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Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

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DOI :

10.3791/63049

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8 octobre 2021

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1Department of Zoology and Physiology, University of Wyoming, 2School of Electrical Engineering & Computer Science, University of North Dakota, 3Department of Mathematics and Statistics, University of Wyoming

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Résumé

L’imagerie calcique in vivo Miniscope est une technique puissante pour étudier la dynamique neuronale et les microcircuits chez des souris qui se comportent librement. Ce protocole décrit la réalisation de chirurgies cérébrales pour obtenir une bonne imagerie calcique in vivo à l’aide d’un miniscope.

Résumé

Un microscope à fluorescence miniature (miniscope) est un outil puissant pour l’imagerie calcique in vivo d’animaux se comportant librement. Il offre plusieurs avantages par rapport aux systèmes d’imagerie calcique multiphotoniques conventionnels : (1) compact ; 2° légère; 3° abordable; et (4) permet l’enregistrement d’animaux se comportant librement. Ce protocole décrit les chirurgies cérébrales pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond à l’aide d’un système d’enregistrement miniscope développé sur mesure. La procédure de préparation comprend trois étapes, y compris (1) l’injection stéréotaxique du virus dans la région cérébrale souhaitée du cerveau d’une souris pour marquer un sous-groupe spécifique de neurones avec un capteur de calcium génétiquement codé; (2) implantation d’une lentille à indice de gradient (GRIN) capable de relayer l’image calcique de la région profonde du cerveau vers le système miniscope; et (3) l’apposition du support de miniscope sur le crâne de la souris où le miniscope peut être fixé plus tard. Pour effectuer une imagerie calcique in vivo , le miniscope est fixé sur le support et des images neuronales du calcium sont collectées avec des enregistrements de comportement simultanés. Le protocole chirurgical actuel est compatible avec tous les systèmes d’imagerie à photon unique et à deux photons commerciaux ou construits sur mesure pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond.

Introduction

La signalisation intracellulaire Ca2+ est un régulateur essentiel de la croissance cellulaire, de la prolifération, de la différenciation, de la migration, de la transcription des gènes, de la sécrétion et de l’apoptose1. Dans les neurones, la signalisation Ca2+ est contrôlée avec précision puisque son schéma spatio-temporal est lié à des fonctions cruciales telles que l’excitabilité membranaire, la libération de neurotransmetteurs et la plasticité synaptique2.

L’imagerie calcique in vivo est une technique puissante qui peut être utilisée pour décoder la représentation des circuits neuronaux élémentaires aux comportements animaux normaux, identifier les activités neuronales aberrantes dans les modèles animaux de troubles cérébraux et démêler les cibles thérapeutiques potentielles qui peuvent normaliser ces circuits altérés. Les deux systèmes d’imagerie calcique in vivo courants sont la microscopie à fluorescence à balayage laser à deux photons 3,4,5,6 et la microendoscopie miniaturisée (miniscope) montée sur la tête 7,8,9,10,11,12,13 . La microscopie conventionnelle à deux photons offre des avantages importants tels qu’une meilleure résolution, un bruit réduit et un photoblanchiment plus faible; cependant, les animaux d’expérimentation doivent être fixés à la tête, ce qui limite les études de comportement pouvant être effectuéesà 3,4,5,6. En revanche, le système de miniscope monté sur la tête est petit et portable, ce qui permet d’étudier une grande variété de tests de comportement utilisant des animaux se comportant librement 7,8,9,10,11,12,13.

Il existe deux indicateurs avancés de Ca2+, les indicateurs chimiques 5,14 et les indicateurs de calcium codés génétiquement (GECI)15,16. L’imagerie Ca2+ a été facilitée par l’utilisation de GECI très sensibles délivrés avec des vecteurs viraux qui permettent un marquage spécifique des neurones dans le circuit ciblé. L’effort continu pour améliorer la sensibilité, la longévité et la capacité à marquer même les compartiments subcellulaires rend les GECI idéaux pour diverses études d’imagerie calcique in vivo 17,18,19.

La diffusion de la lumière dans les tissus cérébraux pendant l’imagerie limite la pénétration optique en profondeur, même avec la microscopie à deux photons. Cependant, la lentille GRIN (Gradient Index) surmonte ce problème car la lentille GRIN peut être directement intégrée dans les tissus biologiques et relayer des images de la région profonde du cerveau à l’objectif du microscope. Contrairement à l’objectif conventionnel fait d’un matériau optiquement homogène et nécessitant une surface de forme compliquée pour faire la mise au point et créer des images, la performance de l’objectif GRIN est basée sur un changement progressif de l’indice de réfraction dans le matériau de l’objectif qui permet d’obtenir une mise au point avec une surface plane20. L’objectif GRIN peut être fabriqué jusqu’à 0,2 mm de diamètre. Par conséquent, une lentille GRIN miniaturisée peut être implantée dans le cerveau profond sans causer trop de dommages.

Dans cet article, un protocole chirurgical complet est présenté pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond. À des fins de démonstration, nous décrivons des chirurgies cérébrales ciblant spécifiquement le cortex préfrontal médian (mPFC) du cerveau de la souris et l’enregistrement in vivo de l’imagerie calcique via un système de miniscope sur mesure développé par le groupe du Dr Lin au National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP)7,12. La procédure expérimentale implique deux chirurgies cérébrales majeures. La première chirurgie consiste à injecter stéréotaxiquement un vecteur viral exprimant GCaMP6f (un GECI) dans le mPFC. La deuxième chirurgie consiste à implanter la lentille GRIN dans la même région du cerveau. Après la récupération de ces chirurgies cérébrales, la procédure suivante consiste à apposer le support de miniscope (base) sur le crâne de la souris à l’aide de ciment dentaire. In vivo L’imagerie Ca2+ peut être effectuée à tout moment après le montage du miniscope sur sa base. Le protocole chirurgical pour l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN est compatible avec tous les systèmes d’imagerie commerciale ou sur mesure à photon unique et à deux photons pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond.

Protocole

Le protocole expérimental suit les directives de soins aux animaux de l’Université du Wyoming. La souris utilisée dans cette étude est un mâle C57BL/6J âgé de 6 mois. La procédure peut être utilisée pour cibler toutes les régions profondes du cerveau pour l’imagerie calcique in vivo . Ici, pour démonstration, la zone cérébrale ciblée est la souris mPFC (antérieure et postérieure (A/P) : 1,94 mm, médiale et latérale (M/L) : 0,5 mm, dorsale et ventrale (D/V) : 1,8 mm). Ce protocole est modifié sur la base du protocole21 publié précédemment.

