L’évaluation de la phosphorylation oxydative à l’aide de respiromètres à haute résolution est devenue une partie intégrante de l’analyse fonctionnelle des mitochondries et du métabolisme énergétique cellulaire. Ici, nous présentons des protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire à l’aide de respiromètres haute résolution à chambre et à microplaques et discutons des principaux avantages de chaque appareil.
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Article de méthode
La respirométrie à haute résolution pour évaluer la bioénergétique dans les cellules et les tissus à l’aide de respiromètres à chambre et à plaques
Dans cet article
Résumé
Résumé
La respirométrie à haute résolution (HRR) permet de surveiller la phosphorylation oxydative en temps réel pour l’analyse des états énergétiques cellulaires individuels et l’évaluation des complexes respiratoires à l’aide de protocoles diversifiés de titrage substrat-découpleur-inhibiteur (SUIT). Ici, l’utilisation de deux appareils de respirométrie à haute résolution est démontrée, et une collection de base de protocoles applicables à l’analyse des cellules cultivées, des fibres musculaires squelettiques et cardiaques et des tissus mous tels que le cerveau et le foie sont présentés. Des protocoles pour les cellules et tissus cultivés sont fournis pour un respiromètre à chambre et des cellules cultivées pour un respiromètre à microplaques, tous deux englobant les protocoles de respiration standard. À des fins de comparaison, des cellules HEK293 conçues par CRISPR et déficientes en traduction mitochondriale provoquant une déficience multiple du système respiratoire sont utilisées avec les deux appareils pour démontrer des défauts cellulaires dans la respiration. Les deux respiromètres permettent une mesure complète de la respiration cellulaire avec leurs mérites techniques respectifs et leur adéquation en fonction de la question de recherche et du modèle à l’étude.
Introduction
Les mitochondries remplissent la fourniture clé d’énergie et sont un organite compartimenté contribuant aux processus bioénergétiques et métaboliques cellulaires essentiels tels que l’anabolisme des nucléotides, des lipides et des acides aminés, la biogenèse des amas fer-soufre et sont impliquées dans la signalisation telle que la mort cellulaire contrôlée 1,2,3 . La bioénergétique mitochondriale par phosphorylation oxydative contribue à presque tous les processus cellulaires au sein de la cellule et, par conséquent, les dysfonctionnements mitochondriaux d’origine primaire ou....
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Protocole
Tous les expérimentations animales sont effectués conformément au Conseil national d’examen de l’expérimentation animale et à l’Agence administrative régionale de l’État pour le sud de la Finlande. Des souris mâles C57BL/6JOlaHsd (âgées de 4 à 6 mois) ont été utilisées dans cette étude. Le consentement pour l’utilisation de lignées cellulaires humaines a été obtenu auprès du comité d’éthique institutionnelle de l’Université d’Helsinki.
1. Respirométrie à haute résolution : respiromètre à chambre (cHRR)
REMARQUE: Les expériences de cette section du protocole ont été réalisées à l’aide de l’Oroboros ....
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Résultats
Ici, nous fournissons des protocoles pour déterminer la bioénergétique mitochondriale dans les cellules eucaryotes, les tissus non fibreux (par exemple, le cervelet) et les tissus fibreux (par exemple, le muscle squelettique). Pour les cellules eucaryotes, HEK293 avec knockout conçu par CRISPR de deux protéines différentes associées à la traduction mitochondriale entraînant un déficit multiple (CRISPRKO1) et sévère/complet en OXPHOS (CRISPRKO2) a été mesuré avec cHRR (Figure 3A-.......
