Ce protocole montre comment utiliser la plante hôte pour détecter les protéines salivaires de la cicadelle et les protéines virales végétales libérées par les vecteurs de cicadelle.
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Article de méthode
Détection de virus et de protéines salivaires d’un vecteur cicadelle dans la plante hôte
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les insectes vecteurs transmettent horizontalement de nombreux virus végétaux d’importance agricole. Plus de la moitié des virus végétaux sont transmis par des insectes hémiptères qui ont des pièces buccales perçantes-suceuses. Au cours de la transmission virale, la salive de l’insecte relie le virus-vecteur-hôte parce que les virus vecteurs de salive et les protéines d’insectes déclenchent ou suppriment la réponse immunitaire des plantes des insectes aux plantes hôtes. L’identification et les analyses fonctionnelles des protéines salivaires deviennent un nouveau domaine d’intérêt dans le domaine de recherche des interactions arbovirus-hôte. Ce protocole fournit un système pour détecter les protéines dans la salive des cicadelles à l’aide de la plante hôte. Le vecteur cicadelle Nephotettix cincticeps infecté par le virus nain du riz (RDV) en est un exemple. La vitellogénine et la principale protéine de capside externe P8 du RDV vecteur par la salive de N. cincticeps peuvent être détectées simultanément dans la plante de riz dont se nourrit N. cincticeps. Cette méthode est applicable pour tester les protéines salivaires qui sont retenues transitoirement dans la plante hôte après l’alimentation des insectes. On pense que ce système de détection sera bénéfique pour l’étude des interactions hémiptère-virus-plante ou hémiptère-plante.
Introduction
Le mode de transmission vecteur-hôte des arbovirus, problème fondamental, est à la frontière de la science biologique. De nombreux virus végétaux d’importance agricole sont transmis horizontalement par des insectes vecteurs1. Plus de la moitié des virus végétaux sont vecteurs d’insectes hémiptères, y compris les pucerons, les aleurodes, les cicadelles, les cicadelles et les thrips. Ces insectes ont des caractéristiques distinctes qui leur permettent de transmettre efficacement les virus végétaux1. Ils possèdent des pièces buccales perçantes-suceuses et se nourrissent de la sève du phloème et du xylème,<....
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Protocole
Les cicadelles adultes non virulifères ont été multipliées au Centre de recherche sur les virus à transmission vectorielle de l’Université d’agriculture et de foresterie du Fujian, en Chine.
1. Élevage d’insectes non virulifères
- Élever les adultes sur des plants de riz dans une cage cubique de 40 cm x 35 cm x 20 cm (longueur x largeur x hauteur). Gardez un côté de la cage recouvert d’un filet à l’épreuve des insectes pour la ventilation.
- Gardez les cages avec cicadelles dans un incubateur qui contient un régulateur d’humidité intégré à 26 ° C avec une humidité relative de 60-75% sous une photopériode de 16 h de lumière et 8....
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Résultats
La figure 1 illustre toutes les étapes de ce protocole : l’élevage des insectes, l’acquisition du virus, la collecte des protéines salivaires par l’alimentation du riz et le transfert Western. Les résultats des transferts Western ont montré que des bandes spécifiques et attendues d’environ 220 kDa ont été observées dans les échantillons de riz nourricier et de glandes salivaires d’insectes sur la membrane incubée avec des anticorps contre Vg. En revanche, aucune bande n’a été observ.......