1. Injection stéréotaxique du virus dans le mPFC (Figure 1)

  1. Préparation à la chirurgie
    1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux à l’aide d’un autoclave et placez-les sur une surface stérile.
    2. Préparez une seringue de 10 μL en l’amorçant avec une solution saline et en la préremplissant avec 5 μL de solution saline. Fixez la seringue à une micropompe (voir tableau des matériaux).
    3. Allumez le coussin chauffant et maintenez la température à 35 °C.
  2. Placez la souris dans la chambre à induction (5 » x 10 » x 4 », longueur x largeur x hauteur) avec 5% d’isoflurane et 1 L/min de débit d’oxygène. Surveillez attentivement et comptez la fréquence respiratoire de la souris. Retirez la souris une fois que sa fréquence respiratoire diminue à 1 respiration / s.
    REMARQUE: La fréquence respiratoire de la souris peut être facilement surveillée en observant le mouvement musculaire vers le bas et vers le haut du dos lors de chaque inhalation.
  3. Laissez la souris s’installer sur une paillasse séparée de la zone chirurgicale. Avec une tondeuse à raser, rasez les poils de la tête de la souris jusqu’aux premières vertèbres cervicales.
  4. Installez la souris sur la scène stéréotaxique (voir Tableau des matériaux) et fixez sa position avec des barres d’oreille et un pince-nez. Maintenir le débit d’isoflurane au stade stéréotaxique à 1,5 % d’isoflurane et à 0,5 L/min de débit d’oxygène.
  5. Appliquez la pommade ophtalmique lubrifiante pour les yeux sur les deux yeux avec un coton-tige propre pour prévenir la sécheresse des yeux pendant la chirurgie. Évaluez les réflexes de pédale sur la souris pour confirmer que la souris est complètement anesthésiée avant de commencer la chirurgie.
  6. Désinfectez la zone sans poils avec une solution de povidone-iode à 7,5% (voir tableau des matériaux) et 70% d’éthanol trois fois chacun à l’aide de cotons-tiges stériles.
  7. Injecter un petit volume (50 μL) de lidocaïne à 2% sous la peau de la zone sans poils.
  8. Faites une incision de 2 cm à travers la peau le long de la ligne médiane à l’aide d’un scalpel pour exposer le lambda et le bregma du crâne.
  9. Retirez le fascia du crâne à l’aide de cotons-tiges secs et de pinces pointues.
  10. Une fois que le bregma et le lambda sont visibles, utilisez la pointe d’une bavure de forage dentaire (0,5 mm de diamètre) pour mesurer les coordonnées Z de bregma et lambda (voir Tableau des matériaux). Ajustez la hauteur du support de nez jusqu’à ce que le bregma et le lambda se trouvent à la même position Z.
  11. Placez la bavure de la perceuse dentaire de 0,5 mm dans une position de A/P : 1,94 mm, M/L : 0,5 mm du bregma. Percer le crâne.
    REMARQUE: Ici, pour démonstration, la région cérébrale ciblée est la souris mPFC. Ce protocole peut être utilisé pour cibler toute autre région profonde du cerveau. Par exemple, si la zone cérébrale ciblée est le Noyau Accumbens (NAc), la position correspondante doit être A/P : 0,9 mm, M/L : 1,2 mm.
  12. Retirez la dure-mère à l’aide d’une pointe d’aiguille de 30 G et nettoyez tous les débris osseux à l’aide d’une pince pointue inclinée à 45 °.
    REMARQUE: Les saignements sont fréquents car les petits vaisseaux sanguins peuvent se rompre pendant l’étape de nettoyage. Utilisez des cotons-tiges stériles pour arrêter le saignement et appliquez une solution saline pour laver la zone. Appliquez une solution saline sur la zone du crâne exposée pour la garder humide.
  13. Chargez le virus dans la seringue à microlitre à l’aide du panneau de commande de la micropompe. Retirer 500 nL de bulle d’air suivie de 800 nL du virus à un débit de 50 nL/s.
    REMARQUE: Aux fins de la démonstration, ici, un virus adéno-associé de sérotype 1 (AAV1) exprimant GCaMP6f (un GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, est injecté dans le mPFC (voir tableau des matériaux). Le titre du virus est de 2,8 x 1013 GC/mL. Il est dilué au 1:2 dans une solution saline avant l’injection.
  14. Placez la pointe de l’aiguille sur le dessus de la bregma pour toucher simplement la bregma et notez la coordonnée Z de bregma. Déplacez l’aiguille au-dessus du trou percé et injectez 100 nL du virus pour vous assurer que l’aiguille n’est pas bouchée.
  15. Descendez lentement l’aiguille dans le tissu cérébral jusqu’à la coordonnée Z ciblée de D/V: 1,75 mm, puis déplacez-la légèrement jusqu’à la coordonnée Z de D/V: 1,65 mm.
    REMARQUE: Il s’agit de créer une petite poche pour la solution virale à infuser. Si la région cérébrale ciblée est le NAc, la coordonnée Z ciblée correspondante de D/V doit être de 4,2 mm, puis légèrement monter jusqu’à 4,1 mm.
  16. Utilisez le panneau de commande pour régler la micropompe pour injecter 500 nL du virus au débit de 50 nL/min. Appuyez sur le bouton EXÉCUTER du panneau de configuration pour injecter le virus.
    REMARQUE: L’injection prendra environ 10 min. Une fois l’injection terminée, attendez 5 à 10 minutes supplémentaires avant de retirer l’aiguille du cerveau. Appliquez fréquemment une solution saline pour garder la zone du crâne exposée humide pendant la période d’injection.
  17. Déplacez l’aiguille vers le haut et hors du cerveau. Injecter deux fois un volume de 500 nL au débit de 50 nL/s.
    REMARQUE: Cette étape confirme qu’un volume approprié du virus a été administré dans le cerveau. Au cours des premières injections de 500 nL, le virus est libéré, suivi de bulles d’air. Lors de la deuxième injection de 500 nL, des bulles d’air apparaissent d’abord, suivies d’une solution saline. La seringue est maintenant prête à charger le virus pour la prochaine souris. Une fois la chirurgie terminée, la seringue et l’aiguille en microlitre sont soigneusement nettoyées avec de l’acétone suivie d’une solution saline.
  18. Alignez les bords de la peau et fermez soigneusement l’incision avec une suture (taille 4.0). Appliquez une pommade antibiotique sur la zone cousue pour prévenir l’infection.
  19. Retirez la souris de la scène stéréotaxique et retournez-la dans sa cage d’origine. Placez la cage de la maison dans un incubateur à 33 °C jusqu’à ce que la souris soit ambulatoire.
    REMARQUE: Il faut généralement 10-15 minutes pour qu’une souris se réveille de l’anesthésie à l’isoflurane avant de commencer à se déplacer.
  20. Une fois que la souris a commencé à se déplacer, administrer des anti-inflammatoires non stéroïdiens pendant 3 jours postopératoires (voir tableau des matériaux). Laissez la souris récupérer de la chirurgie pendant 14 jours avant de poursuivre l’implantation de la lentille GRIN.

