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Article de méthode

Un modèle de xénogreffe sans marquage pour étudier le comportement des sphéroïdes de cellules souches humaines dans des embryons de poulet

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DOI :

10.3791/63067

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15 octobre 2021

 , 
1Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode de transplantation et d’identification de sphéroïdes de cellules humaines dans des embryons de poulet. Ce modèle de xénogreffe utilise le microenvironnement embryonnaire comme source de signaux instructifs pour tester la migration, la différenciation et le tropisme cellulaires et est particulièrement adapté à l’étude des populations cellulaires primaires et/ou hétérogènes.

Résumé

Les xénogreffes sont des méthodes précieuses pour étudier le comportement des cellules humaines in vivo. En particulier, l’environnement embryonnaire fournit des indices pour la migration, la différenciation et la morphogenèse cellulaires, avec des signaux instructifs uniques et une identité de couche germinale qui sont souvent absents des modèles de xénogreffes adultes. De plus, les modèles embryonnaires ne peuvent pas discriminer les tissus du soi par rapport aux tissus du non-soi, éliminant ainsi le risque de rejet du greffon et la nécessité d’une immunosuppression de l’hôte. Cet article présente une méthodologie pour la transplantation de sphéroïdes de cellules humaines dans des embryons de poulet, qui sont accessibles, susceptibles d’être manipulés et se développent à 37 °C.

Les sphéroïdes permettent de sélectionner une région spécifique de l’embryon pour la transplantation. Après avoir été greffées, les cellules s’intègrent dans le tissu hôte, ce qui permet le suivi de leur migration, de leur croissance et de leur différenciation. Ce modèle est suffisamment souple pour permettre l’utilisation de différentes populations d’adhérents, y compris des populations de cellules primaires hétérogènes et des cellules cancéreuses. Pour contourner la nécessité d’un marquage cellulaire préalable, un protocole d’identification des cellules donneuses par hybridation de sondes Alu spécifiques à l’homme est également décrit, ce qui est particulièrement important lors de l’étude de populations cellulaires hétérogènes. De plus, les sondes d’ADN peuvent être facilement adaptées pour identifier d’autres espèces donneuses. Ce protocole décrira les méthodes générales de préparation des sphéroïdes, de greffe dans des embryons de poulet, de fixation et de traitement des tissus pour la section de paraffine, et enfin d’identification des cellules humaines à l’aide de l’hybridation in situ de l’ADN. Des contrôles suggérés, des exemples d’interprétation des résultats et divers comportements cellulaires pouvant être dosés seront discutés en plus des limites de cette méthode.

Introduction

Les xénogreffes sont des outils utiles pour étudier le comportement des cellules humaines in vivo. Ces modèles ont fourni des informations précieuses pour un large éventail de sujets scientifiques, tels que la biologie des cellules souches humaines1, l’observation des événements cellulaires en temps réel2 et l’étude de l’angiogenèse tumorale et des métastases3. De plus, plusieurs aspects de la biologie du cancer, y compris la tumorigenèse des xénogreffes spécifiques au patient, ont été étudiés 4,5. Chacun de ces modèles de xénogreffe a ses avantages et ses inconvénients et, par conséquent, chacun est mieux adapté à des questions scientifiques spécifiques. Les embryons de poussin sont un modèle de biologie du développement populaire car il s’agit d’un modèle amniote accessible qui se prête à la manipulation chirurgicale. Les greffes hétérologues ont permis aux chercheurs de créer des cartes précises du destin6 ou d’explorer si un trait est autonome cellulaire ou instruit par l’environnement 7,8. Un raisonnement similaire permet d’utiliser l’embryon de poulet comme modèle de xénogreffe pour étudier le comportement des cellules humaines.

L’environnement embryonnaire orchestre activement la morphogenèse tissulaire avec des signaux de migration et de différenciation, ainsi que des interactions cellule-cellule. Ainsi, par rapport aux modèles de xénogreffes adultes, l’embryon fournit un milieu plus instructif pour tester le comportement des cellules greffées, par exemple, en imitant les signaux présents dans les niches de cellules souches adultes (par exemple, BMP, WNT, NOTCH et SHH9). De plus, l’absence de système immunitaire adaptatif au cours du développement précoce permet de réaliser des xénogreffes sans risque de réponse immunitaire ou de rejet du tissu donneur10. Des études antérieures ont examiné des xénogreffes de cellules humaines dans des embryons de poulet à cette fin. Le potentiel neurogène des cellules souches humaines a été testé après injection dans le tube neural ou les vaisseaux sanguins11 en plus de l’intégration de cellules souches embryonnaires12 et de cellules souches pluripotentes induites13 dans l’embryon. Les cellules de mélanome humain ont également été étudiées à l’aide de l’environnement embryonnaire du poussin, ce qui a révélé des liens entre leur tumorigenèse et le comportement des cellules de la crête neurale14, ainsi que la reprogrammation des cellules tumorales avec les informations de l’embryon15. Cet article décrit un protocole particulièrement adapté à l’étude du comportement des populations cellulaires primaires et hétérogènes humaines.

