Ici, nous décrivons une méthode de surveillance non invasive impliquant l’expression de la luciférase et de la protéine fluorescente verte dans diverses lignées cellulaires de cancer du sein. Ce protocole fournit une technique pour surveiller la formation de tumeurs et la colonisation métastatique en temps réel chez la souris.
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Article de méthode
Surveillance de la croissance du cancer du sein et de la formation de colonies métastatiques chez la souris à l’aide de la bioluminescence
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cancer du sein est une tumeur maligne hétérogène fréquente et la deuxième cause de mortalité chez les femmes, principalement due à des métastases d’organes distants. Plusieurs modèles animaux ont été générés, y compris les modèles murins orthotopiques largement utilisés, où des cellules cancéreuses sont injectées dans le coussinet adipeux mammaire. Cependant, ces modèles ne peuvent pas aider à surveiller la cinétique de croissance tumorale et la colonisation métastatique. Des outils de pointe pour surveiller les cellules cancéreuses en temps réel chez la souris feront progresser considérablement la compréhension de la biologie tumorale.
Ici, des lignées cellulaires de cancer du sein exprimant de manière stable la luciférase et la protéine fluorescente verte (GFP) ont été établies. Plus précisément, cette technique contient deux étapes séquentielles initiées par la mesure de l’activité de la luciférase in vitro et suivies de l’implantation des cellules cancéreuses dans les coussinets adipeux mammaires de souris atteintes d’immunodéficience combinée diabétique-sévère (NOD-SCID) non obèses. Après l’injection, la croissance tumorale et la colonisation métastatique sont surveillées en temps réel par le système d’imagerie par bioluminescence non invasif. Ensuite, la quantification des métastases exprimant la GFP dans les poumons sera examinée par microscopie à fluorescence pour valider les résultats de bioluminescence observés. Ce système sophistiqué combinant la luciférase et les outils de détection basés sur la fluorescence évalue les métastases cancéreuses in vivo, qui ont un grand potentiel d’utilisation dans les thérapies contre le cancer du sein et la gestion des maladies.
Introduction
Les cancers du sein sont des types de cancer fréquents dans le monde entier, avec environ 250 000 nouveaux cas diagnostiqués chaque année aux États-Unis1. Malgré son incidence élevée, un nouvel ensemble de médicaments anticancéreux a considérablement amélioré les résultats des patientes atteintes d’un cancer du sein2. Cependant, ces traitements sont encore inadéquats, car de nombreux patients connaissent une rechute de la maladie et une propagation métastatique aux organes vitaux2, qui est la principale cause de morbidité et de mortalité des patients. Par conséquent, l’un des principaux défis de la recherche sur le cancer du sein est d’identifier les mécanismes moléculaires régulant la formation des métastases distales afin de développer de nouveaux moyens d’inhiber leur développement.
La métastase cancéreuse est un processus dynamique dans lequel les cellules se détachent de la tumeur primaire et envahissent les tissus voisins par la circulation sanguine. Ainsi, les modèles animaux dans lesquels les cellules subissent une cascade métastatique similaire peuvent faciliter l’identification des mécanismes qui régissent ce processus 3,4. De plus, ces modèles in vivo sont essentiels au développement d’agents thérapeutiques contre le cancer du sein 5,6. Cependant, ces modèles orthotopiques ne peuvent pas indiquer la cinétique réelle de croissance tumorale car l’effet n’est déterminé qu’à la fin. Par conséquent, nous avons mis en place un outil basé sur la luciférase pour détecter le développement de tumeurs et la colonisation métastatique en temps réel. De plus, ces cellules expriment la GFP pour détecter les colonies métastatiques. Cette approche est relativement simple et n’implique aucune procédure invasive3. Ainsi, la combinaison de la luciférase et de la détection par fluorescence est une stratégie utile pour faire progresser les études précliniques sur les thérapies contre le cancer du sein et la gestion de la maladie.
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Protocole
Toutes les expériences sur la souris ont été réalisées dans le cadre du protocole MD-21-16429-5 approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université hébraïque. En outre, l’Université hébraïque est certifiée par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC).
1. Maintenance des lignées cellulaires
REMARQUE: Les lignées cellulaires du cancer du sein humain (MCF-7, MDA-MB-468 et MDA-MB-231) ont été utilisées dans ce protocole.