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Discussion
La salive directement sécrétée par les glandes salivaires des insectes perçants-suceurs joue un rôle central car elle prédigère et détoxifie les tissus hôtes et les facteurs biologiques inter-règnes des vecteurs dans les hôtes 1,3,4. Les facteurs biologiques inter-règnes, y compris les éliciteurs, les effecteurs et les petits ARN, sont essentiels à la communication insecte-hôte14,15,16
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31772124 et 31972239) et de l’Université d’agriculture et de foresterie du Fujian (subvention KSYLX014).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | pour 5&fois ; Tampon de tris-glycine et 10× ; TBS préparation tampon |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | pour 5&fois ; Préparation de tampon de tris-glycine |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | pour 5&fois ; Préparation de tampon de tris-glycine |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | pour 10 fois ; Préparation tampon TBS |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | pour 10&fois ; Préparation de tampon TBS |
| ß ;-mercaptoéthanol | Réactif Xiya | B14492 | Pour 4&temps ; préparation de tampon d’échantillon de protéines |
| bleu de bromophénol | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | Pour 4&temps ; préparation de tampon d’échantillon de protéines |
| glycérol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Pour 4× préparation de tampon d’échantillon de protéines |
| méthanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | Pour la préparation du tampon de transfert |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | Pour la préparation |
| TBST lait écrémé en poudre | Becton.Dickinso et compagnie | 252038 | Pour le blocage membranaire, dilution d’anticorps |
| chèvre anti-lapin | IgG Sangon Biotech | D110058-0001 | Reconnaissance du primaire et du tibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Substrat chimiluminescent |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | Pour le transfert de protéines |
| Tampons et solutions> | |||
| Tampon | Composition | Commentaires/Description | |
| ; 5&fois ; Tris-glycine tampon | 15,1 g Tris base 94 g glycine FDS de 5 g dans 1 L d’eau | Solution mère | |
| 1& fois ; Tampon tris-glycine | 200 mL de 5& fois ; Tampon tris-glycine 800 mL d’eau | Solution de travail, pour SDS-PAGE | |
| 10&fois ; Tampon salin tamponné au tris (TBS) | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g de KCl dans 1 L d’eau | Solution mère | |
| TBS avec Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10&fois ; TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL d’eau stérile | Solution de travail | |
| de protéines | 8 g SDS 4 mL ß ;-mercaptoéthanol 0,02 g de bleu de bromophénol 40 mL de glycérol dans 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) | Pour l’extraction des protéines | |
| Tampon de transfert | 800 mL Tampon de tris-glycine 200 mL de méthanol | transfert de protéines | |
| Instruments | |||
| Bleu de bromophénol | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | Pour la préparation de 4x tampons d’échantillons de protéines |
| Incubateur à température constante | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | Pour l’élevage des cicadelles |
| Électrophorèse | Tanon Science & Technology Co., Ltd. | Tanon EP300 | Pour SDS-PAGE |
| de noyau de transfert électrophorétique | BIO-RAD | 1703935 | Pour SDS-PAGE |
| glycérol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Pour 4x préparation de tampon d’échantillon de protéine |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | Pour 5x préparation de tampon de tris-glycine |
| chèvre anti-lapin IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Reconnaissance de l’instrument de meulage tissulaire passe-haut primaire et tibody |
| Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | Pour le broyage des tissus végétaux | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | Pour 10x préparation de tampon TBS |
| méthanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | Pour la préparation de tampon de transfert |
| Mini auge de transfert de chaleur humide | BIO-RAD | 1703930 | Pour SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Pour la préparation du tampon 10x TBS |
| Membrane nitrocellulosique | Pall Corporation | 25312915 | Pour le transfert de protéines |
| Lait écrémé | en poudre Becton.Dickinso and company | 252038 | Pour le blocage membranaire, la dilution des anticorps |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Substrat chimiluminescent |
| Instrument de couleur de protéines | GE Soins de santé biosciences AB | Amersham lmager 600 | Pour la détection |
| des protéines SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | Pour 5x Préparation de tampon Tris-glycine Base |
| Tris | Roche | D609K69032 | Pour 5x Tampon Tris-glycine et 10× ; Préparation du tampon TBS |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | Pour la préparation TBST |
| Réservoir d’électrophorèse à plaque verticale | BIO-RAD | 1658001 | Pour SDS-PAGE |
| Bain-marie | Shanghai Jinghong Équipement expérimental Co., Ltd. | XMTD-8222 | Pour faire bouillir les échantillons de protéines |
| &bêta ;-mercaptoéthanol | Réactif Xiya | B14492 | Pour la préparation de tampons d’échantillons de protéines 4x |
Références
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amste....
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Réimpressions et autorisations
