Algorithme d’analyse d’image basé sur la zone pour la quantification des cocultures macrophages-fibroblastes

Résumé

Nous présentons une méthode qui utilise une approche d’analyse d’image généraliste basée sur des zones pour identifier le nombre de cellules. L’analyse de différentes populations cellulaires a exploité les différences significatives de hauteur et de structure cellulaires entre les différents types de cellules au sein d’un algorithme adaptatif.

Résumé

La quantification des cellules est nécessaire pour un large éventail d’études biologiques et biochimiques. L’analyse d’image conventionnelle des cellules utilise généralement des approches de détection par fluorescence, telles que la coloration immunofluorescente ou la transfection avec des protéines fluorescentes ou des techniques de détection des bords, qui sont souvent sujettes aux erreurs en raison du bruit et d’autres non-idéalités dans l’arrière-plan de l’image.

Nous avons conçu un nouvel algorithme capable de compter et de distinguer avec précision les macrophages et les fibroblastes, des cellules de différents phénotypes qui colocalisent souvent lors de la régénération tissulaire. MATLAB a été utilisé pour implémenter l’algorithme, qui différenciait des types de cellules distincts en fonction des différences de hauteur par rapport à l’arrière-plan. Un algorithme primaire a été développé à l’aide d’une méthode basée sur la zone pour tenir compte des variations de la taille / structure des cellules et des conditions d’ensemencement à haute densité.

Les non-idéalités dans les structures cellulaires ont été prises en compte à l’aide d’un algorithme itératif secondaire utilisant des paramètres internes tels que la couverture cellulaire calculée à l’aide de données expérimentales pour un type de cellule donné. Enfin, une analyse des environnements de coculture a été réalisée à l’aide d’un algorithme d’isolement dans lequel différents types de cellules ont été exclus de manière sélective en fonction de l’évaluation des différences de hauteur relative au sein de l’image. Cette approche s’est avérée compter avec précision les cellules dans une marge d’erreur de 5% pour les cellules monocultrices et dans une marge d’erreur de 10% pour les cellules en coculture.

Introduction

Un logiciel est régulièrement mis en œuvre pendant les techniques d’analyse d’images pour s’assurer que les résultats sont précis, efficaces et impartiaux. Pour les tests cellulaires, un problème courant est l’identification erronée des cellules. Les images avec des paramètres de focale et de contraste incorrects peuvent entraîner un flou cellulaire, dans lequel la limite des cellules individuelles devient difficile à identifier¹. La présence de caractéristiques d’image étrangères telles que des pores, des bulles ou d’autres objets indésirables peut entraver les procédures de comptage en ralentissant le processus de comptage et en conduisant à une mauvaise identification. De plus, le comptage des cellules peut être onéreux et le comptage de centaines de répliques peut prendre beaucoup de temps. De plus, il existe un biais subjectif inhérent lors du comptage manuel, et donc la prise de décision concernant l’identification cellulaire est souvent inexacte². Les logiciels automatisés offrent un potentiel passionnant pour contourner tous ces problèmes en différenciant rapidement et précisément les cellules des objets étrangers, y compris des objets bien au-delà de la capacité humaine de détection précise, sur la base de critères d’identification bien définis qui réduisent l’influence du biais de l’investigateur. Les techniques courantes d’identification des cellules à l’aide d’un logiciel automatisé impliquent deux méthodes principales : la segmentation et le seuil³. Ici, nous démontrons un protocole généraliste basé sur la zone qui permet un comptage rapide, précis et peu coûteux des cellules dans un cadre logiciel largement accessible.