2. Implantation de lentilles GRIN dans le mPFC (Figure 1)

  1. Préparation à la chirurgie
    1. Préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant 124 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 1,2 mM de MgCl2, 25 mM de glucose, 26 mM de NaHCO3 et 2,4 mM de CaCl2.
    2. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux à l’aide d’un autoclave et placez-les sur une surface stérile.
    3. Allumez le coussin chauffant et maintenez la température à 35 °C.
    4. Faire fondre 1% d’agarose et le conserver au bain-marie à 42 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: L’agarose fondue peut être conservée au bain-marie pendant quelques heures.
    5. Désinfecter une lentille GRIN (1 mm de diamètre, 4,38 mm de longueur, Figure 2A) dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 min, la transférer dans un tube rempli de solution saline pour la rincer correctement avant l’implantation.
      REMARQUE: Les lentilles GRIN (voir Tableau des matériaux) sont produites par échange d’argent et de lithium-ion dans des lunettes spéciales, ce qui les rend non toxiques et respectueuses des neurones 6,7. Cependant, de nombreuses lentilles GRIN disponibles dans le commerce peuvent lessiver des résidus toxiques, provoquant une neurodégénérescence, ce qui les rend impropres à l’implantation dans le cerveau vivant pour des études d’imagerie in vivo à long terme. Ces lentilles GRIN peuvent nécessiter un revêtement avec des agents biocompatibles comme le parylène-C pour prévenir les effets secondaires toxiques sur les neurones voisins22.
  2. Peser la souris et l’anesthésier par injection intrapéritonéale de mélange kétamine/xylazine (voir tableau des matières) (kétamine:100 mg/kg; Xylazine : 15 mg/kg).
    REMARQUE: Une souris pesant 30 g nécessite 300 μL de mélange kétamine/xylazine (kétamine 100 mg/mL et xylazine 1,5 mg/mL) pour la dose initiale et 150 μL de kétamine (10 mg/mL) pour des doses supplémentaires pendant la chirurgie. Pour que la souris reste anesthésiée pendant tout le processus chirurgical, des doses supplémentaires de kétamine (50 mg / kg) doivent être administrées au moins une fois par heure. Le stade d’anesthésie de la souris doit être surveillé fréquemment en évaluant les réflexes de pédale.
  3. Rasez les cheveux de la zone chirurgicale avec un rasoir et nettoyez les cheveux à l’aide d’une serviette en papier humide.
  4. Placez la souris dans la scène stéréotaxique et sécurisez sa position en resserrant le pince-nez et les barres d’oreille. Appliquez une pommade ophtalmique lubrifiante pour les yeux sur les deux yeux avec un coton-tige stérile. Confirmez que la souris est entièrement anesthésiée en évaluant les réflexes de pédale.
  5. Désinfectez la zone sans poils avec une solution de povidone-iode à 7,5% et éthanol à 70% trois fois chacun à l’aide de cotons-tiges stériles. Administrer 2 mg /kg de dexaméthasone par voie intramusculaire dans la cuisse pour réduire le risque d’enflure et d’inflammation liées à la chirurgie.
  6. Injecter 50 μL de lidocaïne à 2 % sous la peau de la zone chirurgicale.
  7. Utilisez un ciseau fin pour exciser une zone de peau triangulaire de 1,5 cm (hauteur) x 1,0 cm (base), de la face antérieure entre les yeux jusqu’à la face postérieure derrière le lambda.
  8. Retirez le tissu du périoste du crâne à l’aide de pinces fines, de micro-lames et de cotons-tiges.
    REMARQUE: Le crâne doit être soigneusement nettoyé et séché avant de poursuivre l’étape suivante.
  9. Appliquer le cyanoacrylate (voir tableau des matériaux) sur les bords de la peau et attacher la peau au crâne. Attendez 5 min jusqu’à ce que le cyanoacrylate sèche.
  10. À l’aide d’une pointe de bavure de forage de 0,5 mm, alignez le bregma et le lambda dans le même plan horizontal en ajustant la hauteur du clip de nez.
  11. Placez une bavure de perceuse dentaire (1,2 mm de diamètre) à une position de A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm de la bregma. Percer le crâne. Retirez la dure-mère à l’aide d’une pointe d’aiguille de 30 G et nettoyez tous les débris osseux à l’aide d’une pince pointue inclinée à 45 °.
    REMARQUE: Ces débris osseux peuvent bloquer l’étape d’aspiration suivante s’ils ne sont pas complètement enlevés.
  12. Fixez une aiguille à extrémité émoussée polie manuellement de 27 G (Figure 2B) au porte-aiguille couplé à un bras robotique incliné avec un angle de 10° (Figure 2C). Connectez l’autre extrémité du porte-aiguille au système d’aspiration de la maison.
    REMARQUE: Le bras robotique (voir table des matériaux) est développé par le groupe du Dr Lin au NIDA / IRP et est contrôlé par un logiciel développé sur mesure, actuellement en libre accès, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23
  13. Localisez le bout de l’aiguille pour simplement toucher le bregma. Définissez la coordonnée Z de bregma sur 0 en cliquant sur le bouton Bregma sur AutoStereota.
  14. Définissez la valeur d’entrée X sur 0,8, la valeur d’entrée Y sur 1,94, la valeur d’entrée Z sur 1,0, puis cliquez sur le bouton Rechercher pour déplacer l’aiguille sur le dessus du trou percé sur le crâne.
  15. Ajustez la position de l’aiguille au centre de la zone du tissu cérébral exposée via AutoStereota.
    REMARQUE: Pour déplacer l’aiguille dans des directions latérales ou médiales, entrez la valeur Étape et cliquez sur les boutons Latéral ou Médial sur AutoStereota. De même, pour déplacer l’aiguille dans les directions antérieure ou postérieure et dorsale ou ventrale, cliquez sur les boutons rostral ou caudal et dorsal ou ventral , respectivement.
  16. Allumez le vide et commencez à rincer la zone cérébrale exposée avec ACSF à l’aide d’un système de tuyauterie à gravité contrôlée (voir Tableau des matériaux) relié à une aiguille de 30 G avec une pointe pliée. L’ACSF est continuellement bouillonné avec un mélange de gaz de 95% O2 et 5% de CO2 et filtré à travers un filtre de 0,2 μm.
    REMARQUE: Le débit ACSF est d’environ 1,5 mL / min. La pression de sortie du mélange de gaz est maintenue à ~3 psi.
  17. Aspirer le tissu cérébral couche par couche à l’aide du logiciel AutoStereota (Graphique 3).
    REMARQUE: L’aspiration du tissu cérébral est complétée en 4 tours afin qu’une poche de colonne (1,8 mm de profondeur et 1 mm de diamètre) soit générée.