Au cours des dernières décennies, le composant stromal de divers tissus a été étudié en tant que source autologue de cellules progénitrices/souches et pour ses propriétés proangiogéniques et immunorégulatrices, anciennement connues sous le nom de « cellules souches mésenchymateuses »16,17,18. La première de ces populations cellulaires à être caractérisée a été la population de cellules stromales/souches (BMSC) de la moelle osseuse, qui ont un potentiel ostéo-, adipo- et, dans une moindre mesure, chondrogénique in vivo19,20. Les cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ADSC) sont une population hétérogène obtenue par digestion enzymatique des échantillons de lipoaspiration ou de dermolipectomie, suivie de l’isolement de la fraction stromo-vasculaire (SVF) et enfin de l’expansion en culture21. En culture, ces cellules sont phénotypiquement caractérisées par des marqueurs partagés avec d’autres populations mésenchymateuses, telles que CD90, CD73, CD105 et CD44, des marqueurs uniques tels que CD36 et l’absence de marqueurs hématopoïétiques (CD45) ou endothéliales (CD31)22. De plus, les ADSC ont un potentiel ostéo-, adipogène et chondrogénique in vitro, et le nombre de cellules souches/progénitrices dans cette population peut être défini par le test d’unité formant une colonie de fibroblastoïdes (CFU-F)22. In vivo, l’existence de cellules avec le phénotype ADSC a été signalée dans les compartiments stromaux23 et/ou périvasculaires24. Il devient de plus en plus clair que, malgré le partage de marqueurs après culture in vitro, le compartiment stromal de différents tissus reflète les caractéristiques intrinsèques d’un organe donné, et ces populations cellulaires ont des propriétés distinctes en fonction de leur source 17,25,26,27. De plus, comme ces cellules sont isolées en fonction de leur adhésion à une boîte de culture cellulaire, elles peuvent être composées de cellules provenant de diverses couches germinales28. Ainsi, l’utilisation d’une méthode de xénogreffe pour étudier le potentiel de différenciation et le tropisme des cellules stromales de manière non biaisée peut fournir des informations précieuses sur ces populations cellulaires pour guider le développement de futures thérapies cellulaires.

Le protocole décrit ici (Figure 1) est une méthode de xénogreffe qui tire parti du faible coût et de la facilité de manipulation des embryons de poulet. Il a déjà été utilisé pour étudier le comportement de l’ADSC29 humain, des fibroblastes cutanés29, des cellules stromales dérivées du sang menstruel30 et des cellules de glioblastome31. Cette méthode comprendra la transplantation de cellules sous forme de sphéroïdes32, qui peuvent être préparés à partir de n’importe quelle population de cellules adhérentes (Figure 2). Les interventions chirurgicales et la préparation de matériel chirurgical sur mesure, c’est-à-dire les microscalpels et les capillaires de verre, seront également décrites (figure 3). Les cellules humaines sont détectées dans des coupes histologiques en hybridant des sondes Alu spécifiques à l’homme (Figure 4), éliminant ainsi la nécessité d’un marquage préalable des cellules greffées. Les résultats représentatifs décrivent le comportement de l’ADSC humain greffé à la fois dans la région somitique au niveau du bourgeon de l’aile (Figure 5, Figure 6 et Figure 7) et du premier arc pharyngé (Figure 8), ainsi que des sphéroïdes de glioblastome primaire humain greffés dans le prosencéphale (Figure 8). La migration cellulaire, la différenciation et l’interaction avec les tissus embryonnaires de poulet seront décrites, ainsi que des tests suggérés pour étudier davantage le comportement cellulaire à l’aide de la co-coloration ou de la coloration des sections adjacentes.

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Protocole

Toutes les procédures in vivo utilisées dans cette étude étaient conformes à toutes les directives expérimentales pertinentes pour l’expérimentation animale et la recherche, conformément aux directives brésiliennes d’utilisation des animaux de laboratoire (L11794). Les protocoles utilisés pour la manipulation des embryons de poulet ont tous été approuvés par le Comité d’éthique sur l’utilisation d’animaux dans l’expérimentation scientifique (Centre des sciences de la santé de l’Université fédérale de Rio de Janeiro). L’utilisation de cellules humaines a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital universitaire Clementino Fraga Filho (numéros 043/09 et 088/04). Des œufs spécifiques exempts d’agents pathogènes (FPS) de poulet Leghorn blanc (Gallus gallus) ont été utilisés.

1. Préparation des sphéroïdes cellulaires

REMARQUE : Les sphéroïdes cellulaires peuvent être préparés avec un large éventail de types de cellules tant qu’ils sont adhérents. Pour ce protocole, des cellules stromales dérivées de tissus adipeux humains (ADSC) ont été isolées comme décrit précédemment, 21,27 seront utilisées (Figure 2A). Les cellules ont été obtenues par digestion de fragments de tissu adipeux ou lipoaspiration avec de la collagénase IA pendant 1 h à 37 °C sous agitation, suivie d’un placage à 1−2 × 104 cellules/cm2 et d’une incubation d’une nuit. Les cellules non adhérentes ont été éliminées et les cellules adhérentes ont été élargies sur 3 à 6 passages. Les ADSC étaient homogènes pour l’expression des antigènes de surface CD105, CD90, CD13 et CD44 et négatives pour les antigènes hématopoïétiques CD45, CD14, CD34, CD3 et CD1927. Bien que la méthode décrite ici puisse être mise en œuvre facilement avec un minimum de matériaux au-delà de ce qui est couramment utilisé pour la culture cellulaire, le temps d’agrégation optimal et la nécessité d’une dissociation partielle doivent être déterminés empiriquement. D’autres méthodes de préparation des sphéroïdes cellulaires peuvent être utilisées, telles que la méthode de la goutte suspendue33 ou les puits enrobés d’agarose34 ; Voir la discussion pour plus de détails. Toutes les procédures doivent être effectuées sur un banc propre en utilisant des techniques aseptiques.

