Article de méthode

Pince à épiler magnétique au format microplaque

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DOI :

10.3791/62994

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9 février 2022

 , 
1Department of Oncology and Metabolism, University of Sheffield

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons l’utilisation d’un nouveau test sur microplaques pour permettre la manipulation mécanique de biomolécules tout en effectuant des tests biochimiques d’ensemble. Ceci est réalisé à l’aide d’un couvercle de microplaque modifié avec des aimants pour créer plusieurs pinces magnétiques statiques sur la microplaque.

Résumé

La mécanobiologie décrit comment les forces physiques et les propriétés mécaniques du matériel biologique contribuent à la physiologie et à la maladie. En règle générale, ces approches sont des méthodes à molécule unique limitées, ce qui limite leur disponibilité. Pour répondre à ce besoin, un test sur microplaque a été mis au point qui permet une manipulation mécanique tout en effectuant des tests biochimiques standard. Ceci est réalisé à l’aide d’aimants incorporés dans un couvercle de microplaque pour créer plusieurs pinces magnétiques. Dans ce format, la force est exercée sur des biomolécules reliées à des billes paramagnétiques, équivalentes à une pince à épiler magnétique typique. L’étude démontre l’application de cet outil avec des tests basés sur le FRET pour surveiller les conformations des protéines. Cependant, cette approche est largement applicable à différents systèmes biologiques, allant de la mesure de l’activité enzymatique à l’activation des voies de signalisation dans les cellules vivantes.

Introduction

La mécanobiologie se concentre sur la compréhension de la façon dont la propagation des forces physiques à l’intérieur et entre les cellules régule l’activité cellulaire 1,2 et comment cela est en corrélation avec l’organisation et la dynamique des protéines et des cellules.

Les mesures de force d’une seule molécule ont révélé comment la force est utilisée dans les systèmes biologiques, des protéines uniques aux cellules et tissus entiers 3,4,5,6,7. Ces expériences difficiles nécessitent de l’équipement spécialisé et une expertise technique. À l’inverse, les tests biochimiques standard peuvent être effectués à un débit plus élevé dans des équipements commerciaux facilement disponibles.

Ici, l’étude décrit un test mécanobiologique qui permet d’effectuer ensemble une manipulation à l’aide d’une pince magnétique et des tests biochimiques8. Les aimants sont placés sur un couvercle de microplaque imprimé en 3D (Figure 1A-D), ce qui permet d’utiliser des lecteurs de plaques commerciaux pour les tests. La force est appliquée à travers la biomolécule d’intérêt en couplant la molécule à des particules paramagnétiques. Les aimants exercent ensuite une tension sur la molécule. La modification de la distance entre les particules et les aimants permet d’ajuster la force exercée à travers la biomolécule (Figure 1E).

Nous représentons l’utilisation de ce test à l’aide du moteur moléculaire à base d’actine, Myosin VI. La myosine VI est régulée par le repliement inverse intramoléculaire9. Il a été démontré que la myosine VI existe dans un état auto-inhibé, dans lequel la liaison de protéines partenaires, telles que NDP52, déclenche le déploiement de la myosine VI10,11. Pour effectuer ces essais, nous utiliserons une construction à double marquage du domaine de queue de la myosine VI avec une GFP N-terminale et une RFP C-terminale, où le repliement de la protéine génère un transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET) entre la GFP et la RFP. L’extrémité N-terminale porte également une étiquette de biotinylation pour immobiliser la protéine à la surface. Nous utilisons ce test en combinaison avec des mesures FRET pour montrer comment la force peut avoir un impact sur le repliement arrière de la myosine VI.

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Protocole

Des échantillons de protéines nécessaires à cette expérience et une liste de réactifs se trouvent dans la table des matériaux. Des protéines équivalentes doivent être produites pour le système d’étude de l’utilisateur afin de mesurer les changements de conformation.