- Cultiver toutes les lignées cellulaires du cancer du sein dans le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans un incubateur de dioxyde de carbone humidifié (5% co2).
REMARQUE: Vérifiez régulièrement la densité cellulaire; diviser et étendre pour une utilisation future lorsqu’ils atteignent 70% de confluence.
2. Préparation du virus
- Traiter les cellules HEK293T avec 1 mL de trypsine jusqu’à ce qu’elles se détachent.
- Ajouter 10 mL de DMEM (10 % FBS) pour neutraliser l’activité de la trypsine et transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube centrifuge de 15 mL.
- Centrifuger à 150 × g pendant 5 min pour sédimenter les cellules. Jeter le surnageant après la centrifugation et ajouter 1 mL de milieu DMEM frais.
- Déterminer la concentration cellulaire et ensemencer 1,2 × 106 cellules/puits dans une plaque de six puits.
- Le lendemain, prévassez tous les réactifs nécessaires, y compris le réactif de transfection, le DMEM sans sérum, le plasmide d’enveloppe (VSV-G), le plasmide d’emballage de lentivirus (ΔVPR) et le plasmide de blast pLX304 Luciferase-V5 ou le plasmide FUW GFP.
- Dans un tube de centrifugeuse autoclavé de 1,5 mL, mélanger 50 μL de DMEM sans sérum avec 0,3 μg de plasmide VSV-G, 1 μg de ΔVPR et 1,2 μg de plasmide de blast pLX304 Luciferase-V5 ou de plasmide FUW GFP.
- Après avoir bien mélangé ces plasmides avec le milieu, ajouter 5 μL du réactif de transfection, mélanger doucement et incuber le mélange à température ambiante pendant 15 min.
- Après l’incubation, ajouter le mélange goutte à goutte aux cellules HEK293T.
- Après 24 h, remplacer le milieu de croissance par 2 mL de (30% FBS) DMEM. Le lendemain (48 h après la transfection), récolter le milieu contenant les virus (« pLX304 Luciferase-V5 ou les virus FUW GFP »).
REMARQUE: L’utilisation de 30% FBS améliore l’efficacité de la production de virus. - Pour éviter tout résidu de cellules HEK293T, passez le milieu contenant le virus à travers un filtre à seringue de 0,45 μm ou centrifugez à 150 × g pendant 5 min et collectez le surnageant.
REMARQUE: Pour le stockage à long terme, conservez les aliquotes de travail du virus à -80 ° C.
3. Établir des cellules exprimant de manière stable la GFP et la luciférase (« GFP + Luc+ cellules »)
- La veille de l’infection des cellules, ensemencez 8 × 105 cellules par puits dans une plaque de six puits.
- Après une incubation d’une nuit, remplacer le milieu de croissance par un milieu frais contenant 8 μg/mL de polybrene. Ajouter 200 μL de virus FUW GFP goutte à goutte aux cellules.
- Facultatif : Pour améliorer l’efficacité du virus, centrifuger la plaque à 560 × g pendant 30 min (37 °C) (infection par spin).
- Incuber les cellules pendant 48 h et vérifier l’expression de la GFP par microscopie à fluorescence.
- Trier les cellules exprimant le GFP par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (GFP+) (Figure 1A).
- Infecter les cellules triées GFP avec les virus de l’explosion pLX304 Luciferase-V5 comme décrit à l’étape 3.2.
- Traiter les cellules avec de la blasticidine (10 μg/mL) 30 h après l’infection pour les enrichir pour les cellules exprimant le blaste pLX304 Luciferase-V5 (GFP+, Luc+ ). Ensuite, tous les deux jours, remplacer par un milieu frais contenant de la blasticidine. De plus, comme témoin, traiter les cellules naïves avec le même milieu contenant de la blasticidine.
REMARQUE: Une nette différence entre les cellules infectées et les cellules témoins doit être observée après quelques jours de traitement à la blasticidine. Cet effet dépend de la lignée cellulaire et prend généralement environ 8 à 10 jours. Un faible taux de survie indiquera un faible rendement de production virale. Si c’est le cas, produisez un nouveau lot de virus, car une faible efficacité peut affecter les expériences futures.
