de Dispase et 125 mg de poudre de collagénase de type I dans 50 mL de DMEM.
    REMARQUE: Filtrer toutes les solutions enzymatiques à travers une passoire de 0,22 μm et conserver à 4 ° C.
  4. Préparer 500 mL du milieu pour neutraliser la digestion enzymatique : 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de P/S dans le milieu DMEM.

3. Méthode d’explantation directe

  1. Prétraitement du tissu gingival
    1. Laver le tissu gingival avec 5 mL d’éthanol à 75 % pendant 30 s. Ensuite, rincez deux fois avec 5 mL de la solution de lavage (étape 2.1) pendant 5 min.
      REMARQUE: Effectuer tous les lavages dans des plats de culture cellulaire d’un diamètre de 50 mm.
  2. Culture de cellules épithéliales gingivales
    1. Coupez le tissu gingival en morceauxde 1 mm 3 et dispersez-les dans un plat de culture cellulaire de 100 mm. Utilisez des pinces pointues fines et des ciseaux ophtalmiques pour les opérations de coupe.
    2. Ajouter le milieu G (étape 2.2) au plat de culture. Ensuite, incubez le plat de culture dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C. Utilisez un microscope inversé (40x) pour examiner les tissus toutes les 24 heures.
    3. Retirez les morceaux de tissu gingival lorsque les cellules épithéliales se sont propagées à un diamètre de 2 à 5 mm autour des morceaux de tissu. Changez le G-medium tous les 2-4 jours.

4. La nouvelle méthode enzymatique modifiée

  1. Prétraitement du tissu gingival
    1. Pour cela, suivez les mêmes étapes que celle décrite pour la méthode d’explantation directe, étape 3.1.1.
  2. Digestion du tissu gingival
    1. Coupez le tissu gingival en petits morceaux, d’environ <1 mm, avec deux lames stérilisées. Répétez le processus de déchiquetage avec deux lames chirurgicales.
    2. Ajouter 1 mL de solution de dispase + collagénase de 2,5 mg/mL dans un tube centrifuge de 1,5 mL contenant les morceaux de tissu gingival, puis incuber le tube pendant 15 à 20 min dans un incubateur à 37 °C.
    3. Lorsque le tissu devient transparent et floculant, ajouter 1 mL de la solution de neutralisation pour mettre fin à la digestion. Bien mélanger la solution en pipetant de haut en bas 10-15 fois. Faire passer la solution à travers un filtre maillé de 100 μm.
    4. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
    5. Retirer le surnageant et ressuspend la pastille cellulaire au fond dans 10 mL de milieu contenant du facteur de croissance (étape 2.2). Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm. Ajouter 10 μM de Y-27632 à la boîte de culture cellulaire.
    6. Culturez les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Remplacez l’ancien milieu G par le milieu G frais tous les 2 jours. Observez les cellules le jour 1 et le jour 3.

5. Passage cellulaire

  1. Sortez le plat de l’incubateur, retirez le milieu usé et lavez-le deux fois avec du PBS. Ajouter 2 mL de trypsine à 0,05 % pour chaque plat de 100 mm.
    REMARQUE: Secouez le plat pour vous assurer qu’il y a suffisamment de contact entre la solution de trypsine et le fond du plat.
  2. Laisser le plat dans un incubateur environ 5 min à 37 °C pour le processus de digestion.
  3. Utilisez un microscope (40x) pour examiner les cellules et assurez-vous que la plupart des cellules se sont séparées du fond du plat.
  4. Ajouter 2 mL de la solution de neutralisation pour arrêter la digestion et transférer les cellules dans un tube de 15 mL. Pipette de haut en bas 10-15 fois. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min.
  5. Retirez le surnageant lentement. Resuspendez les cellules avec 10 mL de milieu G et comptez le nombre de cellules.
  6. Ajouter environ 1 x 106 cellules dans 10 mL de milieu G et 10 μM Y-27632 à chaque plat de 100 mm.
  7. Renouvelez le G-medium et le Y-27632 tous les 2 jours. Affichez les cellules le jour 1 et le jour 5.