1. 3D couvercle magnétique imprimé

  1. Concevez un couvercle de microplaque pour loger les aimants dans une microplaque de 24 puits. Un exemple de fichier CAO peut être téléchargé à partir de GitHub12. Les mesures sont illustrées à la figure 1.
    REMARQUE : La hauteur du piédestal peut être modifiée pour modifier la distance entre les aimants et la surface afin de modifier la force appliquée. De plus, la force finale exercée sur la particule dépend de la taille de la particule et de l’écart entre la paire d’aimants. Les équations permettant de calculer la force appliquée pour les particules de 1 μm et 2,8 μm à des espaces de 0,5 mm, 1 mm et 2 mm sont données dans Dos Santos et al.8. Pour les expériences décrites ici avec des particules de 2,8 μm et un espace de 2 mm, utilisez l’équation 1.
    Équation 1 : figure-protocol-1
  2. Imprimez en 3D un couvercle de microplaque à l’aide de polyéthylène téréphtalate glycol (PETG) sur un système d’impression 3D.
    REMARQUE : Utilisez une imprimante avec une résolution de couche de 0,02 mm pour permettre la précision et la reproductibilité. L’impact de la précision de l’imprimante a été discuté dans Dos Santos et al.8.
  3. Fixez des paires d’aimants cubiques en néodyme N42 de 5 mm à l’aide d’adhésif sur les socles avec les pôles magnétiques orientés pour créer le champ dirigé vers le bas de la microplaque.
  4. Laissez au moins 1 position vide pour agir comme une commande sans aimant.
  5. Conserver dans un récipient scellé de taille suffisante pour placer et retirer facilement le couvercle.

2. Modification de la surface des microplaques

  1. Prenez une microplaque à fond de verre 24 puits propre et non traitée.
  2. Lavez les puits 3 fois avec 500 μL de tampon de lavage (50 mM de Tris-HCl (pH 7,5) et 50 mM de NaCl) à température ambiante.
  3. Ajoutez 200 μL de biotine-BSA (0,2 mg/mL) dans le tampon de lavage et laissez-le tranquille pendant 15 min à température ambiante.
    REMARQUE : La biotine-BSA est utilisée à la fois pour la passivation et la fixation. D’autres stratégies de passivation et de fixation de surface peuvent être utilisées. Pour la première utilisation et l’optimisation, la concentration de biotine-BSA peut être modifiée jusqu’à 1 mg/mL.
  4. Lavez les puits 3 fois avec 500 μL de tampon de lavage.
  5. Ajoutez 200 μL de streptavidine (20 μg/mL) dans le tampon de lavage et laissez-le tranquille pendant 15 min à température ambiante.
    REMARQUE : Pour la première utilisation, la concentration de streptavidine peut être modifiée jusqu’à 1 mg / mL.
  6. Retirez la solution puis lavez les puits 3 fois avec un tampon de lavage.
  7. Couvrez les puits avec 500 μL de tampon de lavage.
  8. Conserver à 4 °C jusqu’au moment de l’utiliser. Les assiettes doivent être utilisées le même jour.

3. Préparation de l’échantillon : Immobilisation des protéines

  1. Laissez la microplaque modifiée en surface atteindre la température ambiante.
  2. Lavez les puits avec 500 μL de tampon de lavage.
  3. Ajouter 100 nM de biotine-eGFP-Myosine VI Tail-mRFP (protéine d’échantillon de base) et incuber pendant 15 min à température ambiante dans un tampon de lavage.
    REMARQUE : Cet exemple de protéine est produit de la manière décrite par Dos Santos et al.8. Les concentrations et les temps d’incubation peuvent varier en fonction de la protéine.
  4. Lavez les puits 3 fois avec 500 μL de tampon de lavage.
  5. Configurez le lecteur de plaques pour enregistrer les spectres de fluorescence pour la GFP (excitation 490 nm et émission 510-600 nm) et RFP (excitation 560 nm et émission 580-650 nm) afin de confirmer la présence des protéines de fusion.
  6. S’il y a un manque de protéines, augmentez la concentration à l’étape 3.3.
    REMARQUE : Une mauvaise liaison pourrait être liée à une liaison inadéquate de la biotine-BSA et/ou de la streptavidine, et par conséquent, les quantités pourraient être multipliées par 10.
  7. Si possible, effectuez une mesure de balayage de puits pour déterminer si la protéine de fusion est liée à travers la microplaque (Figure 2).
    REMARQUE : Cette mesure enregistrera l’intensité de fluorescence à des points spécifiques sur le puits de la microplaque. Il révélera si la protéine est liée à travers le puits.
  8. Assurez-vous que le signal est uniforme (à 5 % près) au centre du puits où la mesure de dosage a lieu.