    1. Dans la session « zStep », cliquez et vérifiez les première et deuxième lignes. Définissez les valeurs de la première ligne sur 0,2 et 1. Définissez les valeurs de la deuxième ligne sur 0,15 et 4 (Figure 3A).
    2. Dans la session « Mode », réglez la taille de l’aiguille 27 Gauge et 1.2, réglez Dims 0.9. Toutes les autres valeurs utilisent des valeurs par défaut (Figure 3A).
    3. Cliquez séquentiellement sur les boutons Définir, Conserver zéro et Démarrer pour lancer l’aspiration.
      REMARQUE: C’est le1er tour d’aspiration. Les valeurs d’entrée indiquent que la profondeur d’aspiration est de 0,2 mm (à partir de la coordonnée Z de 0) au cours de la première étape avec 1 couche; lors de la deuxième étape, la profondeur d’aspiration est de 0,15 mm, répétée en continu pendant 4 couches. La résolution d’aspiration est de 1,2 et le diamètre est de 0,9 mm. Pendant l’aspiration, l’emplacement instantané de la pointe de l’aiguille peut être surveillé via le panneau graphique de piste. Après avoir terminé ce tour d’aspiration, une poche de colonne de 0,8 mm de profondeur et de 1 mm de diamètre est générée. La pointe de l’aiguille sera de retour au centre avec la coordonnée Z de 0.
    4. Dans la session « zStep », cliquez et vérifiez les première et deuxième lignes. Définissez les valeurs de la première ligne sur 1 et 1. Définissez les valeurs de la deuxième ligne sur 0,15 et 4 (Figure 3B).
    5. Dans la session « Mode », conservez toutes les valeurs identiques à celles du tour précédent (Figure 3B).
    6. Cliquez séquentiellement sur les boutons Définir, Conserver zéro et Démarrer pour lancer l’aspiration.
      NOTE: Il s’agit du 2ème tour d’aspiration. Les valeurs d’entrée indiquent que la profondeur d’aspiration est de 1 mm (à partir de la coordonnée Z de 0) au cours de la première étape avec 1 couche; lors de la deuxième étape, la profondeur d’aspiration est de 0,15 mm, répétée en continu pendant 4 couches. Après avoir terminé ce tour d’aspiration, la poche de colonne de 1,6 mm de profondeur et de 1 mm de diamètre est générée.
    7. Dans la session « zStep », cliquez et vérifiez uniquement la première ligne. Définissez les valeurs de la première ligne sur 1,8 et 1 (Figure 3C).
    8. Dans la session « Mode », réglez la taille de l’aiguille 27 Gauge et 2.2. Toutes les autres valeurs restent les mêmes que celles du tour précédent (Figure 3C).
    9. Cliquez séquentiellement sur les boutons Définir, Conserver zéro et Démarrer pour lancer l’aspiration.
      REMARQUE: Il s’agit du3ème cycle d’aspiration. Les valeurs d’entrée indiquent que la profondeur d’aspiration est de 1,8 mm (à partir de la coordonnée Z de 0) avec 1 couche. La résolution d’aspiration est de 2,2. Après avoir terminé ce tour d’aspiration, la poche de colonne de 1,8 mm de profondeur et de 1 mm de diamètre est générée.
    10. Dans la session « zStep », cliquez et vérifiez uniquement la première ligne. Définissez les valeurs de la première ligne sur 1,6 et 1 (Figure 3D).
    11. Dans la session « Mode », réglez taille de l’aiguille 27 Jauge et 2.2, réglez Dims 0.6 (Figure 3D).
    12. Cliquez séquentiellement sur les boutons Définir, Conserver zéro et Démarrer pour lancer l’aspiration.
      NOTE: Il s’agit du 4ème cycle d’aspiration. Le but de cette étape est de nettoyer le sang accumulé dans la poche. Les saignements sont fréquents car les petits vaisseaux sanguins se rompent pendant le processus d’aspiration. Pour bien nettoyer le sang, arrêtez l’irrigation de l’ACSF pendant 5 minutes, puis remettez l’irrigation en marche. Répétez le 4ème cycle d’aspiration plusieurs fois jusqu’à ce que la poche soit sans sang. Ce protocole peut être utilisé pour cibler toute autre région profonde du cerveau. Par exemple, si la zone cérébrale ciblée est le NAc, la coordonnée Z finale correspondante de D/V doit être de 4,4 mm.
  18. Arrêtez le vide et l’irrigation de l’ACSF. Amenez l’aiguille à +2 mm de coordonnée Z et 0,5 mm avant au centre. Placez l’objectif GRIN stérile de 1 mm dans la poche.
  19. Gardez l’extrémité de l’aiguille en contact avec la lentille GRIN exposée pour vous assurer que la lentille GRIN est fixée à un angle de 10 °. Appuyez doucement sur la surface supérieure de la lentille GRIN avec du papier de soie souple stérile pour vous assurer que la surface inférieure de la lentille GRIN est en contact avec le tissu cérébral.
  20. Appliquez l’agarose fondue dans l’espace entre la lentille GRIN et le tissu cérébral à l’aide d’une spatule. Après que l’agarose a formé un gel, éliminer l’excès d’agarose à l’aide d’une micro-lame.
  21. Nettoyez soigneusement le crâne avec une solution saline et des cotons-tiges. Laissez sécher le crâne avant l’application ultérieure de ciment dentaire (voir tableau des matériaux).
  22. Sortez bien le mélange du congélateur à -20 °C. Mélanger la poudre de ciment dentaire et le liquide catalyseur et appliquer une couche de ciment de résine adhésive auto-durcissante sur le crâne; Tout d’abord, entourez la lentille GRIN, puis couvrez tout le crâne exposé.
  23. Attendez 5 min et laissez-le durcir complètement. Retirez soigneusement l’aiguille d’aspiration.
  24. Dans un puits en plastique propre, mélangez de la poudre de ciment dentaire, du charbon noir avec du liquide et appliquez une fine couche du mélange sur la 1ère couche de ciment dentaire. Attendez 5 min pour le laisser durcir.
  25. Protégez la lentille GRIN exposée en la recouvrant d’un capuchon personnalisé fabriqué à partir d’un tube PCR (Figure 2D). Appliquez du cyanoacrylate pour fixer le bouchon au ciment dentaire.
  26. Injecter 1 mL de solution saline préaverdie par voie sous-cutanée chez la souris, suivi de 0,1 mg/kg de buprénorphine. Replacez la souris dans sa cage d’accueil. Placez la cage de la maison dans un incubateur à 33 °C et surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire. Il faut généralement 20 à 40 minutes pour qu’une souris se réveille de l’anesthésie avant de commencer à se déplacer.
  27. Administrer des anti-inflammatoires non stéroïdiens et surveiller la souris pendant au moins 3 jours postopératoires. Laissez la souris récupérer de la chirurgie pendant 30 jours.

