Un modèle de xénogreffe sans marquage pour étudier le comportement des sphéroïdes de cellules souches humaines dans des embryons de poulet

Summary

Ici, nous décrivons une méthode de transplantation et d’identification de sphéroïdes de cellules humaines dans des embryons de poulet. Ce modèle de xénogreffe utilise le microenvironnement embryonnaire comme source de signaux instructifs pour tester la migration, la différenciation et le tropisme cellulaires et est particulièrement adapté à l’étude des populations cellulaires primaires et/ou hétérogènes.

Abstract

Les xénogreffes sont des méthodes précieuses pour étudier le comportement des cellules humaines in vivo. En particulier, l’environnement embryonnaire fournit des indices pour la migration, la différenciation et la morphogenèse cellulaires, avec des signaux instructifs uniques et une identité de couche germinale qui sont souvent absents des modèles de xénogreffes adultes. De plus, les modèles embryonnaires ne peuvent pas discriminer les tissus du soi par rapport aux tissus du non-soi, éliminant ainsi le risque de rejet du greffon et la nécessité d’une immunosuppression de l’hôte. Cet article présente une méthodologie pour la transplantation de sphéroïdes de cellules humaines dans des embryons de poulet, qui sont accessibles, susceptibles d’être manipulés et se développent à 37 °C.

Les sphéroïdes permettent de sélectionner une région spécifique de l’embryon pour la transplantation. Après avoir été greffées, les cellules s’intègrent dans le tissu hôte, ce qui permet le suivi de leur migration, de leur croissance et de leur différenciation. Ce modèle est suffisamment souple pour permettre l’utilisation de différentes populations d’adhérents, y compris des populations de cellules primaires hétérogènes et des cellules cancéreuses. Pour contourner la nécessité d’un marquage cellulaire préalable, un protocole d’identification des cellules donneuses par hybridation de sondes Alu spécifiques à l’homme est également décrit, ce qui est particulièrement important lors de l’étude de populations cellulaires hétérogènes. De plus, les sondes d’ADN peuvent être facilement adaptées pour identifier d’autres espèces donneuses. Ce protocole décrira les méthodes générales de préparation des sphéroïdes, de greffe dans des embryons de poulet, de fixation et de traitement des tissus pour la section de paraffine, et enfin d’identification des cellules humaines à l’aide de l’hybridation in situ de l’ADN. Des contrôles suggérés, des exemples d’interprétation des résultats et divers comportements cellulaires pouvant être dosés seront discutés en plus des limites de cette méthode.

Introduction

Les xénogreffes sont des outils utiles pour étudier le comportement des cellules humaines in vivo. Ces modèles ont fourni des informations précieuses pour un large éventail de sujets scientifiques, tels que la biologie des cellules souches humaines¹, l’observation des événements cellulaires en temps réel² et l’étude de l’angiogenèse tumorale et des métastases³. De plus, plusieurs aspects de la biologie du cancer, y compris la tumorigenèse des xénogreffes spécifiques au patient, ont été étudiés ^4,5....

Protocol

Toutes les procédures in vivo utilisées dans cette étude étaient conformes à toutes les directives expérimentales pertinentes pour l’expérimentation animale et la recherche, conformément aux directives brésiliennes d’utilisation des animaux de laboratoire (L11794). Les protocoles utilisés pour la manipulation des embryons de poulet ont tous été approuvés par le Comité d’éthique sur l’utilisation d’animaux dans l’expérimentation scientifique (Centre des sciences de la santé de l’Université fédérale de Rio de Janeiro). L’utilisation de cellules humaines a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital universitaire Clementi....

Results

Identification des ADSC Alu-positifs dans les coupes histologiques
Les séquences Alu sont des éléments répétitifs qui représentent ~10 % du génome humain et sont donc d’excellentes cibles pour identifier les cellules humaines d’une manière spécifique à l’espèce⁴³. L’hybridation in situ avec des sondes d’ADN peut être utilisée pour identifier des éléments génomiques sur des coupes histologiques, y compris des cellules.......

