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Article de méthode

Génération d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites dans des mini-bioréacteurs faits maison

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DOI :

10.3791/62987

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11 décembre 2021

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1Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 4Department of Pathological Anatomy, North-Western State Medical University, 5Department of Biology, Lomonosov State University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSI). Pour obtenir des organoïdes cérébraux en grande quantité et de haute qualité, nous utilisons des mini-bioréacteurs faits maison.

Résumé

L’organoïde cérébral dérivé de l’iPSC est une technologie prometteuse pour la modélisation in vitro des pathologies du système nerveux et le dépistage des médicaments. Cette technologie a émergé récemment. Il en est encore à ses balbutiements et a encore certaines limites non résolues. Les protocoles actuels ne permettent pas d’obtenir des organoïdes de manière suffisamment cohérente pour la découverte de médicaments et les études précliniques. La maturation des organoïdes peut prendre jusqu’à un an, poussant les chercheurs à lancer plusieurs processus de différenciation simultanément. Il impose des coûts supplémentaires pour le laboratoire en termes d’espace et d’équipement. En outre, les organoïdes cérébraux ont souvent une zone nécrotique au centre, qui souffre d’une carence en nutriments et en oxygène. Par conséquent, la plupart des protocoles actuels utilisent un système de circulation pour le milieu de culture afin d’améliorer la nutrition.

Pendant ce temps, il n’y a pas de systèmes dynamiques peu coûteux ou de bioréacteurs pour la culture d’organoïdes. Cet article décrit un protocole pour la production d’organoïdes cérébraux dans des mini-bioréacteurs compacts et peu coûteux fabriqués à la maison. Ce protocole permet d’obtenir des organoïdes de haute qualité en grande quantité.

Introduction

Les modèles humains dérivés de l’iPSC sont largement utilisés dans les études des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs1. Au cours de la dernière décennie, les modèles de tissus cérébraux 3D, appelés organoïdes cérébraux, ont essentiellement complété les cultures neuronales 2D traditionnelles2. Les organoïdes récapitulent dans une certaine mesure l’architecture 3D du cerveau embryonnaire et permettent une modélisation plus précise. De nombreux protocoles sont publiés pour la génération d’organoïdes représentant différentes régions du cerveau : cortex cérébral3,4,5,cervelet6,mésencéphale, cerveau antérieur, hypothalamus7,8,9et hippocampe10. Il y a eu de multiples exemples d’utilisation d’organoïdes pour étudier les maladies du système nerveux humain11. En outre, les organoïdes ont été mis en œuvre dans les découvertes de médicaments12 et utilisés dans des études sur les maladies infectieuses, y compris le SARS-Cov-213,14.

Les organoïdes cérébraux peuvent atteindre plusieurs millimètres de diamètre. Ainsi, la zone interne de l’organoïde peut souffrir d’hypoxie ou de malnutrition et éventuellement devenir nécrotique. Par conséquent, de nombreux protocoles incluent des bioréacteurs spéciaux8,des agitateurs ou des systèmes microfluidiques15. Ces dispositifs peuvent nécessiter de grands volumes de milieux de culture cellulaire coûteux. En outre, le coût d’un tel équipement est généralement élevé. Certains bioréacteurs sont constitués de nombreuses pièces mécaniques qui les rendent difficiles à stériliser pour les réutiliser.

La plupart des protocoles souffrent de « l’effet batch »16, qui génère une variabilité significative entre les organoïdes obtenus à partir des cSI identiques. Cette variabilité entrave les tests de dépistage de drogues ou les études précliniques nécessitant une uniformité. Le rendement élevé des organoïdes suffisant pour sélectionner des organoïdes de taille uniforme peut résoudre partiellement ce problème.

Le facteur temps est également un problème important. Matsui et al. (2018) ont montré que les organoïdes cérébraux ont besoin d’au moins six mois pour atteindrela maturité 17. Trujillo et al. (2019) ont également démontré que l’activité électrophysiologique ne se produisait dans les organoïdes qu’après six mois de culture18. En raison du long temps de maturation des organoïdes, les chercheurs lancent souvent une nouvelle différenciation avant de terminer la précédente. De multiples processus parallèles de différenciation nécessitent des dépenses, des équipements et des espaces de laboratoire supplémentaires.

Nous avons récemment développé un mini bioréacteur qui résout principalement les problèmes mentionnés ci-dessus19. Ce bioréacteur fait maison se compose d’une boîte de Petri à très faible adhérence ou non traitée avec un bouton en plastique au centre. Ce bouton en plastique empêche l’encombrement des organoïdes et leur conglutination au centre de la boîte de Pétri, qui est causée par la rotation du shaker. Cet article décrit comment ce mini bioréacteur maison peu coûteux et simple permet de générer des organoïdes cérébraux de haute qualité en grande quantité.