3. Fixation du support de miniscope (base) sur le crâne de la souris (Figure 1)

  1. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction avec 5% d’isoflurane et un débit d’oxygène de 1 L/min jusqu’à ce que sa fréquence respiratoire diminue à 1 respiration/s.
  2. Placez la souris dans la scène stéréotaxique et sécurisez sa position avec des barres d’oreille et des pinces nasales. Maintenir un flux continu d’isoflurane (1,5 %) et d’oxygène (0,5 L/min).
  3. Appliquez une pommade ophtalmique sur ses yeux pour les garder humides. Allumez le coussin chauffant et maintenez la température à 35 °C. Confirmez que la souris est entièrement anesthésiée en évaluant les réflexes de pédale.
  4. Retirez doucement le capuchon qui recouvre la lentille GRIN à l’aide d’une pince pointue. Percer complètement les résidus de cyanoacrylate séchés du ciment dentaire à l’aide d’une microperceuse (voir tableau des matériaux).
  5. Coupez les cheveux autour de la zone de ciment dentaire avec de petits ciseaux. Nettoyez les débris à l’aide d’un dépoussiéreur à air comprimé. Utilisez un coton-tige trempé à l’acétone pour nettoyer la surface supérieure de la lentille GRIN.
  6. Préparez le miniscope avec son support (base).
    1. Placez un écrou hexagonal #00-90 (voir Tableau des matériaux) dans la fente présente dans la base et appliquez du cyanoacrylate pour y fixer (Figure 2E).
    2. Appliquez un ruban de polytétrafluoroéthylène (PTFE) hermétiquement autour du filetage du miniscope et coupez le ruban supplémentaire (Figure 2F).
    3. Fixez le miniscope à la base et utilisez la vis de verrouillage pour fixer le miniscope à la base (Figure 2G).
    4. Connectez le miniscope à son câble et allumez le logiciel développé sur mesure, actuellement en libre accès, NeuView (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE: Le logiciel NeuView est développé sur mesure pour l’imagerie calcique in vivo miniscope du groupe du Dr Lin au NIDA / IRP 7,12. Il est en libre accès (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
    5. Dans NeuView, cliquez sur Matériel, cochez LED1, puis cliquez sur le bouton Flux pour afficher les images en direct (Figure 4A). Pour arrêter la diffusion en direct, cliquez sur le bouton Arrêter .
    6. Installez le miniscope dans un bras de maintien de miniscope personnalisé (Figure 2H) dont la position XYZ peut être manipulée à l’aide de contrôleurs motorisés (Figure 2I).
  7. Localisez le miniscope juste au-dessus de l’objectif GRIN exposé et rendez-le parallèle à la surface de l’objectif. Abaissez lentement le miniscope vers l’objectif GRIN et ajustez sa position Z jusqu’à ce que le meilleur plan de mise au point soit trouvé.
    REMARQUE: Le meilleur plan focal est déterminé en comparant plusieurs positions Z possibles et en sélectionnant le plan focal avec une visualisation claire de la plupart des corps cellulaires.
  8. Appliquez soigneusement la première couche de ciment dentaire autour de la base du miniscope sans modifier la position du miniscope. Une fois le ciment durci, retirez doucement le bras de maintien de sorte que le miniscope puisse se tenir seul sur la tête de la souris.
    REMARQUE: Le ciment dentaire a tendance à rétrécir après durcissement, et il fera glisser le miniscope loin du plan de mise au point d’origine. En règle générale, la position Z du miniscope est légèrement soulevée au-dessus du plan focal d’origine avant d’appliquer du ciment dentaire pour compenser le changement potentiel.
  9. Appliquez une deuxième couche de ciment dentaire autour de la base pour combler tous les espaces et vous assurer qu’il n’y a pas de fuite de lumière LED des espaces. Laissez le ciment dentaire durcir.
  10. Retirez la souris de l’étage stéréotaxique. Desserrez la vis de verrouillage et détachez le miniscope de la base. Placez un capuchon de protection imprimé en 3D dans la base pour protéger la lentille GRIN exposée et serrez la vis de verrouillage dans la base (Figure 2J).
  11. Replacez la souris dans sa cage d’accueil.
    REMARQUE: Il faut généralement 10-15 minutes pour qu’une souris se réveille de l’anesthésie à l’isoflurane avant de commencer à se déplacer.

4. Montage du miniscope et imagerie in vivo Ca2+ (Figure 1)

  1. Montez le miniscope à sa base
    1. Anesthésier brièvement la souris dans la chambre d’induction (5% d’isoflurane et 1 L/min de débit d’oxygène). Placez la souris sur une surface de banc propre.
    2. Desserrez la vis de verrouillage avec un petit tournevis, retirez le capuchon de protection et nettoyez la surface de la lentille GRIN avec un coton-tige imbibé d’acétone.
    3. Enroulez fermement un ruban en PTFE autour du filetage du miniscope et fixez le miniscope à sa base sur la tête de la souris.
    4. Connectez le miniscope au câble (Figure 2K), allumez le logiciel NeuView.
    5. Dans NeuView, cliquez sur Matériel, cochez LED1, puis cliquez sur le bouton Flux pour afficher les images en direct (Figure 4A).
    6. Identifiez le meilleur plan focal en ajustant la position du miniscope par rapport à la base, en resserrant légèrement ou en desserrant légèrement à l’aide de pinces contondantes.
      REMARQUE: Le meilleur plan focal est déterminé en comparant plusieurs emplacements possibles et en sélectionnant celui avec une visualisation claire de la plupart des corps cellulaires.
    7. Serrez la vis de verrouillage et replacez la souris dans sa cage d’accueil.
    8. Dans NeuView, réglez la puissance lumineuse led au niveau optimal. Cliquez sur Capturer , puis sur les boutons Déclencher pour démarrer l’enregistrement et appuyez sur Arrêter après 150 images.
      REMARQUE: La puissance la plus faible possible détermine le niveau optimal de la puissance de la LED pour obtenir une image suffisamment lumineuse. Le but de l’enregistrement d’une courte vidéo est de faciliter l’identification du même plan focal à l’avenir pour l’imagerie répétitive.
    9. Déconnectez le câble du miniscope. Laissez la souris récupérer pendant au moins 30 minutes avant de commencer l’expérience.
      REMARQUE: Pour protéger le miniscope, généralement, la bouteille d’eau et le chargeur alimentaire en fil sont retirés pendant cette courte période de temps. Si la souris doit rester plus longtemps dans sa cage d’origine, il est recommandé de fournir du gel diététique disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux) dans la cage de la maison.
  2. Acquisition de données pour l’imagerie calcique in vivo
    REMARQUE: L’imagerie calcique in vivo peut être effectuée simultanément avec tous les tests de comportement souhaités par le chercheur. À des fins de démonstration, l’exemple ici est l’imagerie in vivo Ca2+ lors d’un test en champ ouvert. Pour atteindre cet objectif, deux ordinateurs sont nécessaires. Un ordinateur est équipé d’un logiciel commercial (voir Tableau des matériaux) pour contrôler une caméra afin d’enregistrer automatiquement le comportement de la souris. L’autre ordinateur est équipé de NeuView pour contrôler le miniscope et enregistrer les images Ca2 +.
    1. Activez le logiciel de la caméra de comportement (voir Tableau des matériaux) pour afficher l’arène de comportement de la souris via une fonction Livestream. Réglez manuellement la mise au point de l’appareil photo supérieur (Figure 2L).
    2. Sélectionnez Trigger/Strobe et cochez « Activer/désactiver le déclencheur » (Figure 4B). Cliquez sur le bouton Enregistrer , utilisez Parcourir pour sélectionner l’emplacement où les enregistrements de comportement seront enregistrés, sélectionnez le format d’image souhaité.
      REMARQUE: La fonction « Trigger Control » est activée pour permettre à l’enregistrement du comportement d’être déclenché par le logiciel NeuView afin que les trames de comportement et les images d’imagerie calcique correspondantes soient couplées temporellement ensemble. L’enregistrement du comportement peut être enregistré dans n’importe quel format souhaité. L’enregistrement de comportement est généralement enregistré au format JPEG dans le dossier désigné.
    3. Rapprochez la souris de l’arène et connectez le miniscope au câble relié au système d’acquisition de données (Figure 2L) (voir tableau des matériaux). La souris est ensuite placée au centre de l’arène.
    4. Avec la fonction Livestream du logiciel NeuView, réglez la puissance des LED pour optimiser la luminosité de l’image calcique.
      REMARQUE: Pour l’imagerie calcique, la fréquence d’images d’enregistrement est de 10 images / s par défaut.
    5. Dans NeuView, décochez LED1, cliquez sur Capturer , puis sur Les boutons Déclencheur pour démarrer l’enregistrement, puis appuyez sur Arrêter après 100 images.
      REMARQUE: Il s’agit d’enregistrer des images d’arrière-plan pour environ 100 images avec la lumière LED éteinte.
    6. Dans le logiciel de la caméra de comportement, cliquez sur Démarrer l’enregistrement (Figure 4C). Dans NeuView, cochez LED1, cliquez sur Capturer, puis sur les boutons De déclenchement pour démarrer l’enregistrement. Appuyez sur Arrêter après 3000 images.
      REMARQUE: Il s’agit d’enregistrer simultanément l’imagerie et le comportement du calcium. Le test en champ ouvert dure 15 minutes, généralement décomposé en trois sessions d’enregistrement de 5 minutes chacune. Il s’agit d’éviter que le miniscope ne surchauffe en raison d’une utilisation continue.
    7. Enregistrez à la fois l’imagerie calcique et les enregistrements de comportement dans les dossiers désignés. Répétez l’enregistrement pendant deux sessions supplémentaires tout en enregistrant l’arrière-plan avant chaque session et enregistrez tous les enregistrements dans le dossier désigné.
  3. Détachez le miniscope de sa base.
    1. Une fois l’enregistrement terminé, déconnectez le câble du miniscope.
    2. Anesthésier brièvement la souris dans la chambre d’induction (5% d’isoflurane et 1L/min de débit d’oxygène). Placez la souris sur une surface propre et chaude.
  4. Dévissez la vis de verrouillage dans la base et détachez le miniscope de la base. Remettez le capuchon de protection sur la base et serrez la vis de verrouillage. Remettez la souris dans sa cage d’origine.