  1. Réchauffer le PBS stérile (solution saline tamponnée au phosphate), le milieu de culture et la solution de trypsine à 37 °C avant la manipulation cellulaire.
  2. Culture d’ADSC dans du DMEM à faible teneur en glucose complétée par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Utiliser une fiole confluente de 25 cm2 d’ADSC pour la préparation de deux plaques de sphéroïdes. Jeter le milieu de culture et laver la boîte de culture trois fois avec une quantité appropriée de PBS stérile (5 mL de PBS pour chaque lavage si un ballon de culture de25 cm de 2 cellules est utilisé).
  3. Ajouter suffisamment de solution de trypsine (contenant 0,78 mM d’EDTA) pour couvrir les cellules (1 mL de solution de trypsine si une fiole deculture de 25 cm de 2 cellules est utilisée) et laisser reposer la fiole de culture pendant 5 min à température ambiante.
  4. Pipetez doucement les cellules de haut en bas pour les dissocier. Ajouter la même quantité de milieu de culture contenant du FBS pour inactiver la trypsine et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.
  5. Centrifuger pendant 10 min à 180 × g. Jetez le surnageant et tapotez le tube pour détacher la pastille.
  6. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL-2 mL de milieu de culture adapté au type de cellule (voir l’étape 1.2).
    REMARQUE : La concentration minimale est de 5 × 105 cellules/mL pour les cellules adhérentes telles que les ADSC et les fibroblastes. Une fiole confluente de25 cm 2 d’ADSC doit être remise en suspension dans 2 mL de milieu et placée dans 2 boîtes de Pétri, à l’aide de 1 mL chacune. Les cellules moins adhérentes, telles que les cellules gliales, peuvent bénéficier d’un placage à ~2 × 106 cellules/mL dans un volume plus faible.
  7. Transférez soigneusement la suspension cellulaire sur un côté d’une boîte de Pétri stérile de 60 mm (non enrobée et non traitée, comme celles utilisées pour la préparation des plaques de gélose). Essayez de limiter le milieu de culture à la plus petite surface possible (figure 1B) en posant le plat sur un morceau de gaze propre et plié pour le maintenir incliné dans l’incubateur.
  8. Incuber la suspension cellulaire à 37 °C, 5 % de CO2, jusqu’à formation d’agrégats cellulaires (6 à 8 h après le placage des ADSC).
    REMARQUE : Le temps d’agrégation des sphéroïdes peut varier selon le type de cellule.
  9. Si nécessaire (voir discussion), dissociez partiellement les agrégats de grandes cellules en pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’embouts de 1000 μL. Dissocier les sphéroïdes ADSC 6-8 h après le placage.
  10. Placez la plaque dans l’incubateur jusqu’à ce que les sphéroïdes soient prêts à être transplantés : ronds avec des bords définis et difficiles à disperser (Figure 1C,D).
    REMARQUE : Les sphéroïdes ADSC sont prêts 2 jours après la dissociation partielle.