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Résultats

La figure 1 montre un diagramme schématique de la méthode d’explant direct et de la méthode enzymatique modifiée. La méthode d’explantation directe ne nécessite aucune enzyme digestive pendant tout le processus. En revanche, la méthode enzymatique traditionnelle a généralement besoin de deux ensembles d’enzymes digestives, la dispase et la collagénase, pour séparer la feuille épithéliale de la couche de fibroblastes sous-jacente, puis de la trypsine pour libérer les cellules épithéliales en ...

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Discussion

Le tissu gingival est une structure clé qui maintient l’intégrité parodontale et la santé. Les cellules épithéliales gingivales ont un rôle important dans la réparation et la régénération du tissu parodontal et peuvent être utilisées dans la recherche scientifique et les applications cliniques et dans des domaines connexes, y compris la biologie buccale, la pharmacologie, la toxicologie et les déficiences buccales de la muqueuse18. Par conséquent, il est nécessaire de développer une méthode stable...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme clé de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong (ZR2019ZD36) et le programme clé de recherche et développement de la province du Shandong (2019GSF108107) à X.W.; le programme clé de recherche et développement de la province du Shandong (2018GSF118240) à J.G.; Projet de développement des sciences et technologies médicales et de la santé de la province du Shandong (2018WS163) à Z.X., et projet de développement des sciences et technologies médicales et de la santé de la province du Shandong (2019WS045) à J.S.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
NomsAbréviations & Commentaires
Comtesse compteur de cellules automatiséShanghai Ruiyu Bio-science& La technologie Co.Ltd.BBA0218ACComptage automatique de cellules
Incubateur CO2Thermo Scientific51026333Pour l’incubation cellulaire Centrifugeuse
Sorvall ST 16R CentrifugeuseThermo Scientific75004380
Boîte de culture cellulaire Eppendorf 30702115Pour la culture cellulaire
Tube à centrifuger 50 mlKIRGEN171003Pour la centrifugation cellulaire
1,5 ml Microcentrifugeuse TubesKIRGEN190691JPour la digestion cellulaire
PassoireCorning incorporée431792Filtration cellulaire
Solution tamponnéeSolarbio Life ScienceP1020-500Solution de lavage
DMEMThermo ScientificC11995500Composant du milieu de neutralisation
Défini K-SFMLife Technologies10785-012Milieu de culture de cellules épithéliales gingivales
Pénicilline StreptomycineThermo Scientific15140-122Antibiotiques
Sérum fœtal bovinBiological Industries04-001-1AC5Composant du milieu de neutralisation
0,05 % TrypsinLife Technologies25300-062Pour les HGGEPCs Dissociation
Milieu de dilutionLife Technologies50-9701Pour l’enrobage de la matrice
DispaseGibco17105-041Pour l’isolement des HGGEPCs
Collagénase Type I LifeTechnologies17100-017Pour l’isolation des HGGEPCs
F12 Nutrient Mix, HamsLife Technologies31765035Composant du G-medium
B27 Supplément Life Technologies17504044Facteur de croissance dans le G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Facteur de croissance dans le G-medium
Y-27632Fonctionnement du gèneIAD1011inhibiteur de ROCK
FungizoneGibco15290026 Préparation pour G-medium
EGF Protéine humaine recombinanteGibcoPHG0311Facteur de croissance dans le G-medium
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04Pour le test de prolifération cellulaire
Lapin Anti-humain CK18Abcamab82254Pour la coloration par immunofluorescence pour vérifier le marqueur de différenciation des HGGEPCs
Cytokératine anti-humaine du lapin10Abcamab76318Pour la coloration par immunofluorescence pour vérifier le marqueur de différenciation des HGGEPCs
de signalisation cellulaireanti-humaine Vimentine de souris3390Pour la coloration par immunofluorescence des fibroblastes gingivaux
Lapin Anti-Human pan-ckBD550951Pour la coloration par immunofluorescence pour vérifier le marqueur de différenciation des HGGEPCs
lapin anti-Ki67Abcam15580Pour la coloration par immunofluorescence pour vérifier le marqueur de différenciation des HGGEPCs
lapin anti-p63Biolegend619002Pour la coloration par immunofluorescence pour vérifier le marqueur de différenciation des HGGEPCs
lapin anti-p75NGFRAbcamab52987Pour la coloration par immunofluorescence pour vérifier le marqueur de différenciation des HGGEPCs
cellulaire phosphate Technologie

Références

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Mots-clés

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