Résultats

La figure 1 montre la procédure expérimentale schématique, y compris l’injection virale, l’implantation de lentilles GRIN, l’apposition de la base du miniscope sur le crâne de la souris et l’imagerie calcique in vivo via un miniscope. L’ensemble de la procédure prend environ 2 mois. La figure 2 montre les principaux composants décrits dans le protocole d’imagerie calcique in vivo miniscope. La figure 3 montre les interfaces du logiciel AutoStereota lors de l’implantation de la lentille GRIN. La figure 4 montre les interfaces de NeuView et du logiciel d’enregistrement du comportement lors de l’imagerie calcique in vivo.

Le résultat de l’imagerie calcique in vivo dépend du succès des chirurgies d’injection virale et d’implantation de lentilles GRIN. La figure 5 montre une gamme de résultats (c.-à-d. infructueux, sous-optimaux et bons) provenant d’enregistrements d’imagerie calcique in vivo . En cas d’échec, l’image du calcium peut apparaître sombre ou brillante, mais ne révèle généralement pas ou très peu de neurones actifs. Nous ne poursuivons généralement pas d’expériences d’enregistrement in vivo du calcium s’il y a moins de cinq neurones actifs. Une bonne imagerie calcique in vivo révèle généralement plusieurs centaines de neurones actifs. Si un enregistrement contient moins d’une centaine de neurones actifs, nous le considérons comme un enregistrement sous-optimal.

Dans des enregistrements sous-optimaux et bons, des expériences d’imagerie calcique in vivo ont été poursuivies et l’analyse ultérieure des données a été effectuée. Le film 1 montre un enregistrement représentatif de l’imagerie calcique in vivo de la souris mPFC. Les vidéos comportementales et les données d’imagerie calcique sont généralement traitées séparément. Les vidéos sur le comportement de la souris peuvent être notées manuellement. Les fichiers d’imagerie calcique sont traités à l’aide de la boîte à outils de traitement d’image calcium CaImAn24. La figure 6 montre une carte cellulaire représentative et plusieurs traces de calcium provenant d’un bon enregistrement in vivo par imagerie calcique.

Après avoir terminé l’imagerie calcique in vivo , la dernière étape consiste à confirmer si l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN ont eu lieu dans la région cérébrale souhaitée. À cette fin, la souris a été perfusée avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de 4% de paraformaldéhyde (PFA). Le cerveau de la souris a été récolté, postfixé dans 4% de PFA pendant 12 h et stocké dans du PBS à 4 °C. Le cerveau de la souris a ensuite été sectionné en tranches de 50 μm d’épaisseur avec un vibratome. Les tranches de cerveau ont été colorées avec du DAPI et observées au microscope (non décrites dans le protocole)12. La figure 7 est une tranche de cerveau de souris d’environ 1,94 mm antérieure à bregma d’une souris expérimentale, montrant la piste où la lentille GRIN a été implantée. La région de fluorescence verte sous et autour de la piste de lentille GRIN indique l’expression de GCaMP6f dans la région mPFC.

figure-results-1
Figure 1: Aperçu schématique de la procédure expérimentale. (A) Injection stéréotaxique de virus dans le mPFC. (B) Implantation de lentilles GRIN dans le mPFC. (C) Fixation de la base du miniscope sur le crâne de la souris. (D) Montage du miniscope et imagerie calcique in vivo . Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Principaux composants nécessaires à l’imagerie calcique in vivo. (A) Un objectif GRIN de 1 mm de diamètre et 4,38 mm de longueur. (B) Aiguille à extrémité émoussée polie manuellement de 27 G utilisée pour l’aspiration du tissu cérébral. (C) Le bras robotique couplé au porte-aiguille. (D) Un capuchon sur mesure à partir d’un tube PCR pour protéger la lentille GRIN exposée jusqu’à l’apposition de la base du miniscope sur le crâne de la souris. (E) Le support de miniscope (base) avec un écrou hexagonal. (F) Un miniscope dont la partie filetée est enveloppée avec le ruban PTFE. (G) Un miniscope fixé à sa base avec une vis de verrouillage. (H) Le bras de maintien du miniscope. (I) Un contrôleur motorisé 3D sur mesure utilisé pour faciliter le mouvement du miniscope dans les positions XYZ. (J) Un capuchon de protection fixé à la base pour protéger la lentille GRIN exposée pendant que la souris n’effectue pas d’imagerie calcique in vivo. (K) Le miniscope connecté au câble. (L) Le système d’acquisition de données pour l’imagerie in vivo Ca2+. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Interfaces du logiciel AutoStereota lors de l’aspiration du tissu cérébral couche par couche. (A) Interface correspondant aux étapes 2.17.1 à 2.17.3. B) L’interface correspondant aux étapes 2.17.4 à 2.17.6. (C) L’interface correspondant aux étapes 2.17.7 à 2.17.9. D) L’interface correspondant aux étapes 2.17.10 à 2.17.12. Les zones rouges mettent en surbrillance les valeurs d’entrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Interfaces du logiciel NeuView et du logiciel d’enregistrement du comportement lors de l’imagerie calcique in vivo. (A) L’interface de NeuView. (B,C) Les interfaces du logiciel d’enregistrement de comportement. Les cases rouges mettent en surbrillance les boutons sur lesquels il faut cliquer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Cartes des cellules de fluorescence de projection maximale pour montrer l’éventail des résultats possibles. (A,B) Imagerie calcique in vivo infructueuse qui n’est pas acceptable pour l’analyse ultérieure des données. (A) est sombre et contient moins de 5 neurones actifs. (B) est brillant mais n’a pas de neurones actifs. (C) La carte cellulaire d’une imagerie calcique in vivo sous-optimale qui contient des neurones actifs. (D) La carte cellulaire d’une bonne imagerie calcique in vivo qui comprend plusieurs centaines de neurones actifs. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 6 : Carte cellulaire représentative et transitoires calciques provenant d’une imagerie calcique in vivo réussie. Le panneau de gauche est la carte de la cellule de fluorescence de projection maximale d’un enregistrement in vivo d’imagerie calcique dans le mPFC lors d’un test en champ ouvert. L’enregistrement dure 5 min. Le panneau de droite montre les transitoires de calcium de 15 régions d’intérêt (couleur assortie). Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-7
Figure 7 : Évaluation post-mortem d’une souris expérimentale. L’évaluation post-mortem de l’expression de GCaMP6f et de l’implantation de lentilles GRIN dans le mPFC d’une souris expérimentale. La zone rectangulaire indique le chemin d’implantation de la lentille GRIN. La zone verte sous la région implantée de la lentille GRIN confirme que GCaMP6f a été exprimé et que la lentille GRIN a été implantée avec précision dans la région cérébrale souhaitée. Cg, cortex cingulaire; PrL, cortex prélimbique; IL, cortex infralimbique. Barre d’échelle: 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Comparaisons du système de miniscope sur mesure du NIDA avec d’autres systèmes de miniscope 7,8,9,10,11,13,25,26. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Film 1 : Un enregistrement in vivo d’imagerie calcique de la souris mPFC lors d’un test en champ ouvert. À des fins de démonstration, cette vidéo ne montre que 1 min d’enregistrement. La fréquence d’images d’enregistrement d’origine est de 10 images/s. La vidéo est 6 fois plus rapide que l’enregistrement original. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Discussion

