Article de méthode

Détection de virus et de protéines salivaires d’un vecteur cicadelle dans la plante hôte

DOI :

10.3791/63020

⸱

14 septembre 2021

 ,  ,  , 
1Vector-borne Virus Research Center, Fujian Province Key Laboratory of Plant Virology, Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole montre comment utiliser la plante hôte pour détecter les protéines salivaires de la cicadelle et les protéines virales végétales libérées par les vecteurs de cicadelle.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les insectes vecteurs transmettent horizontalement de nombreux virus végétaux d’importance agricole. Plus de la moitié des virus végétaux sont transmis par des insectes hémiptères qui ont des pièces buccales perçantes-suceuses. Au cours de la transmission virale, la salive de l’insecte relie le virus-vecteur-hôte parce que les virus vecteurs de salive et les protéines d’insectes déclenchent ou suppriment la réponse immunitaire des plantes des insectes aux plantes hôtes. L’identification et les analyses fonctionnelles des protéines salivaires deviennent un nouveau domaine d’intérêt dans le domaine de recherche des interactions arbovirus-hôte. Ce protocole fournit un système pour détecter les protéines dans la salive des cicadelles à l’aide de la plante hôte. Le vecteur cicadelle Nephotettix cincticeps infecté par le virus nain du riz (RDV) en est un exemple. La vitellogénine et la principale protéine de capside externe P8 du RDV vecteur par la salive de N. cincticeps peuvent être détectées simultanément dans la plante de riz dont se nourrit N. cincticeps. Cette méthode est applicable pour tester les protéines salivaires qui sont retenues transitoirement dans la plante hôte après l’alimentation des insectes. On pense que ce système de détection sera bénéfique pour l’étude des interactions hémiptère-virus-plante ou hémiptère-plante.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le mode de transmission vecteur-hôte des arbovirus, problème fondamental, est à la frontière de la science biologique. De nombreux virus végétaux d’importance agricole sont transmis horizontalement par des insectes vecteurs1. Plus de la moitié des virus végétaux sont vecteurs d’insectes hémiptères, y compris les pucerons, les aleurodes, les cicadelles, les cicadelles et les thrips. Ces insectes ont des caractéristiques distinctes qui leur permettent de transmettre efficacement les virus végétaux1. Ils possèdent des pièces buccales perçantes-suceuses et se nourrissent de la sève du phloème et du xylème, et sécrètent leur salive 1,2,3,4. Avec le développement et l’amélioration des techniques, l’identification et les analyses fonctionnelles des composants salivaires deviennent un nouvel axe de recherche intensive. Les protéines salivaires connues dans la salive comprennent de nombreuses enzymes, telles que la pectinestérase, la cellulase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, la polyphénol oxydase et la sucrase, entre autres 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Les protéines dans la salive comprennent également des éliciteurs qui déclenchent la réponse de défense de l’hôte, modifiant ainsi la performance des insectes, et des effecteurs qui suppriment la défense de l’hôte, ce qui améliore la condition physique des insectes et les composants qui induisent des réponses pathologiques de l’hôte14,15,16,17. Par conséquent, les protéines salivaires sont des matériaux essentiels pour la communication entre les insectes et les hôtes. Lors de la transmission des virus, la salive sécrétée par les glandes salivaires des insectes virulifères perçants-suceurs contient également des protéines virales. Les composants viraux utilisent le flux de salive pour les libérer de l’insecte à la plante hôte. Par conséquent, la salive de l’insecte relie l’interaction tritrophique virus-vecteur-hôte. L’étude de la fonction biologique des protéines salivaires sécrétées par les insectes virulifères aide à comprendre la relation virus-vecteur-hôte.