Discussion

Le protocole décrit ici (Figure 1) présente une option réalisable pour le criblage du comportement de populations primaires de cellules humaines in vivo, en utilisant des embryons de poulet comme modèle. Cet article décrit la formation des sphéroïdes cellulaires (Figure 2), la transplantation du sphéroïde dans l’embryon de poussin (Figure 3), le traitement des échantillons et l’hybridation .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Gallus gallus eggs	Granja Tolomei	Sans SPF	Poulet Leghorn blanc
réactifs
Alcian Blue 8GX	Sigma-aldrich	A5268
AluFw primers	Sigma-aldrich	OLIGO	5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3'
Amorces AluRev	Sigma-aldrich OLIGO		5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
Sulfate	d’aluminium Sigma-aldrich	368458	Pour la préparation de solution rouge rapide nucléaire
Anti-Digoxigénine-AP, Fragments Fab	Roche	11093274910	Anticorps ID du registre : AB_514497
Anti-Human Natural Killer 1 anticorps (HNK1, CD57)	Études de développement Hybridoma Bank	3H5	Anticorps ID du registre : AB_2314644
Anti-souris, chèvre IgM-HRP	Santa Cruz Biotechnologie	sc-2973 Anticorps ID	registre : AB_650513
Anti-souris, chèvre IgG (H+L)-HRP	Novex	G-21040	registre : AB_2536527
Anti-Smooth Muscle Actin/ACTA2 Anticorps	Dako	M085129	Anticorps ID du registre : AB_2811108
Aquatex	Merck	1085620050	Agent de montage aqueux
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Sel de p-toluidine (BCIP)	Sigma-aldrich	B8503-100MG
Réactif bloquant	Roche	11096176001
Acide citrique	VETEC	238	Pour la préparation de tampons SSC
Collagénase type IA	Sigma-aldrich	SCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP set	Roche	11969064001
Denhardt solution 50X	Invitrogen	750018	Pour la préparation du tampon d’hybridation
Sulfate de dextran Sel de sodium	Thermo Scientific	15885118	Pour la préparation du tampon d’hybridation
Mélange de marquage de l’ARN DIG Roche		11277073910	Contient Dig-11-dUTP
DMEM à faible teneur en glucose	Sigma-aldrich	D5523
3,3&prime ;-Diaminobenzidine tétrachlorhydrate (DAB)	Sigma-aldrich	D5905-50TAB
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-aldrich	227056	Pour la préparation de solutions NBT et BCIP
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma-aldrich	E6758	Pour la préparation de solutions de trypsine
Entellan new	Merck	107961	Milieu de montage non aqueux
	Ethanol Proquí ; mios	N/A
Sérum fœtal bovin	ThermoFisher	12657029	Inactivé à 56 ° ; C avant l’utilisation
Formaldéhyde 37 % solution	Proquí ; mios	N/A
Formamide	Vetec	V900064
acide acétique glacial	Proquí ; mios	N/A
Encre de Chine	Pelikan	221143
solution de L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030-149
Chlorure de magnésium	Merck	8147330100	Pour la préparation de tampons
Acide maléique	Sigma-aldrich	M0375-500G	Pour la préparation de tampons MAB
	Methanol Proquí ; mios
Sérum de chèvre normal	Sigma-aldrich	NS02L	Inactiver à 56 ° ; C avant utilisation
4-Nitro bleu chlorure de tétrazolium (NBT)	Roche	11585029001
Nucléaire rapide	rouge Sigma-aldrich	60700
Paraplast Plus	Sigma-aldrich	P3558
Pénicilline G sel de sodium	Sigma-aldrich	P3032
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma-aldrich	P3813
Acide phosphomolybdique	Merck	100532
Protéinase K	Gibco BRL	25530-015