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Protocole

NOTE : Utiliser la technique stérile tout au long du protocole, à l’exception des étapes 1.2 et 1.3. Réchauffer tous les milieux de culture et les solutions à 37 °C avant de les appliquer sur les cellules ou les organoïdes. Cultivez des cellules dans un incubateur à CO2 à 37 °C dans 5 % de CO2 et 80 % d’humidité. Le schéma de protocole est illustré à la figure 1.

1. Transformer les boîtes de Petri en mini-bioréacteurs

  1. Couper des tubes centrifuges stériles de 15 mL dans des anneaux de 7 à 8 mm de hauteur; autoclavez les anneaux.
  2. Casser les boîtes de Petri à faible adhérence, non traitées ou microbiologiques en miettes. Dissoudre environ 1 g de miettes de plastique dans 10 mL de chloroforme pendant la nuit pour préparer du plastique liquide.
    ATTENTION : Travailler dans une hotte aspirante.
  3. Vérifier que le plastique liquide résultant est suffisamment visqueux pour le pipetage; sa goutte conserve une forme sphérique et ne se propage pas à la surface. S’il est très liquide, ajoutez plus de miettes de plastique. S’il est épais, ajoutez du chloroforme.
  4. Faites un bouton en plastique au centre d’une boîte de Petri stérile à ultra-faible adhérence de 6 cm. Il existe deux façons également appropriées, comme détaillé ci-dessous.
    1. Placez l’anneau en plastique autoclavé au centre et déposez le plastique liquide à l’intérieur de l’anneau.
    2. Sans anneau en plastique, déposez le plastique liquide au centre de la boîte de Pétri.
  5. Laissez la vaisselle ouverte pendant 2-3 h dans une hotte à écoulement laminaire jusqu’à ce qu’elle soit complètement séchée. Traitez les plats séchés avec un rayonnement ultraviolet pendant 15-20 min.

2. Induction de la différenciation neuronale des CS IPC

  1. Cultiver des CSPe dans le milieu des cellules souches pluripotentes jusqu’à 75-90% de confluence dans des boîtes de Petri de 35 mm pré-recouvertes d’une matrice constituée de protéines extracellulaires.
  2. Préparez un A-SR moyen. Voir le tableau 1 pour plus de détails.
  3. Aspirer le milieu de culture et ajouter 2 mL de milieu A-SR au jour 0 de la différenciation.
  4. Préparer le milieu A (voir tableau 2).
  5. Cultivez des cellules en milieu A pendant deux semaines à partir des jours 2 à 14, en les rafraîchissants dans des boîtes de Pétri tous les deux jours.

3. La formation de sphéroïdes à partir de cellules précurseurs neuroépithéliales au jour 14

  1. Au jour 14, fabriquer des sphéroïdes à partir de cellules précurseurs neuroépithéliales à l’aide d’une plaque de culture spéciale de 24 puits contenant environ 1 200 micropuits dans chaque puits(figure 2C). Suivez la procédure ci-dessous.
    REMARQUE: À ce stade de différenciation, une boîte de Petri de 35 mm contient généralement 3 à 3,5 x 106 cellules précurseurs neuroépithéliales. Ainsi, une boîte de Petri de 35 mm avec des cellules précurseurs neuroépithéliales est suffisante pour 3 à 4 puits de plaque de culture de 24 puits avec des micropuits.
  2. Préparer une plaque de culture de 24 puits avec des micropuits : À chaque puits, ajouter 1 mL de milieu A. Centrifuger brièvement à 1 300 x g pendant 5 min dans un rotor à godet oscillant équipé d’un support de plaque. Contrôlez au microscope qu’il n’y a pas de bulles dans les micropuits.
  3. Préparer le milieu B (Tableau 3).
  4. Retirer le milieu de la boîte de Pétri avec des cellules précurseurs neuroépithéliales; laver les cellules avec 2 mL de DMEM/F12. Pour le détachement cellulaire, traiter les cellules avec 1,5 mL de solution d’EDTA de 0,48 mM préparée dans du PBS. Contrôlez le détachement de la cellule au microscope.
  5. Récoltez les cellules dans un tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de DMEM/F12 dans le tube pour laver les cellules. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et ressuspender les cellules dans 2 mL de milieu B.
  6. Vérifiez la concentration cellulaire et la viabilité par coloration Trypan Blue et un hémocytomètre. Calculer le volume de suspension nécessaire pour contenir 1 x 106 cellules viables au total.
  7. Transférer la suspension cellulaire contenant 1 x 10 6 cellules danschaque puits d’une plaque de 24 puits avec des micropuits. Ajouter le milieu B jusqu’à 2 mL dans chaque puits, pipeter doucement les cellules de haut en bas plusieurs fois, et centrifuger brièvement 100 x g pendant 1 min pour capturer les cellules dans les micropuits.
    REMARQUE: Le nombre de cellules par puits ne doit pas dépasser 1 x 106. Sinon, les sphéroïdes des micropuits voisins fusionnent.
  8. Vérifiez au microscope que les cellules sont réparties uniformément dans les micropuits. Répétez le pipetage et la centrifugation si les cellules sont réparties de manière inégale.
  9. Incuber la plaque pendant la nuit pour laisser les cellules s’agréger en sphéroïdes.