Pour les virus animaux, on signale que la salive des moustiques intervient dans la transmission et la pathogénicité du virus du Nil occidental (VNO) et du virus de la dengue (DENV). La protéine salivaire AaSG34 favorise la réplication et la transmission du virus de la dengue-2, tandis que la protéine salivaire AaVA-1 favorise la transmission du DENV et du virus Zika (ZIKV) en activant l’autophagie18,19. La protéine salivaire D7 des moustiques peut inhiber l’infection par le DENV in vitro et in vivo par interaction directe avec les virions DENV et la protéine d’enveloppe DENVrecombinante 20. Dans les virus végétaux, le virus de l’enroulement jaune des feuilles de la tomate bégomovirus (TYLCV) induit la protéine salivaire Bsp9 de l’aleurode, qui supprime l’immunité médiée par WRKY33 de la plante hôte, pour augmenter la préférence et la performance des aleurodes, augmentant éventuellement la transmission des virus21. Étant donné que les études sur le rôle que jouent les protéines salivaires des insectes dans les plantes hôtes ont pris du retard par rapport à celles des hôtes animaux, un système stable et fiable pour détecter les protéines salivaires dans les plantes hôtes est nécessaire de toute urgence.

Le virus végétal connu sous le nom de virus nain du riz (RDV) est transmis par la cicadelle Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) avec une grande efficacité et une propagation persistante22,23. Le RDV a d’abord été signalé comme étant transmis par un insecte vecteur et provoque une maladie grave du riz en Asie24,25. Le virion est icosaédrique et sphérique à double couche, et la couche externe contient la protéine de capside externeP8 22. La période de transmission circulative du RDV chez N. cincticeps est de 14 jours 26,27,28,29,30. Lorsque le RDV arrive aux glandes salivaires, les virions sont libérés dans les cavités stockées dans la salive des glandes salivaires via un mécanisme semblable à l’exocytose23. La vitellogénine (Vg) est le précurseur de la protéine vitelline essentiel au développement des ovocytes chez les insectes femelles31,32,33. La plupart des espèces d’insectes ont au moins un transcrit Vg de 6-7 kb, qui code pour une protéine précurseur d’environ 220 kDa. Les précurseurs protéiques de Vg peuvent généralement être clivés en gros (140 à 190 kDa) et petits (<50 kDa) fragments avant d’entrer dans l’ovaire18,19. Une analyse protéomique antérieure a révélé la présence de peptides dérivés de Vg dans la salive sécrétée de la cicadelle Recilia dorsalis, bien que leur fonction soit inconnue (données non publiées). Il est récemment rapporté que Vg, qui est sécrété par voie orale par les cicadelles, fonctionne comme un effecteur pour endommager les défenses des plantes34. On ne sait pas si la Vg de N. cincticeps pourrait également être libérée à la plante hôte avec un flux salivaire, puis pourrait jouer un rôle dans la plante pour interférer avec les défenses de la plante. Pour déterminer si N. cincticeps exploite les protéines salivaires, telles que Vg, pour inhiber ou activer les défenses des plantes, la première étape consiste à identifier les protéines libérées par la plante pendant l’alimentation. Comprendre la méthode d’identification des protéines salivaires présentes dans la plante est potentiellement essentiel pour expliquer la fonction des protéines salivaires et les interactions entre les hémiptères et les plantes.

Dans le protocole présenté ici, N. cincticeps est utilisé comme exemple pour fournir une méthode permettant d’examiner la présence de protéines salivaires dans la plante hôte introduites par l’alimentation des insectes. Le protocole détaille principalement la collecte et la détection des protéines salivaires et est utile pour des recherches plus approfondies sur la plupart des hémiptères.

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Protocole

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Les cicadelles adultes non virulifères ont été multipliées au Centre de recherche sur les virus à transmission vectorielle de l’Université d’agriculture et de foresterie du Fujian, en Chine.