Les techniques de segmentation, telles que la détection des bords, cherchent à isoler les cellules individuelles en utilisant les différences d’intensité au sein d’une image. Les changements d’intensité qui distinguent une cellule du reste de l’image consistent le plus souvent en des changements brusques de luminosité⁴. La détection des bords implique une étape de filtrage de régularisation, suivie d’une étape de différenciation dans laquelle les changements d’intensité sont détectés. Le processus de différenciation identifie les arêtes et les contours dans l’image des changements de haute intensité, et ces arêtes et contours sont corrélés à la présence de cellules. Bien que les images avec du bruit puissent être exécutées par des algorithmes de débruitage⁴, les techniques de détection des bords sont idéalement utilisées pour analyser des images avec un faible bruit de fond. Le processus fonctionne de manière optimale lorsque les limites des cellules sont clairement et facilement distinguables et ne sont pas entravées par des contours de luminosité sans rapport avec la présence cellulaire, le flou cellulaire, les objets étrangers ou les structures cellulaires internes définies ^1,2. Si une image est particulièrement bruyante, les cellules peuvent être distinguées par coloration fluorescente ou transfection avec des protéines fluorescentes ^2,5. Bien que cela améliore considérablement la précision des techniques de segmentation, cela nécessite des coûts supplémentaires et des investissements en temps supplémentaires pour préparer les cultures cellulaires à l’imagerie.

Les techniques de seuil impliquent la division d’une image en deux catégories: le premier plan et l’arrière-plan, avec des cellules affectées au premier plan³. Ces techniques utilisent des changements de couleur/contraste pour définir la hauteur apparente d’un objet; les objets qui sont systématiquement « plus grands » que l’arrière-plan peuvent être facilement identifiés comme des cellules. La transformation du bassin versant fonctionne de cette manière en associant des surfaces avec des pixels clairs au premier plan et celles avec des pixels sombres comme arrière-plan ^6,7. Grâce à l’identification basée sur la hauteur, les techniques de seuillage peuvent systématiquement distinguer le bruit des objets souhaités, à condition qu’ils existent dans le même plan focal. Lorsqu’elle est associée à une quantification basée sur une zone, une transformation de bassin versant peut identifier avec précision des groupes d’objets dans des environnements où les techniques de segmentation typiques telles que la détection des bords seraient inexactes.

Les transformations de bassin versant sont généralement associées à des techniques de segmentation pour préparer les images à une analyse plus propre, ce qui se traduit par une plus grande précision du comptage cellulaire. Pour ce processus, la transformation du bassin versant est utilisée pour mettre en évidence les régions potentielles d’intérêt avant la segmentation. Une transformation de bassin versant offre des avantages uniques en identifiant les cellules au premier plan des images, ce qui peut améliorer la précision de l’analyse de segmentation en supprimant les faux positifs potentiels pour les cellules, tels que les taches inégales d’arrière-plan. Cependant, des difficultés peuvent survenir lorsque l’on tente d’adapter des images cellulaires à une transformation de bassin versant. Les images à haute densité cellulaire peuvent être en proie à une sous-segmentation, dans laquelle les agrégats de cellules sont identifiés comme un groupe singulier plutôt que comme des composants individuels. La présence de bruit ou de changements brusques d’intensité peut également entraîner une sursegmentation, dans laquelle l’algorithme surisole les cellules, ce qui entraîne un nombre excessif et inexact de cellules⁸.

Ici, nous détaillons une méthode pour minimiser les principaux inconvénients de la transformation du bassin versant en incorporant les composants d’une analyse de seuil dans un algorithme de quantification par zone, comme illustré à la figure 1. Notamment, cet algorithme a été mis en œuvre avec un logiciel open source et / ou largement disponible, et l’application de ce cadre de comptage cellulaire a été possible sans réactifs coûteux ou techniques complexes de préparation cellulaire. Les macrophages RAW264.7 ont été utilisés pour démontrer la méthode en raison de leur rôle essentiel dans la régulation du maintien du tissu conjonctif et des processus de cicatrisation des plaies⁹. De plus, les fibroblastes NIH/3T3 ont été analysés en raison de leur rôle clé dans l’entretien et la réparation des tissus. Les cellules fibroblastiques coexistent souvent avec les macrophages et les soutiennent, ce qui nécessite de distinguer ces types de cellules phénotypiquement distincts dans les études de coculture.

