Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.
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Article de méthode
Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (CSL) sont des cellules endothéliales spécialisées situées à l’interface entre la circulation et le parenchyme hépatique. Les CSLS ont une morphologie distincte caractérisée par la présence de fenestrae et l’absence de membrane basale. Les CSL JOUENT UN RÔLE ESSENTIEL DANS DE NOMBREUX TROUBLES PATHOLOGIQUES DU FOIE, NOTAMMENT LA DÉRÉGULATION MÉTABOLIQUE, L’INFLAMMATION, LA FIBROSE, L’ANGIOGENÈSE ET LA CANCÉROGENÈSE. Cependant, peu de choses ont été publiées sur l’isolement et la caractérisation des CSLS. Ici, ce protocole traite de l’isolement du LSEC chez les souris saines et non alcooliques de la stéatose hépatique (NAFLD). Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase du foie de souris et la sélection positive de billes magnétiques de cellules non parenchymateuses pour purifier les CSL. Cette étude caractérise les LSEC à l’aide de marqueurs spécifiques par cytométrie en flux et identifie les caractéristiques phénotypiques caractéristiques par microscopie électronique à balayage. Les CSLS isolés selon ce protocole peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles, y compris des essais d’adhérence et de perméabilité, ainsi que des études en aval pour une voie d’intérêt particulière. En outre, ces LSTEC peuvent être regroupés ou utilisés individuellement, ce qui permet la génération de données multi-omiques, y compris l’ARN-seq en vrac ou à cellule unique, la protéomique ou la phospho-protéomique, et le test pour la chromatine accessible à la transposase en utilisant le séquençage (ATAC-seq), entre autres. Ce protocole sera utile pour les chercheurs qui étudient la communication des CSL avec d’autres cellules hépatiques dans les domaines de la santé et de la maladie et permettra une compréhension approfondie du rôle des CSLS dans les mécanismes pathogènes des lésions hépatiques aiguës et chroniques.
Introduction
Les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (CSL) tapissent les parois sinusoïdales hépatiques et sont les cellules non parenchymateuses les plus abondantes dans le foie1. Les CSL SE distinguent des autres cellules endothéliales capillaires ailleurs dans le corps par la présence de fenestrae et l’absence d’une membrane basale classique ou d’un diaphragme 2,3. Par conséquent, les CSLS possèdent des caractéristiques phénotypiques et structurelles distinctives qui améliorent leur perméabilité et leur capacité endocytaire à éliminer une variété de macromolécules circulantes, y compris l....
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Protocole
Les protocoles pour animaux ont été menés tels qu’approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Mayo Clinic. Des souris mâles C57BL/6J âgées de huit semaines ont été achetées au Jackson Laboratory. Les souris ont été logées dans une installation de cycle lumière-obscurité de 12:12 h à température contrôlée avec un accès gratuit à l’alimentation.
1. Préparation d’un plat ou d’une assiette de culture enrobé de collagène
- Pour obtenir 50 mL d’acide acétique 0,02 mol/L, ajouter 0,6 mL d’acide acétique glacial à 49,4 mL deH2O.
- Produire 50 μg/mL de collagè....
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Résultats
Schémas expérimentaux et équipements mis en place :
Dans ce protocole, le foie de souris a été digéré à l’aide d’un circuit de perfusion fermé, puis les cellules non parenchymateuses et les hépatocytes ont été séparés par centrifugation à basse vitesse à 50 x g pendant 2 min. Les CSL PRIMAIRES ont été isolés à l’aide de la sélection de billes magnétiques CD146 à partir de la fraction non parenchymateuse. Les schémas expérimentaux sont illustrés à la figure 1A. La.......
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Discussion
Dans le présent manuscrit, nous décrivons un protocole d’isolement LSEC du foie de souris consistant en une perfusion de collagénase en deux étapes et un tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) ultérieur. Ce protocole comprend les trois étapes suivantes: (1) Perfusion à travers le PV avec un tampon sans calcium suivi d’un tampon contenant de la collagénase pour obtenir une dispersion des cellules hépatiques; (2) Exclusion des hépatocytes avec centrifugation à basse vitesse; et (3) sélection positive basée sur macS de.......
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Déclarations de divulgation
Tous les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales du NIH (1RO1DK122948 à SHI) et le niH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Un soutien a également été fourni à KF par les bourses de recherche à l’étranger de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS). Nous tenons également à remercier le Dr Gregory J. Gores et Steven Bronk pour leur conception originale et l’optimisation de l’appareil de perfusion de collagénase.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cathéter intraveineux (IV) de 2,0 pouces et 20 g | Terumo, Somerset, New Jersey, | États-Unis SR-OX2051CA | |
| 2&ndash ; Plateau de perfuion de 3 pouces avec un trou au centre | personnalisé ; fabriqué en maison | ||
| 405/520 viabilité colorant | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-110-205 | |
| 4 pouces régulier courbé pince à pansement | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand suture en soie | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabiline-2 (souris) mAb-Alexa Fluorà ; 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-souris | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, souris | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-souris | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-110-803 | |
| Collagène de type I | Corning, Corning, NY, États-Unis | 354236 | |
| Collagénase II | Gibco, Waltham, MA, États-Unis | 17101-015 | |
| Milieu de croissance des cellules endothéliales | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, États-Unis | 211-500 | |
| Réactif de blocage FcR, souris | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-092-575 | |
| Logiciel FlowJo, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Trempé Ciseaux fins | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Chauffé (37 ° ; C) et appareil de perfusion à recirculation humidifié équipé d’une injection d’oxygène à un débit de 10 psi. | fabriqué en interne | ||
| Hitachi S 4700 microscope électronique à balayage | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS colonnes | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-042-401 | |
| Filtres de pré-séparation MACS (70 &mu ; m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-095-823 | |
| Tampon de rinçage MACS | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-091-222 | |
| Crépine intelligente MACS (70 &mu ; m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-098-462 | |
| MACSQunt cytomètre en flux | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Allemagne | ||
| Insert de culture cellulaire Millicell Millipore | Sigma, Burlington, MA, États-Unis | PITP01250 | |
| Compteur de cellules Nexcelom | Bioscience, Lawrence, MA, États-Unis | Cellomètre Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Ciseaux chirurgicaux | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Très petite pince à pansement incurvée | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
Références
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H.
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Réimpressions et autorisations