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Discussion
Traditionnellement, la bioénergétique mitochondriale a été étudiée avec des électrodes d’oxygène de type Clark. Un manque de résolution et de débit, cependant, justifiait le progrès technologique. À ce jour, l’O2k (appelé cHRR) et l’analyseur de flux Seahorse XF96 (appelé mHRR) ont été largement adoptés dans le domaine de la bioénergétique cellulaire. Ici, nous présentons une collection compréhensible de protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire via l’évaluation de la respiration mitochondriale à l’.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par un financement de l’Académie de Finlande (C.B.J), de la Fondation Magnus Ehrnroot (C.B.J) et d’une bourse de doctorat de l’Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2 mL Potter-Elvehjem Verre/PTFE Broyeur/Homogénéisateur de tissus | Omni International | 07-358029 | |
| 95 % O2, 5 % CO2 mélange de gaz | Potter pour le broyage des tissus | ||
| ADP | Sigma | A 4386 | |
| Antimycine A | Sigma | A 8674 | Ascorbate chimique |
| Merck | PHR1279-1G | Produit chimique, dissous dans | |
| de l’éthanol BSA (sans gras accid) | Sigma | A 6003 | Chimique |
| CaCO3 | Sigma | C 4830 | |
| Cytochrome chimique c | Sigma | C 7752 | |
| Chimique Digitonine | Sigma | D 5628 | Chimique |
| Dithiothreitol | Sigma | D 0632 | Chimique, dissoudre dans le DMSO |
| D-Sucrose | Roth | 4621.1 | Produit chimique |
| Dulbecco' Eagle modifié' s medium (glycémie élevée) | Fisher Scientific | 41965-039 | Chemical |
| Dulbecco' Eagle modifié' s medium ; (sans glucose) | Fisher Scientific | A14430-01 | |
| EGTA | Sigma | E 4378 | |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | Chemical |
| Falcon 15 ml Tubes coniques à centrifuger | Fisher Scientific | AM12500 | |
| Chemical Falcon 50 ml Tubes coniques à centrifuger | Fisher Scientific | AM12501 | |
| FCCP | Sigma | C 2920 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | Produit chimique, dissous dans de l’éthanol |
| Glutamate | Sigma | G 1626 | Produit chimique |
| GlutaMax ;( 100x) ; (200 nM ; L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Fisher Scientific | 35050061 | Chemical |
| HEK293 cellules | ATTC | CRL-1573 | |
| Hémocytomètre | Fisher Scientific | 0267151B | Instrument de comptage cellulaire |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| Imidazole | Fluka | 56750 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Produit chimique |
| L-carnitine | Sigma | C0283 | |
| Chimique Malate | Sigma | M 1000 | Chimique |
| MES hydrate | Sigma | M8250 | |
| Chimique MgCl2 | Sigma | M 9272 | Produit chimique |
| Na2ATP | Sigma | A 2383 | Chimique |
| Na2Phosphocréatine | Sigma | P 7936 | Substance chimique |
| Na-pyruvate ;( 100 mM) ; (100 fois) | Fisher Scientific | 11360070 | |
| NEAA( Acides aminés non essentiels) 100x | Fisher Scientific | 11140035 | |
| FBS normaux ;( 10x) | Fisher Scientific | 10500064 | |
| O2k-Core : Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument de respirométrie haute résolution |
| O2k-Titration Set | Oroboros Instruments | 20820-03 | Seringues Hamilton pour injections chimiques |
| Oligomycine | Sigma | O 4876 | Produit chimique, dissous dans l’éthanol |
| Palmitoylcarnitine | Sigma | P 4509 | Chimique |
| Pénicilline-Streptomycine | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce BCA Kit de dosage des protéines | Fisher Scientific | 23227 | |
| Pyruvate | Sigma | P 2256 | Tampon RIPA |
| chimique Fisher Scientific | 89900 | ||
| Roténone | Sigma | R 8875 | Produit chimique, dissous dans l’éthanol |
| Saponine | Sigma | S7900 | Chimique |
Seahorse XF DMEM essai emballage moyen, pH 7,4 | Agilent, Santa Clara, CA | 103680-100 | |
| Seahorse XFe96 Analyseur de flux extracellulaire | Agilent, Santa Clara, CA | Instrument de respirométrie à haut débit | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent, Santa Clara, CA | br/> Comprend des plaques de dosage, des cartouches, des guides de chargement pour le transfert de composés vers la cartouche de dosage et une solution de calibrant. | |
| Petits ciseaux | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Azoture de sodium | Sigma | S2002 | |
| Chimique Succinate | Sigma | S 2378 | Produit chimique |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chimique |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chimique |
| Trypan Blue solution | Merck | 72-57-1 | Chimique |
| Trypsine 0,25 % EDTA | Fisher Scientific | 25200056 | |
| Deux pinces à bords fins | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Stock d’uridine (500x) | Sigma | U3750 | Chemical |
Références
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
- Spi....
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Réimpressions et autorisations