Le nombre de cellules à partir d’images à haute densité cellulaire viable (VCD) pourrait être quantifié de manière fiable et efficace en calculant la surface couverte par les cellules et la surface moyenne occupée par une cellule singulière. L’utilisation du seuil par opposition à la segmentation pour l’identification cellulaire a également permis des analyses plus complexes, telles que des expériences dans lesquelles différents types de cellules en coculture ont été analysés simultanément. Les fibroblastes NIH/3T3, qui se colocalisent souvent avec les macrophages RAW264.7 dans un site de cicatrisation des plaies, se développent à un plan focal distinct du plan focal des macrophages¹⁰. En conséquence, plusieurs algorithmes de seuil ont été exécutés pour définir l’arrière-plan et le premier plan en fonction du type de cellule analysé, permettant un comptage précis de deux types de cellules différents dans la même image.

Protocole

1. Culture cellulaire et acquisition d’images

1. Culture de macrophages RAW264.7 à 37 °C et 5 % de CO₂ dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine, 1,5 g/L de bicarbonate de sodium et 5 μM de β-mercaptoéthanol.
   1. Pour l’imagerie en monoculture, cultiver des cellules RAW264.7 à une densité de 25 000 cellules/^cm2 dans une fiole de culture cellulaire de 5 mL avec 1 mL de milieu.
2. Culture de cellules NIH/3T3 à 37 °C et 5 % de CO₂ dans du DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine¹¹.
3. Pour l’imagerie par coculture, on cultive ensemble des macrophages RAW264.7 et des fibroblastes NIH/3T3 à des proportions variées, à une densité totale de 25 000 cellules/^cm2. Utilisez un milieu de coculture composé de 1 partie de milieu RAW264,7 (DMEM complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine, 1,5 g/L de bicarbonate de sodium et 5 μM de β-mercaptoéthanol) et 1 partie de milieu NIH/3T3 (DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine).
4. Après l’ensemencement, incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pour atteindre une densité cellulaire viable de 80 % de confluence cellulaire.
5. Cellules d’image avec un microscope inversé équipé d’un objectif 40x. Acquérez toutes les images en niveaux de gris et exportez-les dans le fichier brut '.czi'.
   1. Déterminez la capacité de l’algorithme à évaluer avec précision les images avec une gamme de qualités d’image. Acquérir des images avec des foyers variés, produisant à la fois des images « non bulbeuses » (Figure 2) et des images « bulbeuses » (Figure 3).
   2. Exportez et convertissez des images de cellules au format d’image tiff (.tiff) 8 bits à l’aide d’ImageJ à l’aide de la fonction 'Batch Convert' sur les fichiers bruts '.czi' avant l’analyse MATLAB. Stockez les images converties dans un dossier local et transférez manuellement ces fichiers image dans la corbeille MATLAB appropriée.

2. Analyse d’images-monoculture utilisant principalement le fichier « monoculture.m »

REMARQUE : Les étapes suivantes ont été effectuées à l’aide de MATLAB. Trois fichiers ont été utilisés pour le protocole MATLAB : « process.m » (fichier de codage supplémentaire 1), le fichier contenant l’algorithme, « monoculture.m » (fichier de codage supplémentaire 2), le fichier à exécuter pour l’analyse des images de monoculture, et « coculture_modified.m » (fichier de codage supplémentaire 3), le fichier à exécuter pour analyser les images de coculture.