Une question centrale en neurosciences est de comprendre comment la dynamique et les circuits neuronaux codent et stockent l’information, et comment ils sont modifiés dans les maladies du cerveau. À l’aide d’un miniscope in vivo Ca2+ système d’imagerie, l’activité neuronale individuelle de plusieurs centaines de neurones dans un microcircuit local peut être surveillée simultanément à partir d’un animal se comportant librement. Ici, un protocole chirurgical détaillé pour l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN est décrit pour préparer les rongeurs à une imagerie cérébrale profonde in vivo Ca2+ via un système d’enregistrement miniscope développé sur mesure. Le tableau 1 montre les comparaisons de notre système de miniscope avec d’autres systèmes de miniscope disponibles dans le commerce et construits sur mesure 7,8,9,10,11,13,25,26. Il convient de noter que l’implantation de lentilles GRIN à l’aide du protocole chirurgical actuel est compatible avec tous les systèmes d’imagerie commerciaux ou sur mesure à photon unique et à deux photons pour une imagerie calcique in vivo du cerveau profond.

De l’injection virale à l’acquisition de données de l’imagerie calcique in vivo miniscope , l’ensemble de la procédure expérimentale prend au moins 2 mois. C’est un processus compliqué et laborieux. Le succès final de l’expérience dépend de multiples facteurs, y compris le choix approprié des GECI, l’injection de virus avec précision dans la zone cérébrale ciblée, une expression virale suffisante dans la population neuronale souhaitée, l’implantation de lentille GRIN précisément à l’endroit souhaité, une récupération adéquate des chirurgies, ainsi que, si une inflammation grave se produit après la chirurgie, et si le comportement de l’animal est gravement affecté par les chirurgies, et ainsi de suite.

Deux étapes critiques comprennent l’injection stéréotaxique du virus et l’implantation de lentilles GRIN. À des fins de démonstration, la microinjection stéréotaxique a été réalisée dans le mPFC de souris, avec le virus adéno-associé (AAV1) codant GCaMP6f sous le contrôle du promoteur CaMKII qui marque sélectivement les neurones pyramidaux dans le mPFC. GCaMP6f a été choisi car c’est l’un des indicateurs de calcium les plus rapides et les plus sensibles avec un temps de demi-désintégration de 71 ms15. De plus, l’expression virale AAV de GCaMP6f est durable (c.-à-d. plusieurs mois), ce qui la rend idéale pour effectuer une imagerie répétitive in vivo Ca2+ sur une longue période pour des études longitudinales sur des modèles murins de maladies neurodégénératives27. Le protocole chirurgical actuel peut être adapté pour cibler différentes populations cellulaires dans toute autre région du cerveau. Divers outils viraux disponibles permettent le marquage sélectif de populations neuronales spécifiques dans la région cérébrale souhaitée à l’âge souhaité. En outre, les chercheurs peuvent tirer parti du système de recombinaison Cre-LoxP et de divers modèles murins transgéniques disponibles pour effectuer des modifications génétiques et étudier le résultat des circuits comportementaux et neuronaux28,29.

Une caractéristique unique du protocole présenté est que l’aspiration automatisée du tissu cérébral couche par couche a été réalisée avant l’implantation de la lentille GRIN (1 mm de diamètre). Ceci est réalisé grâce à une aiguille de 27 G connectée à un système de vide, contrôlé par un bras robotique sur mesure et un logiciel23. Sur la base de notre expérience, cette méthode génère une surface uniforme pour le contact de la lentille GRIN et cause moins de dommages au tissu voisin que l’aspiration manuelledu tissu 23. Pour cette raison, cette procédure apporte un avantage évident pour les lentilles GRIN avec un diamètre relativement plus large (par exemple, 1 mm). Cependant, l’aspiration tissulaire peut ne pas être nécessaire pour implanter une lentille GRIN de plus petit diamètre (0,5 mm ou 0,25 mm). Au lieu de cela, il peut être directement planté le long de la piste de tête faite avec une aiguille de 30 G21.

Outre les deux étapes critiques discutées ci-dessus, de nombreux autres facteurs doivent être soigneusement pris en compte pour une opération réussie. (1) Tous les instruments qui entrent en contact avec le cerveau doivent être stérilisés pour prévenir l’infection. (2) Toutes les étapes de la chirurgie doivent être effectuées pour minimiser les dommages au cerveau afin de prévenir une inflammation supplémentaire et la formation excessive de tissu cicatriciel. (3) Les doses d’anesthésie administrées initialement et maintenues pendant la chirurgie, en particulier celles administrées par voie intrapéritonéale, doivent être soigneusement examinées. Les doses d’anesthésie peuvent être modifiées en fonction de différentes souches de souris, car certaines peuvent être plus sensibles. (4) L’état de la souris doit être surveillé en permanence pendant la chirurgie. Enfin, (5) les souris doivent être surveillées régulièrement après la chirurgie, car de nombreuses complications peuvent survenir après la chirurgie.