4. Préparation des billes magnétiques

  1. Vortex le flacon de billes paramagnétiques de 2,8 μm avec de la protéine A recombinante (table des matériaux) pendant 30 s pour remettre les billes en suspension.
  2. Transvasez le volume correspondant à 1 mg de billes paramagnétiques dans un tube de 1,5 mL.
  3. Placez le tube dans un isolateur magnétique (Table des matériaux), puis retirez le surnageant.
  4. Remettez les billes en suspension dans 200 μL de PBS en pipetant doucement la solution de haut en bas.
  5. Placez le tube dans l’isolateur magnétique, puis retirez le surnageant.
  6. Répétez l’étape de lavage 3 fois.
  7. Diluer 10 μg d’anticorps anti-RFP dans 200 μL de PBS.
  8. Isolez les billes dans l’isolateur magnétique, puis remettez-les en suspension dans la solution d’anticorps.
  9. Tournez à 20 tr/min pendant 10 min à température ambiante sur un rotateur de paillasse.
  10. Placez le tube dans l’isolateur magnétique et retirez le surnageant.
  11. Laver 3 fois en PBS.
  12. Remettre les billes en suspension dans 200 μL de tampon de lavage.
  13. Pour confirmer l’immobilisation de l’anticorps sur les billes, incubez les billes chargées d’anticorps avec une solution de protéine de fusion RFP de >1 μM.
    REMARQUE : Confirmez visuellement si la protéine est isolée par les billes.
  14. Alternativement, mesurez l’intensité de fluorescence du surnageant (excitation 560 nm et émission 580-650 nm) pour RFP dans un spectromètre de fluorescence.

5. Préparation de l’échantillon : fixation de la perle

  1. Ajouter 10 μg de la fusion bille paramagnétique-anticorps diluée dans un tampon de lavage (200 μL) dans les puits de microplaques liés aux protéines.
  2. Ne placez pas les billes dans un puits de commande pour vérifier l’effet des billes sur le signal fluorescent. Préparez un échantillon de contrôle sans anticorps pour déterminer toute interaction non spécifique avec les billes.
  3. Incuber la microplaque à température ambiante pendant 30 min.
  4. Lavez les puits 3 fois avec 500 μL de tampon de lavage.
  5. S’il est disponible localement, vérifiez que les billes sont liées à la surface sur un microscope à fond clair. S’il n’y a pas de billes, augmenter la concentration à l’étape 5.1 à 500 μg/mL.

6. Acquisition de données

  1. Placez la microplaque, sans couvercle, dans un lecteur de plaque fluorescent à 25 °C.
  2. Configurez le lecteur de plaques pour enregistrer les spectres de fluorescence pour la GFP (excitation 490 nm et émission 510-600 nm) et RFP (excitation 560 nm et émission 580-650 nm) afin de confirmer la présence des protéines de fusion.
    REMARQUE : Mesurez/enregistrez les spectres de fluorescence à travers le bas de la microplaque pour placer le couvercle sur le dessus. Par conséquent, un lecteur de microplaques approprié doit être sélectionné.
  3. Enregistrez un spectre de fluorescence FRET (excitation 490 nm et émission 510-650 nm), ou surveillez la fluorescence à 510 nm et 610 nm avec excitation à 490 nm. Celui-ci est configuré selon les directives du fabricant.
  4. Retirez la microplaque du lecteur et ajoutez le couvercle magnétique.
  5. Remettez le lecteur de plaques et laissez l’échantillon pendant 2 min.
  6. Répétez la mesure FRET, comme à l’étape 6.3.

7. Analyse des données

  1. Exportez les données à importer dans une feuille de calcul (par exemple, Excel).
  2. Extrayez manuellement les données pour la GFP du donneur à 510 nm et la RFP de l’accepteur à 610 nm.
  3. Calculez le FRET relatif à l’aide de l’équation 2 pour chaque condition.
    Équation 2 : figure-protocol-2
    A : intensité de l’accepteur (RFP 610 nm), D : intensité du donneur (GFP 510 nm).
    REMARQUE : Utilisez le RFP recombinant dans les mêmes conditions d’excitation et d’émission pour contrôler l’excitation de fond de l’accepteur.