1. Utilisez la méthode basée sur la zone pour obtenir des images de cellules montrant des variations de hauteur relatives. Sorties d’image pour chaque sous-étape en utilisant la fonction 'imshow()' pour chaque sous-image. Copiez et collez le fichier image pour analyse dans la corbeille et entrez le nom du fichier dans la commande suivante. Appuyez sur Exécuter pour démarrer le programme.
   imread('nom_fichier.tiff')
   1. Analysez les images en « ouvrant par reconstruction » suivi de « fermant par reconstruction » à l’aide des fonctions source⁸ pour agrandir le premier plan à partir de l’arrière-plan. Utilisez la première commande pour ouvrir par reconstruction et les deuxième et troisième séquences pour fermer par reconstruction
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. Binariser les images reconstruites en pixels noir et blanc pur à l’aide d’un système d’identification basé sur le centile. Notez que les cellules sont converties en une valeur de pixel blanc pur de '255' dans ce système, tandis que les objets d’arrière-plan et étrangers (non cellulaires) sont convertis en une valeur de pixel noir pur de '0'.
   1. Distinguer les cellules de l’arrière-plan en utilisant une différence centile du « pixel maximum pertinent », la plus grande valeur de pixel comprenant au moins 0,5% d’une image donnée.
   2. Analysez et évaluez les valeurs de pixels pour les macrophages RAW264.7. Si ces valeurs se situent à moins de 4,5 % du pixel maximal pertinent, marquez le pixel comme cellulaire.
      Remarque : Cette commande peut être émise à l’aide d’une instruction if simple.
   3. Pour les images contenant des profils de cellules bulbeuses, comme celles vues à la figure 2, mettez en œuvre une procédure itérative pour corriger la binarisation erronée au centre des cellules (appelées « îles »; voir ci-dessous), comme suit.
   4. Déterminer une estimation initiale de la couverture cellulaire totale; 60 % ont été utilisés pour cette étude. Notez que le nombre de cellules présentes dans l’image doit dépendre de la couverture cellulaire - la relation entre le nombre de cellules et la couverture cellulaire peut donc être déterminée expérimentalement. En utilisant cette relation, déterminez les variables 'Alpha' et 'kappa'.
      REMARQUE: 'Alpha' représente un vecteur 3 x 1 contenant les percentiles de hauteur relative suivants: le percentile de hauteur auquel les cellules ont été identifiées, le percentile de hauteur auquel l’arrière-plan a été identifié et le percentile de hauteur auquel les îles-régions dans lesquelles les valeurs d’intensité étaient significativement inférieures aux valeurs cellulaires -résidaient généralement. 'Kappa' représente la surface totale couverte par les cellules de l’image.
   5. Exécutez l’algorithme, qui (i) analysera les images en utilisant des estimations initiales d’alpha et de kappa pour remplir une partie des îles, et (ii) utilisera le nombre de cellules et la couverture post-analyse pour recalculer kappa. Si la valeur kappa se situe à moins de 10 % de la supposition initiale, passez à l’étape suivante.
      REMARQUE: Pour les images contenant des cellules RAW264.7 et NIH /3T3, alpha s’est avéré être [4.3, 5.5, 10]. En d’autres termes, une différence de 4,3 % par rapport au pixel maximal pertinent a déterminé le percentile de hauteur auquel les cellules ont été identifiées, une différence de 5,5 % par rapport au pixel maximal pertinent a déterminé le percentile de hauteur auquel l’arrière-plan a été identifié. Une différence de 10 % par rapport au pixel maximal pertinent a déterminé le centile de hauteur auquel les îles résidaient généralement.
3. Après la binarisation de l’image, déterminez automatiquement la surface cellulaire moyenne à l’aide de l’algorithme de recherche de cercle open source, qui effectue une transformation de Hough sur l’image binarisée 12,13,14. Utilisez la commande suivante pour obtenir un vecteur de tous les emplacements centraux et des rayons des cercles trouvés dans l’image.
   '[centres, rayons] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
   'A' dans cette commande est l’image de choix, et [minradius, maxradius] est la plage de rayons que l’algorithme tentera de détecter.
   REMARQUE: Cette procédure pour déterminer la surface cellulaire moyenne suppose que la morphologie des cellules macrophages était à la fois circulaire et cohérente entre les cellules¹⁰. D’après les données expérimentales, les rayons des macrophages sont le plus souvent observés entre 30 et 50 pixels à un grossissement de 40x. Cette plage de pixels est définie comme la plage acceptable pour l’algorithme de recherche de cercles. Les rayons pourraient être significativement différents pour d’autres types de cellules et nécessiteraient une détermination à l’aide d’une analyse expérimentale.
   1. Utilisez les sorties de rayons pour calculer la surface moyenne des cellules par moyenne. Analysez au moins 10 cellules pour assurer une identification précise de la zone.
4. Déterminez le nombre total de cellules dans l’image à l’aide de la surface moyenne des cellules.
   1. Parcourez la matrice d’image en boucle et comptez le nombre total de pixels de cellule. Déterminez la couverture totale des cellules en divisant le nombre de pixels de cellule par le nombre total de pixels dans l’image. Déterminez le nombre total de cellules dans l’image en divisant le nombre de pixels de cellule par la surface moyenne d’une cellule.

