Algorithme d’analyse d’image basé sur la zone pour la quantification des cocultures macrophages-fibroblastes

Summary

Nous présentons une méthode qui utilise une approche d’analyse d’image généraliste basée sur des zones pour identifier le nombre de cellules. L’analyse de différentes populations cellulaires a exploité les différences significatives de hauteur et de structure cellulaires entre les différents types de cellules au sein d’un algorithme adaptatif.

Abstract

La quantification des cellules est nécessaire pour un large éventail d’études biologiques et biochimiques. L’analyse d’image conventionnelle des cellules utilise généralement des approches de détection par fluorescence, telles que la coloration immunofluorescente ou la transfection avec des protéines fluorescentes ou des techniques de détection des bords, qui sont souvent sujettes aux erreurs en raison du bruit et d’autres non-idéalités dans l’arrière-plan de l’image.

Nous avons conçu un nouvel algorithme capable de compter et de distinguer avec précision les macrophages et les fibroblastes, des cellules de différents phénotypes qui colocalisent souvent lors de la régénération tissulaire. MATLAB a été utilisé pour implémenter l’algorithme, qui différenciait des types de cellules distincts en fonction des différences de hauteur par rapport à l’arrière-plan. Un algorithme primaire a été développé à l’aide d’une méthode basée sur la zone pour tenir compte des variations de la taille / structure des cellules et des conditions d’ensemencement à haute densité.

Les non-idéalités dans les structures cellulaires ont été prises en compte à l’aide d’un algorithme itératif secondaire utilisant des paramètres internes tels que la couverture cellulaire calculée à l’aide de données expérimentales pour un type de cellule donné. Enfin, une analyse des environnements de coculture a été réalisée à l’aide d’un algorithme d’isolement dans lequel différents types de cellules ont été exclus de manière sélective en fonction de l’évaluation des différences de hauteur relative au sein de l’image. Cette approche s’est avérée compter avec précision les cellules dans une marge d’erreur de 5% pour les cellules monocultrices et dans une marge d’erreur de 10% pour les cellules en coculture.

Introduction

Un logiciel est régulièrement mis en œuvre pendant les techniques d’analyse d’images pour s’assurer que les résultats sont précis, efficaces et impartiaux. Pour les tests cellulaires, un problème courant est l’identification erronée des cellules. Les images avec des paramètres de focale et de contraste incorrects peuvent entraîner un flou cellulaire, dans lequel la limite des cellules individuelles devient difficile à identifier¹. La présence de caractéristiques d’image étrangères telles que des pores, des bulles ou d’autres objets indésirables peut entraver les procédures de comptage en ralentissant le processus de comptage et en conduisant à ....

Protocol

1. Culture cellulaire et acquisition d’images

1. Culture de macrophages RAW264.7 à 37 °C et 5 % de CO₂ dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine, 1,5 g/L de bicarbonate de sodium et 5 μM de β-mercaptoéthanol.
   1. Pour l’imagerie en monoculture, cultiver des cellules RAW264.7 à une densité de 25 000 cellules/^cm2 dans une fiole de culture cellulaire de 5 mL avec 1 mL de milieu.
2. Culture de cellules NIH/3T3 à 37 °C et 5 % de CO₂ dans du DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-stre....

Results

L’analyse des macrophages RAW264.7 non bulbeux a été réalisée en monoculture à 25 000 cellules/cm². Des images représentatives de la culture cellulaire ont été prises et traitées dans MATLAB après conversion en tiff 8 bits dans ImageJ. Les résultats de l’algorithme tout au long du processus ont été enregistrés et documentés à la figure 2 pour l’image représentative. Dans cette image, l’algorithme a compté 226 cellules, et ce nombre d’images a été vérifié par comparaison avec un co.......

Discussion

Nous avons conçu une procédure générale basée sur la zone qui comptait avec précision et efficacité les cellules sur la base de la hauteur des cellules, permettant une quantification sans tache des cellules, même dans les systèmes de coculture. Les étapes critiques de cette procédure comprenaient la mise en œuvre d’un système d’intensité relative par lequel les cellules pouvaient être différenciées. L’utilisation d’une analyse de la hauteur relative avait deux objectifs : le besoin de paramètres externes était rendu inut.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Microscope inversé	Zeiss	1028290770
&beta ;-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Eagle Medium modifié de Dublecco	Fisher Scientific	12430047
Fisher Scientific	14190144	Dublecco
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cellules	ATCC ATCC	CRL - 1658
Pénicilline&ndash ; Streptomycine	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cellules	ATCC	ATCC TIB - 71
Bicarbonate	de sodium Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Flacon de culture cellulaire	Corning	CLS3814-24EA