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Résultats

La figure 2 montre un exemple de mesure à balayage de puits où l’intensité de fluorescence de la GFP a été enregistrée à des intervalles de 1 mm à travers le puits de la microplaque. Les mesures de fluorescence typiques sont effectuées en position centrale du puits de la microplaque (position 8,8 sur la figure 2) ; Il est donc important qu’il y ait des protéines liées à cet endroit. Comme le montre la figure 2, l’intensité est la pl...

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Discussion

Cette approche permet d’appliquer facilement des mesures basées sur la force dans une microplaque à l’aide de lecteurs de plaques fluorescentes. Il est important de noter que ce format de test suppose qu’il existe une protéine fonctionnelle lorsqu’elle est liée à une surface. Par conséquent, des connaissances préalables sont nécessaires avant de se lancer dans ces mesures pour s’assurer qu’il y a une activité protéique. Il est également bénéfique de s’assurer que la liaison des molécules...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions Cancer Research UK (A26206), le MRC (MR/M020606/1) et la Royal Society (RG150801) pour leur financement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microplaque à fond de verre 24 puitsCellvisP24-1.5H-NPlusieurs sources sont disponibles. À moins que cela ne soit nécessaire, il est préférable d’éviter les surfaces traitées et nous utilisons du verre de qualité Imaging N1.5.
Anticorps anti-RFPAbcamab290sources sont disponibles, mais doivent garantir une réactivité minimale avec la GFP.
Microscope optique de paillasseOptikaIM-3
Rotator de paillasseCole-Palmer-StuartSB3
Biotin-BSASigma AldrichA8549
Logiciel de CAO - Sketch Up EducatorSketch Up D’autreslogiciels de CAO peuvent être utilisés. Les utilisateurs doivent s’assurer que les formats de fichiers sont compatibles avec leur imprimante 3D.
Dynabeads Protein AFisher Scientific107467132.8 & micro ; Billes paramagnétiques m avec adhésif de contact d’impact recombinant Protéine A
EVO-STIK
MagnaRack Rack de séparation magnétiqueThermoFisher ScientificCS15000Isolateur magnétique
NaClFisher Scientific10316943
Néodyme N42 5mm Cube AimantsSupermagneteW-05-N
Lecteur de plaques - ClarioStarBMG LabtechTous les systèmes de lecture de plaques peuvent être utilisés là où des mesures sont possibles sous la microplaque. Le couvercle magnétique exclut les mesures standard ci-dessus
StreptavidinSigma Aldrich189730
Tris-HClFisher Scientific10142400
Ultimaker Filament PETGUltimaker Ultimaker
S3 - Imprimante 3DUltimaker
Plusieurs

Références

  1. Jansen, K. A., et al. A guide to mechanobiology: Where biology and physics meet. Biochimica et Biophysica Acta. 1853, 3043-3052 (2015).
  2. Dos Santos, A., Toseland, C. P. Regulation of nuclear mechanics and the impact on dna damage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3178(2021).
  3. Dos Santos, A., et al. DNA damage alters nuclear mechanics through chromatin reorganization. Nucleic Acids Research. 49 (1), 340-353 (2020).
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  5. Lherbette, M., et al. Atomic force microscopy micro-rheology reveals large structural inhomogeneities in single cell-nuclei. Scientific Reports. 7, 8116(2017).
  6. Seo, D., et al. A mechanogenetic toolkit for interrogating cell signaling in space and time. Cell. 165, 1507-1518 (2016).
  7. Yao, M., et al. The mechanical response of talin. Nature Communications. 7, 11966(2016).
  8. Dos Santos, A., Fili, N., Pearson, D. S., Hari-Gupta, Y., Toseland, C. P. High-throughput mechanobiology: Force modulation of ensemble biochemical and cell-based assays. Biophysical Journal. 120, 631-641 (2021).
  9. Fili, N., Toseland, C. P. Unconventional myosins: How regulation meets function. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 67(2019).
  10. Fili, N., et al. Competition between two high- and low-affinity protein-binding sites in myosin VI controls its cellular function. Journal of Biological Chemistry. 295, 337-347 (2020).
  11. Fili, N., et al. NDP52 activates nuclear myosin VI to enhance RNA polymerase II transcription. Nature Communications. 8, 1871(2017).
  12. MagPlate at GitHub. , Available from: https://github.com/cptoseland/MagPlate (2021).
  13. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6, 85-95 (2013).

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