2. Transplantation de sphéroïdes dans des embryons de poussin

  1. Préparation
    1. Préparez les œufs de poule en incubant 15 à 30 œufs dans un incubateur humide à 37,5 °C jusqu’à ce que le stade de Hamburger-Hamilton (HH) souhaité soit atteint35 : 40 à 45 h pour les greffons dans les somites au niveau des bourgeons des membres (HH11-12 ou 13-19 somites) ou 29 à 33 h pour les greffons dans la région céphalique (HH8-9 ou 5-8 somites). Placez les œufs horizontalement et tracez une ligne avec un crayon sur le dessus des œufs avant l’incubation (figure 3D).
      REMARQUE : Les temps d’incubation peuvent varier légèrement selon les incubateurs individuels. En traçant une ligne, vous vous assurez que la partie supérieure de l’œuf, où se trouve l’embryon, peut être facilement identifiée si l’œuf est tourné avant l’expérience.
    2. Préparez des aiguilles pointues (« microscalpels ») en fixant une aiguille à coudre à un porte-aiguille en métal (figure 3B). À l’aide d’une pierre à aiguiser huilée, aiguisez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle ressemble à un petit scalpel à bord fin (figure 3C). Alternativement, préparez une aiguille de tungstène pointue par électrolyse36.
    3. Préparez des capillaires en verre à l’aide de la flamme d’un bec Bunsen pour faire fondre brièvement la partie mince d’une pipette Pasteur en verre. Retirez la partie fondue des flammes et étirez-la pour former un mince capillaire. Divisez soigneusement le capillaire en deux parties en le cassant à l’aide d’une micropince. Préparez un capillaire mince pour l’injection d’encre de Chine et un capillaire épais pour le transfert des sphéroïdes (Figure 3B).
      REMARQUE : En faisant varier la force de traction, il est possible de créer différents calibres capillaires. Les capillaires doivent être préparés juste avant la chirurgie.
    4. Préparez la surface de travail et les autres matériaux pour la manipulation des œufs (figure 3A). Stérilisez tout le matériel chirurgical dans un four à 100 °C pendant la nuit ou avec de l’éthanol à 70 % immédiatement avant utilisation. PBS stérile chaud à 37 °C. Fixez un embout de 200 μL (avec barrière) à l’ensemble du tube d’aspirateur pour l’injection d’encre de Chine et le transfert de sphéroïdes.
      REMARQUE : Utilisez des pointes avec des barrières lors du transfert de sphéroïdes de cellules humaines.
    5. Juste avant l’expérience, ajoutez 2 gouttes de solution mère d’encre de Chine dans la boîte de Pétri de 30 mm et mélangez-la avec 1 ml de PBS stérile. Retirez la plaque sphéroïde de l’incubateur et placez-la au-dessus d’une glacière pour le reste de l’expérience.
  2. Préparation de chaque œuf
    1. Retirez un œuf de l’incubateur et placez-le sur un porte-œufs. Faites un petit trou dans l’extrémité pointue de l’œuf (figure 2D) et aspirez 1,5 mL d’albumen à l’aide d’une seringue et d’une aiguille. Insérez l’aiguille perpendiculairement à l’œuf pour éviter d’endommager le jaune d’œuf. Scellez le trou à l’aide de ruban adhésif. Si vous le souhaitez, répétez cette étape pour tous les œufs avant l’expérience et réincubez le reste des œufs.
    2. Ouvrez soigneusement une fenêtre sur le dessus de l’œuf à l’aide de ciseaux (figure 3D). À l’aide de la pipette, ajoutez 1 à 2 gouttes de PBS sur le jaune. Si nécessaire, prélevez les grosses bulles d’albumen (comme celles de la figure 3F) à l’aide de la pipette.
    3. Fixez le capillaire mince à l’ensemble du tube de l’aspirateur. Remplissez partiellement le capillaire en verre avec la solution d’encre de Chine par aspiration. Injectez suffisamment d’encre de Chine dans le jaune sous l’embryon jusqu’à ce que les structures embryonnaires soient visibles (Figure 3E,F).
    4. À l’aide du stéréomicroscope, comptez le nombre de somites (Figure 4A). Numérotez individuellement les œufs à l’aide d’un crayon (figure 4B).
  3. Transplantation de sphéroïdes
    1. Identifiez la région du greffon : mésoderme paraxial au niveau du bourgeon alaire (mésoderme présomitique du 15e au 20e somites présomptif37) (Figure 3G et Figure 5A) ou région présumée du premier arc pharyngé (entre l’ectoderme et l’endoderme latéral au mésencéphale postérieur/premier rhombomère38) (Figure 8A).
    2. Coupez la membrane vitelline sur la région cible à l’aide d’un microscalpel.
    3. À l’aide d’une paire de microscalpels, faites une incision peu profonde dans la région où le sphéroïde sera implanté (Figure 3H).
      REMARQUE : Évitez d’endommager l’endoderme sous-jacent ; Sinon, le jaune fuira (si cela se produit, jetez l’œuf).
    4. Retirez le capillaire mince de l’aspirateur et remplacez-le par le capillaire épais. Observez les sphéroïdes au stéréomicroscope et choisissez un sphéroïde à peu près de la même taille que le somite (Figure 2D). Aspirez ce sphéroïde dans le capillaire.
    5. Déposez délicatement le sphéroïde à côté de la zone coupée (Figure 3H). À l’aide des aiguilles pointues, enfoncez le sphéroïde dans la région coupée (Figure 3I,J).
    6. Ajoutez 1 à 2 gouttes de PBS sur l’embryon à l’aide de la pipette pour vous assurer que le sphéroïde est fermement inséré.
      REMARQUE : Si le greffon est délogé, un nouveau sphéroïde doit être transplanté (étapes 2.3.4 et 2.3.5).
    7. Nettoyez toute fuite d’albumine de la coquille de l’œuf à l’aide de papier de soie pour vous assurer que l’œuf peut être complètement scellé, évitant ainsi la contamination. Fermez la fenêtre de l’œuf à l’aide de ruban adhésif.
    8. Notez la région greffée (Figure 4A). Remettez délicatement l’œuf dans l’incubateur humide à 37,5 °C pour éviter de déloger le sphéroïde inséré.
    9. Incuber l’œuf jusqu’à l’étape souhaitée.
      REMARQUE : Lorsque la xénogreffe est réalisée dans des somites au niveau du bourgeon des membres, la migration et la mort cellulaire ont été testées avec succès chez des embryons de 3,5 jours (HH21), et une différenciation cellulaire et un tropisme ont été observés chez des embryons de 6 jours (HH29) (Figure 5A). L’intégration dans les tissus de l’hôte a également été réalisée chez des embryons de 8 jours (HH33). Des cellules de donneurs greffées sur le territoire de l’arc pharyngé ont été étudiées chez des embryons âgés de 4,5 jours (HH25) (Figure 8A).

