Évaluation de la consommation d’acides aminés dans les cellules osseuses en culture et les arbres osseux isolés

Résumé

Ce protocole présente un test d’absorption d’acides aminés radiomarqués, utile pour évaluer la consommation d’acides aminés dans les cellules primaires ou dans les os isolés.

Résumé

Le développement osseux et l’homéostasie dépendent de la différenciation et de l’activité des ostéoblastes formant des os. La différenciation des ostéoblastes est caractérisée séquentiellement par une prolifération suivie d’une synthèse protéique et, finalement, d’une sécrétion de matrice osseuse. La prolifération et la synthèse des protéines nécessitent un apport constant en acides aminés. Malgré cela, on sait très peu de choses sur la consommation d’acides aminés dans les ostéoblastes. Nous décrivons ici un protocole très sensible conçu pour mesurer la consommation d’acides aminés à l’aide d’acides aminés radiomarqués. Cette méthode est optimisée pour quantifier les changements dans l’absorption des acides aminés qui sont associés à la prolifération ou à la différenciation des ostéoblastes, aux traitements médicamenteux ou aux facteurs de croissance, ou à diverses manipulations génétiques. Il est important de noter que cette méthode peut être utilisée de manière interchangeable pour quantifier la consommation d’acides aminés dans des lignées cellulaires cultivées ou des cellules primaires in vitro ou dans des puits osseux isolés ex vivo. Enfin, notre méthode peut être facilement adaptée pour mesurer le transport de l’un des acides aminés ainsi que du glucose et d’autres nutriments radiomarqués.

Introduction

Les acides aminés sont des composés organiques qui contiennent un groupe fonctionnel amino (-_NH2) et carboxyle (-COOH) avec une chaîne latérale variable spécifique à chaque acide aminé. En général, les acides aminés sont bien connus comme le constituant de base des protéines. Plus récemment, de nouvelles utilisations et fonctions des acides aminés ont été élucidées. Par exemple, les acides aminés individuels peuvent être métabolisés pour générer des métabolites intermédiaires qui contribuent à la bioénergétique, fonctionnent comme cofacteurs enzymatiques, régulent les espèces réactives de l’oxygène ou sont utilisés pour synthétiser d....

Protocole

Toutes les procédures de souris décrites ici ont été approuvées par les comités d’études animales du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas. Le protocole de radioprotection a été approuvé par le Comité consultatif de radioprotection du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas à Dallas.

1. Absorption d’acides aminés dans les cellules (Protocole I)

1. Plaque 5 x 10⁴ cellules ST2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Cellules en plaques dans α-MEM contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 0,1 μg/mL de streptomycine (Pen/Strep). Plaquer des ....

Résultats

Le transport des acides aminés est régulé par de nombreux transporteurs d’acides aminés liés à la membrane qui ont été classés en systèmes de transport distincts en fonction de nombreuses caractéristiques, notamment la spécificité du substrat, la cinétique, ainsi que la dépendance aux ions et au pH²⁵. Par exemple, l’absorption de glutamine peut être médiée par les systèmes de transport dépendants de Na+ A, ASC, γ+L et N ou le système L indépendant de Na⁺. Les systèmes dépenda.......

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une approche rapide et sensible pour évaluer l’absorption des acides aminés en réponse à diverses permutations expérimentales in vitro ou ex vivo. Par rapport aux kits disponibles dans le commerce (par exemple, les kits de détermination de la glutamine et du glutamate), cette méthode est beaucoup plus sensible, plus rapide et moins exigeante en main-d’œuvre^16,17,25. Dans notre pr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25 % trypsine	Gibco	25200
Plaque 12 puits	Corning	3513
Seringue 1 mL	BD précision	309628
30G Aiguille	BD précision	305106
Monochlorhydrate d’arginine L-[2,3,4-3H]-, 1mCi	PerkinElmer	NET1123001MC
Compteur à scintillation Beckman LS6500
Chlorure	de calcium Sigma	C1016
Chlorure de choline	Sigma	C7077
D-(+)-Solution de glucose	Sigma	G8769
Outil			Pinces, ciseaux, scapels
DPBS	Gibco	14190
Acide éthylènediaminetétraacétique	Sigma	E9884
HEPES(1M)	Gibco	15630
L-[3,4-3H(N)]-Glutamine	PerkinElmer	NET551250UC
Solution de chlorure de lithium, 8M	Sigma	L7026
Chlorure	de magnésium Sigma	M8266
MEM&alpha ;	Gibco	12561
Tube de microcentrifugation, 15mL	Biotix	89511-256
NP-40	Sigma	492016
Chlorure de potassium	Sigma	P3911
Bicarbonate de sodium	Sigma	S6014
Chlorure de sodium	Sigma	S9888
Désoxycholate de sodium	Sigma	D6750
Dodécylsulfate de sodium	Sigma	436143
Sonicator	Sonic& Matériaux	VCX130
Tris Base	Sigma	648311
Ultima Gold (Solution de scintillation)	PerkinElmer	6013329
&alpha ;-(Methylamino)isobutyric	acid Sigma	M2383

de dissection Flacons à scintilation liquide Sigma Z190535