4. Validation de l’activité de la luciférase in vitro
- Cultivez les cellules MCF-7, MDA-MB-468 et MDA-MB-231 GFP+ Luc+ dans une plaque de 15 cm jusqu’à 80 % de confluence. Récoltez les cellules par trypsinisation, comme décrit aux étapes 2.1-2.2.
- Ensemencez un nombre croissant de cellules dans chaque puits (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 104) dans une plaque noire de 96 puits.
REMARQUE: Les plaques noires de 96 puits sont plus adaptées à la mesure des niveaux de luciférase, car les plaques blanches ou transparentes produiront des signaux d’autoluminescence. Comme témoin, utilisez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) seule dans un puits pour vous assurer qu’il n’y a pas d’autoluminescence du PBS. - Remplissez tous les puits avec 100 μL de DMEM et incubez pendant 16-24 h.
- Préparer la solution de luciférine dans du PBS à une concentration de 1,5 mg/mL à partir du stock de 30 mg/mL. Aliquoter le stock de solution de luciférine et conserver à -20 °C.
- Lavez doucement les cellules avec du PBS, ajoutez 100 μL de solution de luciférine dans chaque puits et attendez 2 min. Enfin, mesurez l’activité de la luciférase dans toutes les cellules cancéreuses du sein en utilisant la bioluminescence.
REMARQUE: L’examen in vitro de l’expression de la GFP et de la luciférase avant les expériences sur les animaux est crucial. De plus, des puits vierges sont utilisés pour soustraire l’arrière-plan.
5. Injection de cellules GFP+ Luc+ à des souris
- Transférez 5 × 106 (MCF-7 et MDA-MB-468) ou 2 × 10 cellules GFP+ Luc+ 6 (MDA-MB-231) en 200 μL ou 100 μL PBS, respectivement.
- Avant l’injection, nettoyez la hotte biologique stérile avec une solution désinfectante à 5% (voir le tableau des matériaux). Ensuite, anesthésiez les souris avec de l’air filtré (0,2 μm) contenant 4% d’isoflurane à un débit d’air de 1 L/min pendant 2−3 min.
REMARQUE: Il est essentiel de confirmer une anesthésie appropriée; pincez l’orteil de la souris et recherchez n’importe quelle réponse. - Placez un cône sur la tête de souris anesthésiée en position couchée. Appliquez une pommade vétérinaire sur ses yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Essuyez la région abdominale de la souris, au-dessus de la glande mammaire, avec de l’éthanol à l’aide d’un coton-tige et soulevez la 4e glande mammaire avec une pince.
- Insérez l’aiguille 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) sous le coussinet adipeux et injectez lentement 100 μL de la suspension cellulaire.
REMARQUE: Un renflement rond apparaîtra sous la peau. En outre, une injection incorrecte peut entraîner une déviation du taux de croissance tumorale ou l’absence de tumeur dans le même groupe expérimental. - Après la procédure d’injection, sortez les souris du capot et transférez-les dans une nouvelle cage. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles reviennent à la conscience.
REMARQUE: Assurez-vous que toutes les aiguilles et seringues usagées sont jetées dans la boîte d’objets tranchants.
6. Mesure des niveaux de luciférase chez les souris GFP+ Luc+
- Avant la détection de la bioluminescence, retenez la souris consciente en tenant son cou avec la main gauche. Ensuite, inclinez la main vers la gauche, ce qui entraîne le visage de la souris vers le haut avec le bas du corps en position couchée.
- Injecter 100 μL de luciférine (30 mg/mL) par voie intrapéritonéale (i.p.) dans la surface abdominale de la souris dans le quadrant abdominal inférieur gauche à l’aide d’une seringue de 1,0 mL avec une taille d’aiguille de 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm).
REMARQUE: La pointe de l’aiguille ne doit pas être insérée à plus de 3-5 mm de la paroi abdominale, car elle pourrait pénétrer dans les organes viscéraux. De plus, il est recommandé d’effectuer une injection d’i.p. sans anesthésie car la distribution de la luciférine dans le corps des souris anesthésiées est plus lente que chez les souris conscientes. Ainsi, la surveillance des niveaux de luciférase chez les souris conscientes est une procédure plus rapide. - Gardez la souris pendant 7 min sans anesthésie suivie de 3 min dans la chambre d’anesthésie avant de mesurer la cinétique tumorale.