3. Dissection, fixation, traitement et préparation de coupes histologiques de tissus

  1. Dissection et fixation
    1. Préparez le fixateur (au moins 1 ml/embryon) : éthanol 100 % formaldéhyde 37 % acide acétique glacial dans un rapport de 6:3:1. Nettoyez le plan de travail, une paire de micropinces, des ciseaux chirurgicaux ou des ciseaux à iris et une cuillère à fentes. Remplissez une boîte de Pétri en verre de 60 mm de PBS froid et placez-la sous un stéréomicroscope.
    2. Ouvrez l’œuf en découpant le ruban adhésif.
    3. Coupez les membranes autour de l’embryon et retirez-le à l’aide de la cuillère à fentes.
    4. Transférez l’embryon dans la boîte de Pétri. Si l’embryon est âgé de 5 jours (HH26) ou plus, décapitez-le rapidement avant toute manipulation ex ovo.
    5. Retirez toutes les membranes restantes à l’aide de micropinces et de ciseaux. Agitez doucement l’échantillon dans du PBS pour éliminer les gouttelettes de vitellus restantes.
    6. Si la xénogreffe a été réalisée au niveau de l’aile, jetez la tête. Si des cellules ont été greffées dans la région céphalique, coupez et jetez la moitié inférieure du corps, en veillant à ce que la région cardiaque reste intacte.
    7. Transférez chaque échantillon dans un tube séparé de 2,0 ml contenant 1 ml de fixateur. Identifiez les tubes individuellement comme précédemment (Figure 4B). Incuber toute la nuit à 4 °C en agitant.
    8. Utilisez une pastille de cellules ou de sphéroïdes (figure 4F) comme témoin positif. Pour cela, centrifugez une suspension cellulaire (étape 1.5) ou des sphéroïdes cellulaires (étape 1.10) à 180 × g pendant 10 min dans un tube de 1,5 ml, jetez le milieu de culture et ajoutez 1 ml de fixateur sans déranger la pastille. Incuber le tube pendant une nuit à 4 °C sans agitation, et procéder de la même manière que pour les échantillons de poussins.
  2. Déshydratation et enrobage
    1. Déshydratez les embryons par lavages successifs de 1 mL de 70 %, 80 %, 90 % et 100 % d’éthanol dans 1x PBS pendant au moins 1 h chacun avec agitation.
    2. Incuber les échantillons pendant la nuit dans 1 mL d’éthanol à 100 % à température ambiante avec agitation.
    3. Incuber les échantillons dans 1 mL de xylène à 100 % pendant 1 h dans une hotte. Répétez l’opération deux fois de plus.
    4. Transférez le contenu du tube dans le bloc de coloration et jetez le xylène. Ajoutez suffisamment de paraffine fondue pour couvrir l’embryon et couvrez le bloc de coloration avec son couvercle en verre. Incuber une nuit dans un four à 65 °C.
    5. Préparez une assiette chaude et un moule pour les blocs de paraffine pour l’enrobage.
      REMARQUE : Une paire de trombones étirés est utile pour positionner l’embryon.
    6. Remplissez le moule de paraffine fondue et transférez-y l’embryon. Positionnez l’embryon de manière à obtenir une section transversale du tronc (Figure 5A) ou une section coronale de la tête (Figure 8A).
    7. Insérez une étiquette nominative en papier dans la paraffine, à l’opposé de la surface à sectionner, pour aider à couper l’embryon dans la bonne orientation (Figure 4C).
    8. Le cas échéant, placez la cassette d’enrobage sur l’échantillon. Laissez le bloc refroidir complètement avant de le démouler. Vous pouvez également fixer le bloc de paraffine durci à la cassette ou à un autre support de bloc à l’aide de paraffine fondue et le laisser refroidir à nouveau.
  3. Sectionnement
    1. Préparez les matériaux pour le sectionnement. Réchauffez une plaque chauffante à 42 °C et recouvrez une plaque en carton ou en polystyrène d’une feuille d’aluminium propre d’environ 30 cm x 20 cm. Nettoyez toutes les surfaces avant utilisation.
      REMARQUE : Utilisez des gants pour éviter la contamination par des nucléases, surtout si certaines sections seront utilisées pour l’hybridation in situ de l’ARN. Évitez d’utiliser un bain d’histologie pour étirer les sections de paraffine pour la même raison, à moins que l’eau et les surfaces ne puissent être soigneusement nettoyées au préalable.
    2. Coupez l’excédent de paraffine à l’aide d’une lame de microtome. Créez un biseau des deux côtés, de forme trapézoïdale, pour faciliter la séparation de chaque section à l’aide d’une lame de scalpel lors d’une étape ultérieure (Figure 3A).
    3. Fixez le bloc au microtome. Positionnez le bloc avec précaution pour vous assurer que les côtés gauche et droit sont parallèles l’un à l’autre. Effectuez un réglage plus fin après avoir découpé quelques sections de l’échantillon et les avoir observées au microscope.
    4. Lorsque la région cible a été atteinte (soit le bourgeon des membres, soit le premier arc pharyngé), coupez des sections de 7 μm et placez les rubans de paraffine sur la plaque recouverte de papier d’aluminium. Sectionnez toute la région cible (Figure 4C).
    5. Pour préparer des coupes en série, couvrez le nombre adéquat de verres de lames avec des gouttes d’eau déminéralisée stérile. Transférez les sections individuelles sur les lames de manière séquentielle, à l’aide de pinceaux et d’un scalpel. Transférez des sections adjacentes vers différentes diapositives pour créer des sections en série (Figure 4D). Préparez une série de 3 lames pour les enfants de 3,5 jours, 4 lames pour les enfants de 4,5 jours et 5 lames pour les embryons de 6 jours. Colorez les sections adjacentes avec différentes sondes, anticorps ou colorations histologiques classiques.
      REMARQUE : La même série peut contenir plusieurs lames adjacentes si une grande partie de l’embryon est sectionnée. Plusieurs sections peuvent être transférées sur chaque diapositive, en gardant un certain espace entre les sections pour leur permettre de s’étirer. Ne placez pas encore la diapositive sur la plaque chaude.
    6. Une fois que toutes les sections ont été transférées sur les toboggans, ajoutez plus d’eau jusqu’à ce que toutes les sections flottent au-dessus d’une seule goutte d’eau. Placez la diapositive sur une assiette chaude et laissez les sections s’étirer. Retirez la diapositive de la plaque chaude et retirez l’eau en inclinant soigneusement la vitre de la diapositive contre le papier de soie.
      REMARQUE : Ne laissez pas les sections toucher directement la lame de verre avant qu’elles ne s’étirent.
    7. Laissez sécher les lames pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C.

4. Synthèse de sondes Alu marquées à la digoxigénine par réaction en chaîne par polymérase (PCR)

  1. Préparez une solution mère des amorces spécifiques à l’homme suivantes39 : AluFw : 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' et AluRev : 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. Préparez 50 μL de la réaction PCR40 suivante : 1 tampon PCR, 2,0 mM MgCl2, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dATP, 0,065 mM dTTP, 0,035 mM dig-11-dUTP, 0,4 μM d’amorces AluFw, 0,4 μM d’amorces AluRev, 0,05 U/μL de Taq polymérase et 1 ng/μL d’ADN génomique humain.
  3. Exécutez la PCR à l’aide des paramètres suivants : dénaturation initiale à 94 °C pendant 4 min, suivie de 40 cycles de 94 °C pendant 20 s, 60 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 20 s, suivis d’une dénaturation finale à 72 °C pendant 5 min.
  4. Mesurez la concentration de la sonde à l’aide d’un spectrophotomètre. Stockez les sondes à -20 °C.
    REMARQUE : Le produit PCR doit être de 200-300 pb longtemps après l’électrophorèse dans un gel d’agaroseà 2 % 29.