Bien qu’un morceau de tissu cérébral soit prélevé unilatéralement lors de l’étape d’implantation de la lentille GRIN, nous n’avons observé aucun déficit comportemental évident 7,12. Le poids du miniscope est d’environ 2 grammes et le câble est conçu sur mesure pour le rendre léger et pour s’assurer que la souris peut facilement le transporter. Le miniscope et le câble ne sont fixés à l’animal qu’avant l’imagerie in vivo et détachés après l’imagerie. L’ensemble du processus d’imagerie ne prend généralement pas plus de 30 minutes. Par conséquent, ces instruments n’empêchent pas la souris de se comporter librement. Les étapes d’installation et de désinstallation du miniscope nécessitent une brève anesthésie (moins de 2 minutes) avec de l’isoflurane à des fins de contention animale. Nous laissons généralement la souris récupérer de la brève exposition à l’isoflurane pendant 30 minutes avant d’effectuer une imagerie in vivo. Nous avons effectué une imagerie calcique in vivo miniscope une fois par semaine pendant quelques semaines sans remarquer d’impact sur la santé et le comportement social de la souris12.

L’une des principales limites du système d’enregistrement miniscope actuel est la nécessité de connecter le microscope à un câble pour l’acquisition de données. La présence du câble limite parfois les performances de la tâche de la souris et limite l’enregistrement d’un animal à la fois. Récemment, un miniscope sans fil a été développé25,26. Cela élargira la performance des tâches et permettra l’imagerie in vivo simultanée de plusieurs animaux d’un groupe. De plus, le développement d’IESC plus sensibles avec des longueurs d’onde séparables spectralement combinées à un miniscope bicolore offrira des possibilités plus intéressantes pour la recherche en neurosciences.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne font état d’aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail est soutenu par des subventions du National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 et UG3NS115608.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fraises de foret de 0,6 mm et 1,2 mmTechnologie KF8000037800Pour craniotomie
Aiguille BD 27-G et 30-GAiguille BD PrecisionGlide REF305109 et REF305106Pour les deux chirurgies
45 pinces coudéesOutils de sciences fines11251-35Pour les chirurgies
povidone iodée à 7,5 % (bétadine)Purdue Products L.P.NDC 67618-151-17Désinfectant de surface
AcétoneSigma-Aldrich179124-1LNettoyant pour lentilles GRIN
AgaroseSigma-AldrichA9539-25GPour l’implantation de lentilles GRIN
Pommade antibiotiqueTechnologie HeliDerm81073087Pour l’injection
de virus Médicament anti-inflammatoire (ibuprofène)Johnson & Johnson Consumer Inc30043308Agit comme analgésique après des interventions chirurgicales
AutoStereotaNIDA/IRPgithub.com/liang-bo/autostereotaPour l’implantation de lentilles GRIN
Logiciel de recodage de comportement (Point Grey FlyCap2)Point GreyPoint Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2CPour l’enregistrement du comportement
Écrou hexagonal en laitonMcMASTER-CARR92736A112Pour l’implantation de lentilles GRIN
BuprénorphinePar PharmaceuticalsNDC 4202317905Pour l’implantation de la lentille GRIN
Chlorure de calciumSigma10043-52-4Pour la préparation d’un collecteur ACVR
NIDA/IRPConçu sur mesureComposant du système d’acquisition d’images
Réservoir d’oxygène comprimé et de dioxyde de carboneRocky Mountain Air SolutionsBI-OX-CD5C-KPour lentille GRIN implantation
Réservoir d’oxygène compriméRocky Mountain Air SolutionsOX-M-KPour l’injection de virus
Microdrill sans filTechnologie KF8000037800Pour craniotomie
CyanoacrylateHenkel Coorporation# 1811182Pour l’implantation de lentille GRIN
Contrôleur d’acquisition de donnéesNIDA/IRPConçu sur mesureComposant d’acquisition d’images système
Câble de transmission de donnéesNIDA/IRPConçu sur mesureComposant du système d’acquisition d’images
Set de ciment dentaireC& B Metabond et catalyseurA00253revA306 et A00168revB306Pour l’implantation de lentilles GRIN
Set de ciment dentaireDuralay2249DPour l’implantation de lentilles GRIN
DexaméthasoneVEToneNDC 1398503702Pour l’implantation de lentilles GRIN
DextroseSigma50-99-7Pour la préparation d’un
gel diététiqueClear H2072-06-5022Complément alimentaire pour souris
lentille GRINGRINTECHNEM-100-25-10-860-SPour implantation de lentille GRIN
Coussin chauffantPhysitemp Instruments LLC.#10023Pour garder le corps de la souris au chaud pendant les chirurgies
IsofluraneVEToneV1 502017Anesthésie
KétamineVEToneV1 501072Pour l’implantation de lentille GRIN
LidocaïneWEST-WARDNDC 0143-9575-01Anesthésie locale
Chlorure de magnésium hexahydratéSigma7791-18-6Pour préparer un
microlitre de LCR seringue (Hamilton)Hamilton7653-01Pour l’injection de virus
MicroSeringue PumpController World Precision Instrument#178647Pour l’injection de virus
MiniscopeNIDA/IRPConçu sur mesurePour l’imagerie
Base du miniscopeProtolabsConçu sur mesurePour le montage de la base
Bras de maintien du miniscopeNIDA/IRPConçu sur mesurePour le montage de la base
Capuchon de protection du miniscopeProtolabsConçu sur mesurePour la protection du miniscope
Contrôleur motoriséThorlabsKMTS50EPour le montage de la base
NeuViewNIDA/IRPhttps://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0Pour l’imagerie in vivo
Pommade ophtalmiquePuralube Vet PommadeNDC 17033-211-38Tube PCR ophtalmique
Thermo ScientificAB-0622Pour l’implantation de la lentille GRIN
PinchClamp World Precision Instrument14040Pour le serrage du tube
Ruban en polytétrafluoroéthylène (PTFE)TegaSeal Ruban PTFEA-A-58092Pour la fixation du miniScope à la base
Chlorure de potassiumSigma7447-40-7Pour la préparation d’un CSF
BRAS ROBOTIQUENIDA/IRPConçu sur mesurePour l’implantation de lentille GRIN
SalineHospiraRL 7302Pour les deux chirurgies Vis de
réglageDECORAH LLC.3BT-P9005-00-0025Pour visser l’écrou hexagonal en laiton dans la base du miniscope
  ; Tube en caoutchouc de silicone, 0,062 « ID, 1/8 » ODMcMaster2124T3Pour l’irrigation du
bicarbonate de sodiumaCSF Sigma144-55-8Pour la préparation
chlorure de sodiumaCSF Sigma7647-14-5Pour la préparation
phosphate de sodium monobasiqueSigma7558-80-7Pour la préparation de l’aCSF
Stade stéréotaxiqueKOPFModèle 962 Dual Ultra Precise Small Animal StereotaxicPour les deux chirurgies
Coton-tige stérilePuritanREF 806-WCPour les deux chirurgies
Outils chirurgicauxOutils de science fine11251-35Pour les chirurgies
SutureSofsilkREF SS683Pour injection de virus
  ; Filtre à seringue (0,22 & micro ; m)MillexSLGVR33RSPour filtrer l’aCSF lors de l’implantation du cristallin GRIN
Suspension virale (AAV1-CamKII-GCamp6f)Addgene100834-AAV1Pour l’injection
Titre : 2.8 X 10^13 GC/ml
XylazineVEToneV1 510650Pour l’implantation du cristallin GRIN
Solution de aCSF du du virale

Références

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  2. Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
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Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 5/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.

The following paragraph was added to the end of the Discussion:

Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

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