3. Analyse d’images-coculture utilisant principalement le fichier « coculture_modified.m »

REMARQUE : Les étapes suivantes ont été effectuées à l’aide de MATLAB.

1. Utilisez la méthode basée sur la zone pour obtenir des images de cellules montrant des variations de hauteur relatives. Sorties d’image pour chaque sous-étape en utilisant la fonction 'imshow()' pour chaque sous-image. Copiez et collez le fichier image pour analyse dans la corbeille et entrez le nom du fichier dans la commande suivante. Appuyez sur Exécuter pour démarrer le programme.
   'imread('nom_fichier.tiff')'
   1. Analysez les images en « ouvrant par reconstruction » suivi de « fermant par reconstruction » en utilisant les fonctions source¹⁰ pour agrandir le premier plan à partir de l’arrière-plan. Utilisez la première commande pour ouvrir par reconstruction et les deuxième et troisième séquences pour fermer par reconstruction.
      'imopen ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. Effectuer une analyse des cocultures contenant des cellules RAW264.7 et NIH/3T3 en utilisant deux binarisations sélectives, obtenues en exploitant les différences de hauteur entre les deux types de cellules.
   1. Déterminez expérimentalement un paramètre 'phi' à l’aide d’images de cellules RAW264.7 et NIH/3T3, phi représentant la différence de hauteur proportionnelle entre les deux types de cellules. Devinez une valeur phi initiale et itérez jusqu’à ce que le nombre de cellules et la couverture correspondent étroitement aux comptages manuels, spécifiques à la coculture RAW264.7 et NIH/ 3T3.
      REMARQUE: La valeur de phi utilisée dans ces études s’est avérée être de 3,2. Phi est utilisé pour filtrer sélectivement une image afin qu’elle semble contenir uniquement des cellules RAW264.7, comme le montre la figure 4C.
   2. Déterminez le nombre de cellules RAW264.7 et la couverture cellulaire totale de la même manière que pour les images de monoculture.
3. Analysez à nouveau l’image transformée par le bassin versant sans le paramètre phi, en détectant à la fois les macrophages et les fibroblastes. Acquérir des données de fibroblastes NIH/3T3 en soustrayant sélectivement les pixels de cellules RAW264.7, obtenus à l’aide des méthodes standard de seuil et de quantification par zone décrites à l’étape 2.
   1. Une fois l’image entière analysée, déterminez le nombre total de pixels NIH/3T3 en soustrayant le nombre total de pixels de cellule du nombre de pixels RAW264.7. Calculez la couverture des cellules NIH/3T3 et RAW264.7 en divisant par le nombre de pixels de cellule pour chaque lignée cellulaire par le nombre total de pixels d’image.

Résultats

L’analyse des macrophages RAW264.7 non bulbeux a été réalisée en monoculture à 25 000 cellules/cm². Des images représentatives de la culture cellulaire ont été prises et traitées dans MATLAB après conversion en tiff 8 bits dans ImageJ. Les résultats de l’algorithme tout au long du processus ont été enregistrés et documentés à la figure 2 pour l’image représentative. Dans cette image, l’algorithme a compté 226 cellules, et ce nombre d’images a été vérifié par comparaison avec un co...

Discussion

Nous avons conçu une procédure générale basée sur la zone qui comptait avec précision et efficacité les cellules sur la base de la hauteur des cellules, permettant une quantification sans tache des cellules, même dans les systèmes de coculture. Les étapes critiques de cette procédure comprenaient la mise en œuvre d’un système d’intensité relative par lequel les cellules pouvaient être différenciées. L’utilisation d’une analyse de la hauteur relative avait deux objectifs : le besoin de paramètres externes était rendu inut...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Axio Observer 7 Microscope inversé	Zeiss	1028290770
&beta ;-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Eagle Medium modifié de Dublecco	Fisher Scientific	12430047
Fisher Scientific	14190144	Dublecco
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cellules	ATCC ATCC	CRL - 1658
Pénicilline&ndash ; Streptomycine	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cellules	ATCC	ATCC TIB - 71
Bicarbonate	de sodium Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Flacon de culture cellulaire	Corning	CLS3814-24EA