5. Hybridation in situ en coupe avec sondes Alu

  1. Jour 1 : Perméabilisation et hybridation
    REMARQUE : Un bocal en verre de diapositives stérilisé doit être utilisé pour toutes les étapes effectuées le jour 1.
    1. Préchauffez un lavage de PBT (0,1 % Tween 20 in PBS) dans un bain-marie à 37 °C et préparez une chambre humide avec 50 % de formamide et 50 % d’eau déminéralisée.
      REMARQUE : Calculez le volume de tous les lavages en fonction de la taille du bocal en verre. Sauf indication contraire, tous les lavages sont effectués par immersion des lames dans la solution.
    2. Retirer la paraffine par trois lavages successifs au xylène, 5 min chacun, dans une hotte.
    3. Réhydratez la série par deux lavages à 100 % d’éthanol pendant 5 minutes chacun, suivis de lavages à 90/70/30 % d’éthanol dans du PBS pendant 2 minutes chacun.
    4. Laver au PBT (0,1 % Tween 20 in PBS) trois fois pendant 5 min chacune.
    5. Pour la perméabilisation, ajoutez 2 μg/mL de protéinase K au PBT préchauffé, plongez les lames dans la solution et incuberez-les pendant 14 minutes dans un bain-marie à 37 °C.
    6. Fixer les sections par immersion dans du paraformaldéhyde à 4 %/PBS pendant 20 min à température ambiante.
    7. Laver avec du PBS pendant 5 min.
    8. Après avoir essuyé l’excès de PBS de chaque lame, recouvrez les sections avec 300 μL de tampon d’hybridation (50 % de formamide désionisé, 4x SSC pH 5,0, 1x solution de Denhardt, 5 % de sulfate de dextran, 100 μg/mL d’ADN de spermatozoïde de saumon) (tableau 1). Incuber pendant 1 h à 42 °C dans la chambre en formamide.
    9. Préparez une solution de sonde Alu 0,2 ng/mL dans un tampon d’hybridation. Inclinez la glissière pour retirer le tampon d’hybridation et ajoutez 120 μL de la solution de sonde Alu sur les sections. Couvrir d’une lamelle en verre en prenant soin d’éviter les bulles.
      REMARQUE : Le parafilm ne doit pas être utilisé pour couvrir les lames dans cette étape, car il fondra à des températures supérieures à 70 °C.
    10. Chauffer les lames sur une plaque chauffante à 95 °C pendant 5 min.
      REMARQUE : Ne respirez pas les vapeurs de formamide.
    11. Incuber les lames à 42 °C dans la chambre en formamide pendant la nuit.
  2. Jour 2 : Lavages rigoureux et immunohistochimie
    1. Préparez 20 tampons SSC (3 M de NaCl, 0,3 M de citrate de sodium, pH 7,5) (tableau 1). Préchauffez deux lavages de tampon de citrate de sodium salin (SSC) 0,1x, pH 7,5, à 42 °C.
    2. Remplissez un bocal en verre avec 2 tampons SSC, pH 7,5. Placez délicatement les lames dans la solution et attendez que les lamelles se détachent d’elles-mêmes. Retirez les lamelles à l’aide d’une pince et incubez les lames dans 2 tampons SSC pendant 5 minutes à température ambiante.
    3. Lavez à nouveau les lames avec 2 tampons SSC, pH 7,5, pendant 5 min à température ambiante.
    4. Lavez les lames deux fois avec un tampon SSC 0,1x, pH 7,5, à 42 °C pendant 5 min chacune.
    5. Laver les lames deux fois avec du MABT (tampon d’acide maléique avec Tween ; 0,1 M d’acide maléique, 0,15 M de chlorure de sodium, 0,1 % de Tween 20, pH 7,5) (tableau 1) pendant 30 minutes chacune à température ambiante.
    6. Essuyez l’excès de tampon de chaque lame et couvrez les sections avec 400 μL de solution bloquante (10 % de sérum de chèvre normal inactivé, 2 % de réactif bloquant dans le MABT). Incuber pendant 2 h dans une chambre humide (préparée avec de l’eau déminéralisée) à température ambiante.
    7. Inclinez les lames pour éliminer le liquide et ajoutez 150 μL de fragments Fab anti-DIG conjugués à de la phosphatase alcaline à une dilution de 1:2 000 dans une solution bloquante. Couvrir avec une lamelle en verre ou un parafilm et incuber dans la chambre humide à 4 °C pendant 16 h.
  3. Jour 3 : Développement des couleurs
    1. Retirez délicatement les lamelles ou le parafilm à l’intérieur d’un bocal avec du MABT (comme à l’étape 5.2.2) et incubez les lames dans du MABT pendant 30 minutes à température ambiante.
    2. Laver avec du MABT trois fois de plus pendant 30 minutes chacune.
    3. Laver avec du MAB (tampon d’acide maléique ; 0,1 M d’acide maléique, 0,15 M de chlorure de sodium, pH 7,5) (tableau 1) pendant 30 min.
    4. Laver deux fois avec des (tampon NaCl-Tris-MgCl2 ; 100 mM de Tris-HCl pH 9,5, 100 mM de chlorure de sodium, 50 mM de chlorure de magnésium) (tableau 1) pendant 10 min chacun.
    5. Ajouter la solution de coloration (0,45 μL/mL de chlorure de tétrazolium 4-nitro-bleu, 3,5 μL/mL de 5-bromo-4-chloro-3-phosphate d’indolyle p-toluidine dans les MNT) (tableau 1) dans le bocal de coloration et immerger les lames dans la solution. Couvrez le pot d’une feuille d’aluminium et laissez la couleur se développer pendant la nuit à 37 °C.
  4. Jour 4 : Contre-coloration et montage
    1. Lavez les lames trois fois avec du PBS à température ambiante pendant 10 minutes chacune.
      REMARQUE : Assurez-vous que la solution de coloration est correctement éliminée comme déchet halogène.
    2. Montez les lames telles qu’elles sont en ajoutant des gouttes d’un support de montage aqueux et en recouvrant les sections d’une lamelle en verre. Vous pouvez également procéder à une contre-coloration au rouge nucléaire rapide ou au bleu Alcian.
    3. Essuyez l’excès de PBS et ajoutez 500 μL d’une solution de contre-coloration nucléaire à 0,1 % de rouge nucléaire rapide41 (tableau 1) sur les sections et incubez les lames dans une chambre humide pendant 10 min. Astuce pour enlever l’excès de rouge rapide nucléaire et procéder à la déshydratation (étape 5.4.5).
    4. Immerger les sections dans une solution de bleu d’Alcian à 0,5 % (contre-coloration du cartilage)42 pendant 10 min ; Rincer à l’eau distillée et incuber dans de l’acide phosphomolybdique à 1 % pendant 10 min. Rincez à nouveau à l’eau et procédez à la déshydratation.
      REMARQUE : Si le lavage à l’acide phosphomolybdique est omis, le bleu Alcian devient une contre-coloration nucléaire.
    5. Déshydrater dans de l’éthanol 70/95/100/100 % pendant 5 min chacun.
    6. Laver au xylène trois fois pendant 5 minutes à chaque fois dans une hotte.
    7. Montage avec un support de montage à base de xylène et des lamelles en verre.
    8. Laissez sécher les lames pendant au moins 16 h dans une hotte.