ADN de spermatozoïde de saumon	Invitrogen	15632011	Pour la préparation du tampon d’hybridation
Chlorure	de sodium Sigma-aldrich	S9888	Pour la préparation du tampon SSC, MAB et
Sulfate de streptomycine	Sigma-aldrich	S6501
Taq Polymerase kit	Cenbiot Enzimas	N/A
Tris-HCl	Sigma-aldrich	T5941
Trypsin	Sigma-aldrich	T4799
Tween 20	Sigma-aldrich	P1379
Xylene	Proquí ; mios	N/A
Microscope et équipements
Axioplan microscope droit	Carl Zeiss Microscopie	N/A
Logiciel Axiovision	Carl Zeiss Microscopie	N/A
Incubateur de cellules	ThermoForma	3110
Incubateur d’œufs - 50 œufs	GP
Lampe col de cygne	Biocam	N/A	Pour la manipulation des œufs
Fiji logiciel ; Compteur de cellules Plugin	ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Hotte à flux laminaire	TROX	1385
Nanodrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
Microtome rotatif	Leica Biosystems	RM2125 RTS Pour le
sectionnage Stéréomicroscope	Labomed	Luxeo 4D	Pour la manipulation
d’œufsFour de stérilisation	REALIS	7261690	Pour la stérilisation de matériaux chirurgicaux
Consommables
0,2 mL (PCR) Tubes à centrifuger en polypropylène	Eppendorf	30124707
15 mL Tubes à centrifuger coniques en polypropylène	Corning	CLS430791
1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
Tubes à centrifuger en polypropylène de 2 mL	Axygen	MCT-200-C
Tubes à centrifuger coniques en polypropylène de 50 mL	Corning	CLS430829
Barrier (Filter) Tips, 200 &mu ; Taille L	Invitrogen	AM12655	Pour la manipulation des œufs
Bloc de verre excavé (bloc de coloration) avec couvercle Verre	Hecht Karl	42020010
Cassettes d’enrobage	Simport	M480	Utilisé comme support de bloc de paraffine
Lames de couverture en verre, 24 x 40 mm	Kasvi	K5-2440
Pipettes en verre Pasteur 230 mm	NORMAX	5426023	Pour la préparation de capillaires en verre Lames
microtomes	Leica Biosystems	HIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818	Pour la coupe
Parafilm M	Parafilm	P7793
Boîte de Pétri en plastique, 30 mm	Kasvi	K13-0035	Pour la manipulation des œufs
Boîte de Pétri en plastique, 60 mm	Prolab	0303-8	Pour la préparation de sphéroïdes cellulaires. Ne doit pas être traité pour l’adhésion cellulaire.  ;
Lames en verre silanisé (Starfrost)	Knittel	Glass 198	Pour sectionner
Seringue 1 mL , Aiguilles 26 G (0,45 x 13 mm)	Descarpack	32972	Pour la manipulation des ovules (aspiration de l’albumine)
Outils chirurgicauxTube d’aspirateur
	Drummond	2-000-000	Pour la manipulation des oeufs
Ciseaux	de dissectionFine Science Tools	14061-11	Pour la manipulation des œufs
Micropinces (pinces à épiler)	Outils de science fine	00108-11	Pour la manipulation des œufs et la préparation des capillaires en verre
Porte-aiguille (dissection réglable, mandrin d’aiguille)	Fisherbrand	8955	Pour la manipulation des œufs
Pierre à aiguiser à huile, grain 10.000	N/A	/A	Pour affûter les aiguilles
Paire de petites pinceaux	N/A	N/A	Pour la manipulation des sections de paraffine. N’importe quelle marque peut être utilisée.
Aiguilles à coudre	N/A	N/A	Pour l’affûtage en microscalpels. N’importe quelle marque peut être utilisée.
Scalpel stérile jetable n° 23	Swann-Norton	110	Pour le sectionnement
Manche de scalpel chirurgical	Swann-Norton	914	Pour le sectionnement
Ciseaux à iris Wecker, tranchant/tranchant	Surtex	SS-641-11	Pour la manipulation des œufs