1. Élevage d’insectes non virulifères

  1. Élever les adultes sur des plants de riz dans une cage cubique de 40 cm x 35 cm x 20 cm (longueur x largeur x hauteur). Gardez un côté de la cage recouvert d’un filet à l’épreuve des insectes pour la ventilation.
    1. Gardez les cages avec cicadelles dans un incubateur qui contient un régulateur d’humidité intégré à 26 ° C avec une humidité relative de 60-75% sous une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité.
  2. Utilisez un aspirateur pour transférer doucement tous les adultes de leur cage dans une nouvelle cage contenant des plants de riz frais chaque semaine.
    1. Laissez plus de 200 adultes s’accoupler et pondre des œufs dans le riz.
    2. Conservez les vieux plants de riz pour que les nymphes émergent. Élevez ces nouvelles nymphes non virulifères au stade 2 stades.

2. Acquisition de virus et collecte d’insectes virulifères

  1. Transférer soigneusement les nymphes non virulifères de 2 stades dans un tube de culture en verre (2,5 cm de diamètre sur 15 cm de haut) pendant 1-2 h pour mourir de faim à l’aide de l’aspirateur.
    1. Relâchez les nymphes dans une cage contenant un plant de riz infecté par le RDV cultivé dans un pot.
    2. Laissez les nymphes se nourrir du plant de riz infecté pendant 2 jours.
      NOTE: Arrosez soigneusement le plant de riz et évitez de laver les nymphes. Les nymphes à 2 stades mesurent environ 1,6 à 2 mm de long.
  2. Transférez soigneusement ces nymphes dans une nouvelle cage contenant des plants de riz frais exempts de virus avec une humidité relative de 60 à 75% sous une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité. Laissez les nymphes se nourrir du plant de riz infecté pendant 12 jours pour terminer la période de transmission circulative du RDV.

3. Collecte de protéines salivaires à l’aide d’une cage d’alimentation

  1. Préparez cinq petites cages d’alimentation en forme de tuyaux (2,5 cm de diamètre sur 4 cm de hauteur) dont une extrémité est recouverte d’un filet à l’épreuve des insectes.
  2. Confinez 15 à 20 cicadelles dans chaque cage d’alimentation, puis couvrez l’autre extrémité de la cage avec un mince tapis en mousse.
    1. Fixez un plant de riz (5-6 cm de haut) entre l’extrémité de la cage et un tapis de mousse avec des rubans. S’assurer que les cicadelles dans la cage d’alimentation peuvent se nourrir des plants de riz exposés à l’intérieur de la cage.
  3. Immergez les racines des plantules dans l’eau afin que le plant de riz reste vivant. Laissez les cicadelles s’en nourrir pendant 2 jours.
  4. Retirez les cicadelles de leurs cages d’alimentation et ramassez les plants de riz dont ils se nourrissaient. Coupez les parties des semis à l’extérieur de la cage et récupérez les régions d’alimentation des semis.
    REMARQUE: Cet échantillon peut être conservé à -80 ° C pendant 3 mois au maximum, s’il n’est pas utilisé instantanément pour la détection.

4. Préparation du réactif

  1. Dissoudre 15,1 g de Tris-base, 94 g de glycine et 5 g de SDS dans 1 L d’eau stérile pour préparer un tampon 5xTris-glycine. Diluer 200 mL de tampon 5xTris-glycine avec 800 mL d’eau stérile pour préparer le tampon 1xTris-glycine (voir le tableau 1 pour la composition du tampon).
  2. Dissoudre 80 g de NaCl, 30 g de Tris-base et 2 g de KCl dans 1 L d’eau stérile pour préparer un tampon de solution saline tamponnée 10xTris (TBS). Autoclaver la solution à 121 °C pendant 15 min.
  3. Dissoudre 8 g de SDS, 4 mL de ß-mercaptoéthanol, 0,02 g de bleu de bromophénol et 40 mL de glycérol dans 40 mL de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6,8) pour préparer 4x tampon d’échantillon de protéines.
  4. Mélanger 800 mL de tampon de tris-glycine avec 200 ml de méthanol pour préparer le tampon de transfert.
  5. Ajouter 100 mL de solution 10xTBS et 3 mL de Tween 20 à 900 mL d’eau stérile pour préparer le tampon TBS avec la solution Tween 20 (TBST).