6. Acquisition d’images

  1. Une fois que les lames montées sont complètement sèches, examinez toutes les sections pour détecter la présence de cellules humaines greffées à l’aide d’un microscope à fond clair droit (figure 4E). Recherchez les cellules Alu positives bleu-violet (Figure 4F, G) et marquez les sections contenant des cellules Alu positives à l’aide d’un marqueur (Figure 4E).
    REMARQUE : En marquant les sections avec des cellules positives à l’aluminium, il sera plus facile de les trouver tout en les photographiant et en comparant les lames adjacentes colorées avec d’autres marqueurs.
  2. Prenez soin de photographier les coupes contenant la xénogreffe dans le même ordre que leur placement sur la lame (direction antéro-postérieure). Nommez chaque photo avec tous les renseignements pertinents, tels que [date de la xénogreffe]_[type de cellule]_[âge embryonnaire]_[type de sonde]_[numéro de section]_001. Incluez des fichiers de métadonnées pour ajouter la barre d’échelle plus tard.
  3. Si d’autres lames de la même série sont colorées avec un autre marqueur, par exemple l’hybridation in situ de l’ARN ou l’immunohistochimie, photographiez et nommez les sections adjacentes (figure 6) de la même manière.

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Résultats

Identification des ADSC Alu-positifs dans les coupes histologiques
Les séquences Alu sont des éléments répétitifs qui représentent ~10 % du génome humain et sont donc d’excellentes cibles pour identifier les cellules humaines d’une manière spécifique à l’espèce43. L’hybridation in situ avec des sondes d’ADN peut être utilisée pour identifier des éléments génomiques sur des coupes histologiques, y compris des cellules...

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Discussion

Le protocole décrit ici (Figure 1) présente une option réalisable pour le criblage du comportement de populations primaires de cellules humaines in vivo, en utilisant des embryons de poulet comme modèle. Cet article décrit la formation des sphéroïdes cellulaires (Figure 2), la transplantation du sphéroïde dans l’embryon de poussin (Figure 3), le traitement des échantillons et l’hybridation ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Universidade Federal de Rio de Janeiro (UFRJ pour J.B.), le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq pour J.B.) et la Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ pour J.B.). Nous remercions T. Jaffredo (CNRS, Paris, France) pour la sonde Runx2 (Cbfa1). L’anticorps HNK1 a été obtenu à partir de la Developmental Studies Hybridoma Bank développée sous les auspices du NICHD et maintenue par l’Université de l’Iowa, Département des sciences biologiques, Iowa City, IA 52242 États-Unis. Nous remercions V. Moura-Neto de nous avoir accordé l’accès au microtome et R. Lent de nous avoir accordé l’accès au microscope. Nous remercions E. Steck pour l’aide dans la synthèse des sondes Alu .