REMARQUE: Le temps d’incubation varie entre les différentes expériences, lignées cellulaires et espèces à l’autre. Ainsi, il est recommandé de calibrer le temps d’incubation avant de commencer les expériences. - Anesthésiez les souris comme décrit aux étapes 5.2-5.3.
- Ouvrez le logiciel (Table des matériaux) pendant l’incubation, initialisez le système d’imagerie et cliquez sur le bouton Initialiser .
REMARQUE: Sachez que l’appareil photo prendra environ 10 minutes pour refroidir et atteindre -90 ° C. De plus, comme contrôle de fond, mesurez les niveaux de luciférase chez les souris naïves (c.-à-d. les souris GFP+ injectées avec des cellules qui n’expriment pas le gène de la luciférase). - Conservez la configuration en exposition automatique à l’aide des paramètres suivants: temps d’exposition automatique, 60 s; Binning Medium, F/Stop 1; Filtre d’excitation bloqué; Filtre d’émission ouvert. Lorsque l’initialisation se termine, sélectionnez Assistant Création d’images | Bioluminescence , puis cliquez sur Suivant | Ouvrir le filtre | sélectionnez Souris dans l’objet de l’image.
- Dans Field View, sélectionnez l’étape C (10 cm) et la hauteur du sujet : 1,50 cm.
- Cliquez sur Image Setup Stage sur C et, avant de cliquer sur le bouton Acquérir, assurez-vous que la souris est placée sur la scène en position couchée appropriée.
- Fermez la porte, cliquez sur le bouton Acquérir et attendez qu’une image apparaisse à l’écran.
REMARQUE: Avec l’option d’exposition automatique, un signal fort prend 5-20 s en fonction du signal; un signal faible prendra environ 60 s. - Répétez cette étape pour les autres souris.
- Pour détecter les métastases pulmonaires, couvrez le signal fort de la tumeur primaire à l’aide de papier cartonné noir épais et exposez uniquement le côté ventral des poumons vers la caméra. Capturez l’image en utilisant les mêmes paramètres décrits ci-dessus.
7. Acquisition d’une image ex vivo par bioluminescence et fluorescence
- Euthanasier les souris en utilisant l’inhalation de dioxyde de carbone (CO2) dans le dessiccateur et disséquer les souris à l’aide de ciseaux et de pinces autoclavés.
- Perfuser les souris en utilisant une solution saline à 0,9%, prélever les organes et rincer avec 1x PBS pour éliminer les taches de sang de l’organe.
- Transférez l’organe rincé dans une boîte de Pétri et placez-le dans la scène de la machine de bioluminescence. Appliquez le même paramètre de bioluminescence que celui décrit aux étapes 6.2 à 6.6.
REMARQUE: En raison de la diminution du signal de luciférase, cette étape limite le temps. Ainsi, après euthanasie des souris, visualisez immédiatement l’organe par bioluminescence. - Pour les images GFP, appliquez le même paramètre que celui décrit à l’étape 6.3, en utilisant le filtre GFP à fluorescence au lieu de Bioluminescence.
- Prenez des images pulmonaires à l’aide d’un stéréomicroscope pour examiner la présence de colonies de GFP+.
8. Analyse des données de bioluminescence
- Double-cliquez sur le logiciel et sélectionnez Ouvrir dans le menu Fichier .
- Ouvrez tous les fichiers et réduisez-les. Assurez-vous que toutes les unités sont Radiance (Photons). En outre, cliquez sur Appliquer à tous pour conserver les mêmes paramètres pour toutes les images.
- Dans le menu Affichage , sélectionnez la palette d’outils, qui ouvrira une nouvelle fenêtre.
- Dans la fenêtre Palette d’outils , sélectionnez l’onglet Outils de retour sur investissement et, dans Type, choisissez le retour sur investissement moyen de Bkg.
- Dans les outils ROI, sélectionnez Cercle et dessinez un petit cercle sur la zone thoracique de la souris.
- Double-cliquez sur le cercle, sélectionnez l’option Utiliser comme BKG pour les futurs retours sur investissement dans l’onglet Retour sur investissement en arrière-plan , puis cliquez sur Terminé.
9. Mesure du flux total
- Dans la fenêtre Palette d’outils , sélectionnez l’onglet Outils de retour sur investissement et, dans Type, choisissez Mesure du retour sur investissement.