5. Western blot pour détecter la salive et les protéines virales

  1. Broyer 0,1 g des échantillons de riz avec de l’azote liquide jusqu’à ce que le tissu devienne une poudre. Ajouter 200 μL de tampon d’échantillon de protéines 4x à l’échantillon et faire bouillir pendant 10 min. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à température ambiante.
    1. Retirez le surnageant et placez-le dans un nouveau flacon. Chargez 10 μL de l’échantillon dans un gel SDS-PAGE et faites-le passer dans un tampon de tris-glycine à 150 V pendant 45 à 60 min.
      NOTE: Le résidu après centrifugation peut être éliminé.
  2. Placez une membrane de nitrocellulose de 0,45 μm et d’autres fournitures sandwich dans le tampon de transfert pendant 30 minutes.
    REMARQUE: Cette étape peut être effectuée avant que le gel ait terminé sa course.
  3. Sandwich du gel et transfert pendant 90-120 min à 100 V dans le tampon de transfert.
  4. Prenez la membrane et placez-la dans une solution de blocage de lait en poudre écrémé à 7% dans une solution de TBST pendant 20 min. Ajouter l’anticorps spécifique contre le RDV P8 ou Vg à une solution à 7% de lait en poudre écrémé dans TBST. Incuber avec l’anticorps pour colorer la membrane pendant 2 h ou toute la nuit.
  5. Lavez la membrane avec la solution TBST trois fois, avec 5 minutes de lavage à chaque fois.
  6. Ajouter les IgG anti-lapin de chèvre comme anticorps secondaire au lait en poudre écrémé à 7 % avec TBST. Incuber avec l’anticorps pendant 60-90 min à température ambiante.
  7. Laver la membrane avec la solution TBST trois fois pendant 5 minutes à chaque fois.
  8. Utilisez le kit ECL Western pour la méthode chimioluminescente. Mélanger les réactifs de détection 1 et 2 dans le kit à un rapport de 1:1 dans un tube. Mettez le réactif mixte sur la membrane et incuber le transfert pendant 5 min.
  9. Égoutter l’excès de réactif et prendre une image colorimétrique de l’image chimioluminescente. Combinez-les pour voir l’échelle avec des bandes de protéines.

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Résultats

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La figure 1 illustre toutes les étapes de ce protocole : l’élevage des insectes, l’acquisition du virus, la collecte des protéines salivaires par l’alimentation du riz et le transfert Western. Les résultats des transferts Western ont montré que des bandes spécifiques et attendues d’environ 220 kDa ont été observées dans les échantillons de riz nourricier et de glandes salivaires d’insectes sur la membrane incubée avec des anticorps contre Vg. En revanche, aucune bande n’a été observ...

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Discussion

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La salive directement sécrétée par les glandes salivaires des insectes perçants-suceurs joue un rôle central car elle prédigère et détoxifie les tissus hôtes et les facteurs biologiques inter-règnes des vecteurs dans les hôtes 1,3,4. Les facteurs biologiques inter-règnes, y compris les éliciteurs, les effecteurs et les petits ARN, sont essentiels à la communication insecte-hôte14,15,16