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Animals
Gallus gallus eggsGranja TolomeiSans SPFPoulet Leghorn blanc
réactifs
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw primersSigma-aldrichOLIGO5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3'
Amorces AluRevSigma-aldrich OLIGO5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
Sulfated’aluminium Sigma-aldrich368458Pour la préparation de solution rouge rapide nucléaire
Anti-Digoxigénine-AP, Fragments FabRoche11093274910Anticorps ID du registre : AB_514497
Anti-Human Natural Killer 1 anticorps (HNK1, CD57)Études de développement Hybridoma Bank3H5Anticorps ID du registre : AB_2314644
Anti-souris, chèvre IgM-HRPSanta Cruz Biotechnologiesc-2973 Anticorps IDregistre : AB_650513
Anti-souris, chèvre IgG (H+L)-HRPNovexG-21040registre : AB_2536527
Anti-Smooth Muscle Actin/ACTA2 AnticorpsDakoM085129Anticorps ID du registre : AB_2811108
AquatexMerck1085620050Agent de montage aqueux
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Sel de p-toluidine (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Réactif bloquantRoche11096176001
Acide citriqueVETEC238Pour la préparation de tampons SSC
Collagénase type IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP setRoche11969064001
Denhardt solution 50XInvitrogen750018Pour la préparation du tampon d’hybridation
Sulfate de dextran Sel de sodiumThermo Scientific15885118Pour la préparation du tampon d’hybridation
Mélange de marquage de l’ARN DIG Roche11277073910Contient Dig-11-dUTP
DMEM à faible teneur en glucoseSigma-aldrichD5523
3,3&prime ;-Diaminobenzidine tétrachlorhydrate (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimethylformamide (DMF)Sigma-aldrich227056Pour la préparation de solutions NBT et BCIP
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma-aldrichE6758Pour la préparation de solutions de trypsine
Entellan newMerck107961Milieu de montage non aqueux
Ethanol Proquí ; miosN/A
Sérum fœtal bovinThermoFisher12657029Inactivé à 56 ° ; C avant l’utilisation
Formaldéhyde 37 % solutionProquí ; miosN/A
FormamideVetecV900064
acide acétique glacialProquí ; miosN/A
Encre de ChinePelikan221143
solution de L-glutamine (200 mM)Gibco25030-149
Chlorure de magnésiumMerck8147330100Pour la préparation de tampons
Acide maléiqueSigma-aldrichM0375-500GPour la préparation de tampons MAB
Methanol Proquí ; mios
Sérum de chèvre normalSigma-aldrichNS02LInactiver à 56 ° ; C avant utilisation
4-Nitro bleu chlorure de tétrazolium (NBT)Roche11585029001
Nucléaire rapiderouge Sigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Pénicilline G sel de sodiumSigma-aldrichP3032
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-aldrichP3813
Acide phosphomolybdiqueMerck100532
Protéinase KGibco BRL25530-015
ADN de spermatozoïde de saumonInvitrogen15632011Pour la préparation du tampon d’hybridation
Chlorurede sodium Sigma-aldrichS9888Pour la préparation du tampon SSC, MAB et
Sulfate de streptomycineSigma-aldrichS6501
Taq Polymerase kitCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TrypsinSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XyleneProquí ; miosN/A
Microscope et équipements
Axioplan microscope droitCarl Zeiss MicroscopieN/A
Logiciel AxiovisionCarl Zeiss MicroscopieN/A
Incubateur de cellulesThermoForma3110
Incubateur d’œufs - 50 œufsGP
Lampe col de cygneBiocamN/APour la manipulation des œufs
Fiji logiciel ; Compteur de cellules PluginImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Hotte à flux laminaireTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Microtome rotatifLeica BiosystemsRM2125 RTS Pour le
sectionnage StéréomicroscopeLabomedLuxeo 4DPour la manipulation
d’œufsFour de stérilisationREALIS7261690Pour la stérilisation de matériaux chirurgicaux
Consommables
0,2 mL (PCR) Tubes à centrifuger en polypropylèneEppendorf30124707
15 mL Tubes à centrifuger coniques en polypropylèneCorningCLS430791
1,5 mLAxygenMCT-150-C
Tubes à centrifuger en polypropylène de 2 mLAxygenMCT-200-C
Tubes à centrifuger coniques en polypropylène de 50 mLCorningCLS430829
Barrier (Filter) Tips, 200 &mu ; Taille LInvitrogenAM12655Pour la manipulation des œufs
Bloc de verre excavé (bloc de coloration) avec couvercle VerreHecht Karl42020010
Cassettes d’enrobageSimportM480Utilisé comme support de bloc de paraffine
Lames de couverture en verre, 24 x 40 mmKasviK5-2440
Pipettes en verre Pasteur 230 mmNORMAX5426023Pour la préparation de capillaires en verre Lames
microtomesLeica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818Pour la coupe
Parafilm MParafilmP7793
Boîte de Pétri en plastique, 30 mmKasviK13-0035Pour la manipulation des œufs
Boîte de Pétri en plastique, 60 mmProlab0303-8Pour la préparation de sphéroïdes cellulaires. Ne doit pas être traité pour l’adhésion cellulaire.  ;
Lames en verre silanisé (Starfrost)KnittelGlass 198Pour sectionner
Seringue 1 mL , Aiguilles 26 G (0,45 x 13 mm)Descarpack32972Pour la manipulation des ovules (aspiration de l’albumine)
Outils chirurgicauxTube d’aspirateur
Drummond2-000-000Pour la manipulation des oeufs
Ciseauxde dissectionFine Science Tools14061-11Pour la manipulation des œufs
Micropinces (pinces à épiler)Outils de science fine00108-11Pour la manipulation des œufs et la préparation des capillaires en verre
Porte-aiguille (dissection réglable, mandrin d’aiguille)Fisherbrand8955Pour la manipulation des œufs
Pierre à aiguiser à huile, grain 10.000N/A/APour affûter les aiguilles
Paire de petites pinceauxN/AN/APour la manipulation des sections de paraffine. N’importe quelle marque peut être utilisée.
Aiguilles à coudreN/AN/APour l’affûtage en microscalpels. N’importe quelle marque peut être utilisée.
Scalpel stérile jetable n° 23Swann-Norton110Pour le sectionnement
Manche de scalpel chirurgicalSwann-Norton914Pour le sectionnement
Ciseaux à iris Wecker, tranchant/tranchantSurtexSS-641-11Pour la manipulation des œufs
du Anticorps ID du N

Références

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