- Dans les outils de retour sur investissement, sélectionnez Cercle et dessinez un grand cercle sur la tumeur primaire de la souris.
- Cliquez avec le bouton droit sur Copier le retour sur investissement et cliquez avec le bouton droit sur Coller le retour sur investissement dans chaque fichier individuel de chaque souris.
- Cliquez sur Mesurer les retours sur investissement dans l’onglet Outils de retour sur investissement , ce qui ouvrira une nouvelle fenêtre nommée Mesures du retour sur investissement. Dans cet onglet, conservez les types de mesures en tant que rayonnement (photons) et les attributs d’image en tant que toutes les valeurs renseignées.
- Exportez le fichier au format Fichier de mesures (*.txt) ou Csv (*.csv).
- Ouvrez les données exportées dans une feuille de calcul et prenez le flux total (p/s) et les valeurs des semaines.
REMARQUE: Cette étape peut être utilisée pour mesurer différents groupes. Par exemple, les souris traitées avec un véhicule par rapport à celles traitées avec un médicament. - Générez un diagramme XY, où le temps est présenté le long de l’axe X et le flux total (p / s) le long de l’axe Y. Pour chaque semaine, prenez le paramètre Flux total (p/s) pour chaque groupe d’échantillon et déterminez toute différence significative à l’aide du test t de Student non paramétrique.
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Résultats
Nous avons généré des lignées cellulaires de cancer du sein (MDA-MB-231, MCF-7 et MDA-MB-468) exprimant des vecteurs GFP et luciférase. Plus précisément, cela a été réalisé par une infection séquentielle. Tout d’abord, les lignées cellulaires du cancer du sein ont été infectées par un vecteur de lentivirus exprimant la GFP fluorescente. Les cellules GFP positives (GFP+) ont été triées 2 jours après l’infection (Figure 1A,B) et infectées par le vecteur pLX304 Lucif...
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Discussion
Les expériences sur les animaux sont obligatoires pour la recherche sur le cancer 7,8,9, et en effet de nombreux protocoles ont été développés 3,6,10,11,12,13,14. Cependant, la plupart de ces étude...
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Déclarations de divulgation
Tous les auteurs ont révélé qu’ils n’avaient aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions les membres du laboratoire Y.D.S. Nous tenons à remercier l’Institut Wohl pour la médecine translationnelle du Centre médical Hadassah, à Jérusalem, pour avoir fourni l’installation d’imagerie pour petits animaux. Cette étude a été soutenue par le prix de développement de carrière en recherche du Fonds israélien de recherche sur le cancer.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes eppendorf de 1,7 mL | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 & micro ; Embouts L | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 & micro ; Embouts en L | Lifegene | LRT1000 | |
| tubes de 15 mL | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 & micro ; L tips | Lifegene | LRT200 | |
| Plaque de culture cellulaire 6 puits | COSTAR | 3516 | |
| Plaques 96 puits NOIR à fond plat | Bar | Naor BN30496 | |
| Compteurs de cellules automatisés | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III Trieur | BD | ||
| BD Microlance 3 Aiguilles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Seringues Plastipak 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Plat de style | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Plat de style | CORNING | 430599 | |
| Lames de chambre de comptage de cellules Countess | Thermofisher | C10228 | |
| Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), riche en glucose, sans glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Microscope Eclipse 80i | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Offert par le laboratoire du Dr Yossi Buganim (Université hébraïque de Jérusalem | ||
| )HEK293T | Offert par le laboratoire du Dr Lior Nissim (Université hébraïque de Jérusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum Système d’imagerie in vivo | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Industries biologiques | 03-020-1A | |
| Logiciel d’image vivante | Bioluminescence PerkinElmer | mesure | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pipettes Pasteur | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Fourni par David M. Sabatini' s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Fourni par David M. Sabatini' s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Pénicilline-Streptomycine Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Boîte de Pétri 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmide | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Réservoirs de réactifs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stéréomicroscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | ||
| Filtres pour seringues | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0,5 % solution | Industries biologiques | 03-102-1B | |
| Trypsine EDTA Solution B (0,25 %), EDTA (0,05 %) | Industries biologiques | 03-052-1a | |
| Filtres entraînés par le vide | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | |||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Réactif de transfection | Sigma Aldrich | #6366236001 |
Références
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Réimpressions et autorisations
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