4. Obtention et culture d’organoïdes

  1. Le lendemain matin (Jour 15), vérifiez la qualité des sphéroïdes au microscope. Assurez-vous qu’ils sont transparents et lisses, s’ils sont sains (Figure 2A, B). Recueillez soigneusement les sphéroïdes de chaque puits dans un tube de 15 mL, laissez les sphéroïdes précipiter par gravité pendant 2-3 minutes, puis retirez le surnageant.
  2. Ajouter aux sphéroïdes 2 mL de la matrice décongelée pendant le même temps sur la glace. Mélanger doucement par pipetage et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  3. Pour laver l’excès de matrice, ajouter au tube 8 mL de milieu B. Pipette doucement, puis centrifuger le tube pendant 1 min à 100 x g.
    REMARQUE: Ne pas dépasser le temps et la vitesse de centrifugation pour éviter l’agrégation irréversible des sphéroïdes.
  4. Retirez le surnageant. Ajouter au tube 2 mL de milieu B, pipeter doucement. Répartir la suspension sphéroïde entre deux mini-bioréacteurs, contenant chacun 4 mL de milieu B. Placer les mini-bioréacteurs dans une boîte de Petri de 15 cm pour éviter l’évaporation de l’eau et éviter la contamination.
  5. Mettez la boîte de Petri avec des mini-bioréacteurs sur un agitateur orbital. Cultivez les organoïdes à une vitesse de rotation de 70-75 tr / min.
  6. Le jour 16, préparez le milieu C (tableau 4).
  7. Transférer les organoïdes dans un tube de 15 mL. Pendant 5 min, laissez-les tomber au fond, aspirez le surnageant, ajoutez 5 mL de milieu C. Retournez les organoïdes dans les mini-bioréacteurs.
    REMARQUE: Veillez à ne pas perdre les sphéroïdes, qui sont transparents et à peine visibles.
  8. Cultivez les sphéroïdes en C moyen pendant deux semaines, en rafraîchissant le milieu tous les deux jours. À la fin de ces deux semaines, laissez environ 100 sphéroïdes par mini bioréacteur pour la culture suivante. Congeler les sphéroïdes excessifs dans un milieu de congélation dans de l’azote liquide.
  9. Le jour 30, préparez le milieu D (Tableau 5).
  10. Changez le milieu de culture en milieu D, qui est un milieu de maturation. Rafraîchir le milieu de culture tous les 2-3 jours pendant trois semaines, puis utiliser le milieu D sans BDNF et GDNF.

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Résultats

Le schéma de protocole est illustré à la figure 1. Le protocole comprenait cinq milieux dans lesquels les CSPe se différenciaient en organoïdes cérébraux pendant au moins un mois. La différenciation a commencé puis les CSPe ont atteint la confluence de 75 à 90 %(Figure 2A,B). Les premiers signes de différenciation vers les neurones ont été observés aux jours 10 à 11 de la culture de l’iPSC dans le milieu A lorsque les cellules ont commencé à se ...

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Discussion

Le protocole décrit comporte deux étapes cruciales permettant la génération d’organoïdes de haute qualité de taille uniforme. Tout d’abord, les organoïdes se développent à partir de sphéroïdes qui sont presque identiques en nombre de cellules et en maturité cellulaire. Deuxièmement, les bioréacteurs faits maison fournissent à chaque organoïde un environnement uniforme, où les organoïdes ne s’encombrent pas ou ne collent pas ensemble.

La qualité cellulaire et l’état de maturation cellulaire son...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention 075-15-2019-1669 du ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie (analyse RT-PCR) et par la subvention n ° 19-15-00425 de la Fondation russe pour la science (pour tous les autres travaux). Les auteurs remercient également Pavel Belikov pour son aide au montage vidéo. Les figures du manuscrit ont été créées avec BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc34425Plaque de culture à 24 puits avec micropuits Supplément
B-27 Supplément Gibco17504044Supplément neuronal B
Supplément GlutaMAXGibco35050061200 mM L-alanyl-L-glutamine
Humain BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Humain FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Humain GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
KnockOut Remplacement sériqueGibco10828028Remplacement sérique
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Milieu de cellules souches pliripotentes
N2 SupplémentGibco
Milieu neurobasalGibco21103049Milieu basal pour l’entretien des cellules neuronales
Pénicilline-Streptomycine SolutionGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Antimicrobiens
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen solutionGibco150400660,48 mM d’EDTA dans le
PBS&bêta ;-mercaptoéthanolGibco31350010
17502001

Références

  1. Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
  2. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
  3. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
  6. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  7. Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  10. Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896(2015).
  11. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  12. Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
  13. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  14. Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
  15. Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
  16. Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
  17. Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  18. Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
  19. Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
  20. Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
  21. Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
  22. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  23. Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820(2021).
  24. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
  25. Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790(2021).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).

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