Reconstruction et analyse 3D de structures neuronales subcellulaires minces à l’aide de données de microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés

Summary

Un pipeline méthodologique flexible pour identifier, visualiser et quantifier les processus neuronaux subcellulaires minces dans des volumes d’images de microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés à l’aide de progiciels open source conviviaux.

Abstract

Les progrès récents des technologies de microscope électronique à balayage permettent désormais l’analyse tridimensionnelle (3D) rapide des processus subcellulaires ultraminces. Ici, un pipeline méthodologique est présenté pour identifier, visualiser et analyser les processus neuronaux minces, tels que ceux qui se projettent dans les boutons présynaptiques d’autres neurones (appelés « spinules »). À l’aide de progiciels disponibles gratuitement, ce protocole montre comment utiliser un arbre de décision pour identifier des structures subcellulaires neuronales communes à l’aide de critères morphologiques dans des volumes d’image de microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM), avec une attention particulière à l’identification d’une diversité de spinules projetés dans des boutons présynaptiques. En particulier, ce protocole décrit comment tracer les spinules dans les synapses neuronales pour produire des reconstructions 3D de ces projections subcellulaires minces, de leurs neurites parents et de leurs partenaires postsynaptiques. De plus, le protocole comprend une liste de logiciels open source disponibles gratuitement pour l’analyse des données FIB-SEM et offre des conseils (par exemple, lissage, éclairage) pour améliorer les reconstructions 3D à des fins de visualisation et de publication. Ce protocole adaptable offre un point d’entrée dans l’analyse rapide à l’échelle nanométrique des structures subcellulaires dans les volumes d’images FIB-SEM.

Introduction

Les études sur les relations structure-fonction des composants subcellulaires nanométriques bénéficient souvent de la visualisation et de l’analyse 3D¹. Cependant, les études de microscopie électronique à transmission de section en série ont été limitées dans le temps et l’espace par la nécessité d’utiliser un couteau diamanté pour couper et aligner des centaines à des milliers de sections ultraminces en série de ≥40 nm. Ces contraintes ont limité la capacité d’échantillonner et d’analyser efficacement des structures subcellulaires minces (<40 nm de diamètre), et la nécessité de maîtriser le sectionnement en sé....

Protocol

1. Données de volume d’image et taille de l’objet subcellulaire : considérations et enregistrement

1. Obtenir un volume d’image FIB-SEM de qualité de la zone d’intérêt contenant les objets subcellulaires d’intérêt.
   REMARQUE : Ce protocole utilise des segments d’un volume d’image FIB-SEM du cortex visuel primaire du furet adolescent (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, voxels isotropes de 4 nm), et un volume FIB-SEM librement accessible de l’hippocampe CA1 du rat adulte (10,2 x 7,7 x 5,3 μm ; voxels isotropes de 5 nm) mis à disposition par le laboratoire Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Il est essentiel de préparer d....

Results

Quantification du pourcentage de spinules synaptiques dans la population de boutons présynaptiques excitateurs dans le cortex visuel primaire du furet
Bien que des protubérances spinuliennes des neurites dans les boutons présynaptiques excitateurs aient été observées pendant des décennies^19,26, leur importance potentielle pour la fonction synaptique est restée obscure. Ces expériences ont été conçues pour déterminer la proportion de boutons pr.......

Discussion

Ce pipeline d’analyse du volume d’images FIB-SEM peut produire des reconstructions 3D fiables et des mesures quantitatives de structures subcellulaires minces. Alors que les techniques semi-automatisées actuelles utilisant des réseaux neuronaux profonds et des algorithmes de segmentation peuvent augmenter la vitesse et l’efficacité de la reconstruction de structures cellulaires possédant un contraste membranaire relativement élevé dans de grands volumes d’images^33,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fidji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruire			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https :/www.blender.org