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31772124 et 31972239) et de l’Université d’agriculture et de foresterie du Fujian (subvention KSYLX014).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactifs
Tris baseRocheD609K69032pour 5&fois ; Tampon de tris-glycine et 10× ; TBS préparation tampon
glycineSigma-AldrichWXBD0677Vpour 5&fois ; Préparation de tampon de tris-glycine
SDSSigma-AldrichSLCB4394pour 5&fois ; Préparation de tampon de tris-glycine
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318pour 10 fois ; Préparation tampon TBS
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016318pour 10&fois ; Préparation de tampon TBS
ß ;-mercaptoéthanolRéactif XiyaB14492Pour 4&temps ; préparation de tampon d’échantillon de protéines
bleu de bromophénolSigma-AldrichSHBL3668Pour 4&temps ; préparation de tampon d’échantillon de protéines
glycérolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618Pour 4× préparation de tampon d’échantillon de protéines
méthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118Pour la préparation du tampon de transfert
Tween 20Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGYCT30111220Pour la préparation
TBST lait écrémé en poudreBecton.Dickinso et compagnie252038Pour le blocage membranaire, dilution d’anticorps
chèvre anti-lapinIgG Sangon BiotechD110058-0001Reconnaissance du primaire et du tibody
ECL Western kitThermoFisher Scientific32209Substrat chimiluminescent
nitrocellulose membranePall Corporation25312915Pour le transfert de protéines
Tampons et solutions>
TamponCompositionCommentaires/Description
 ; 5&fois ; Tris-glycine tampon15,1 g Tris base
94 g glycine
FDS de 5 g dans 1 L d’eau		 Solution mère
1& fois ; Tampon tris-glycine200 mL de 5& fois ; Tampon tris-glycine
800 mL d’eau		Solution de travail, pour SDS-PAGE
10&fois ; Tampon salin tamponné au tris (TBS)80 g NaCl
30 g Tris base
2 g de KCl
dans 1 L d’eau		Solution mère
TBS avec Tween 20 (TBST) solution100 mL 10&fois ; TBS solution
3 mL Tween 20
900 mL d’eau stérile		Solution de travail
de protéines8 g SDS
4 mL ß ;-mercaptoéthanol
0,02 g de bleu de bromophénol
40 mL de glycérol
dans 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8)		Pour l’extraction des protéines
Tampon de transfert800 mL Tampon de tris-glycine
200 mL de méthanol		 transfert de protéines
Instruments
Bleu de bromophénolSigma-AldrichSHBL3668Pour la préparation de 4x tampons d’échantillons de protéines
Incubateur à température constanteNingbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.PRX-1200BPour l’élevage des cicadelles
ÉlectrophorèseTanon Science & Technology Co., Ltd.Tanon EP300Pour SDS-PAGE
de noyau de transfert électrophorétiqueBIO-RAD1703935Pour SDS-PAGE
glycérolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618Pour 4x préparation de tampon d’échantillon de protéine
glycineSigma-AldrichWXBD0677VPour 5x préparation de tampon de tris-glycine
chèvre anti-lapin IgGSangon BiotechD110058-0001Reconnaissance de l’instrument de meulage tissulaire passe-haut primaire et tibody
Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.JXFSIPRP-24Pour le broyage des tissus végétaux
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016318Pour 10x préparation de tampon TBS
méthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118Pour la préparation de tampon de transfert
Mini auge de transfert de chaleur humideBIO-RAD1703930Pour SDS-PAGE
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318Pour la préparation du tampon 10x TBS
Membrane nitrocellulosiquePall Corporation25312915Pour le transfert de protéines
Lait écréméen poudre Becton.Dickinso and company252038Pour le blocage membranaire, la dilution des anticorps
Pierce ECL Western kitThermoFisher Scientific32209Substrat chimiluminescent
Instrument de couleur de protéinesGE Soins de santé biosciences ABAmersham lmager 600Pour la détection
des protéines SDSSigma-AldrichSLCB4394Pour 5x Préparation de tampon Tris-glycine Base
TrisRocheD609K69032Pour 5x Tampon Tris-glycine et 10× ; Préparation du tampon TBS
Tween 20Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGYCT30111220Pour la préparation TBST
Réservoir d’électrophorèse à plaque verticaleBIO-RAD1658001Pour SDS-PAGE
Bain-marieShanghai Jinghong Équipement expérimental Co., Ltd.XMTD-8222Pour faire bouillir les échantillons de protéines
&bêta ;-mercaptoéthanolRéactif XiyaB14492Pour la préparation de tampons d’échantillons de protéines 4x
de stérile stérile stérile 4&fois tampon d’échantillon Pour Module

Références

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D tection de virus v g tauxRice Dwarf VirusWestern BlotSDS PAGEtransmission par les h mipt resd tection de la vitellog nineinteraction virus planteextraction de prot ines

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