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Summary

Le présent protocole décrit l’injection intratibia de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins portant des lésions d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires.

Abstract

L’ostéosarcome est le cancer primitif des os le plus fréquent chez les enfants et les adolescents, les poumons étant le site métastatique le plus courant. Le taux de survie à cinq ans des patients atteints d’ostéosarcome présentant des métastases pulmonaires est inférieur à 30%. Par conséquent, l’utilisation de modèles murins imitant le développement de l’ostéosarcome chez l’homme est d’une grande importance pour comprendre le mécanisme fondamental de la cancérogenèse de l’ostéosarcome et des métastases pulmonaires afin de développer de nouvelles thérapies. Ici, des procédures détaillées sont rapportées pour générer les modèles murins primaires d’ostéosarcome et de métastases pulmonaires par injection intratibia de cellules d’ostéosarcome. Combinés au système d’imagerie en direct par bioluminescence ou rayons X, ces modèles murins vivants sont utilisés pour surveiller et quantifier la croissance et les métastases de l’ostéosarcome. Pour établir ce modèle, une matrice de membrane basale contenant des cellules d’ostéosarcome a été chargée dans une seringue à micro-volume et injectée dans un tibia de chaque souris atymique après avoir été anesthésiée. Les souris ont été sacrifiées lorsque l’ostéosarcome primaire a atteint la limite de taille dans le protocole approuvé par l’IACUC. Les jambes porteuses d’ostéosarcome et les poumons présentant des lésions de métastases ont été séparés. Ces modèles se caractérisent par une courte période d’incubation, une croissance rapide, des lésions sévères et une sensibilité dans la surveillance du développement des lésions métastatiques primaires et pulmonaires. Par conséquent, ce sont des modèles idéaux pour explorer les fonctions et les mécanismes de facteurs spécifiques dans la cancérogenèse de l’ostéosarcome et les métastases pulmonaires, le microenvironnement tumoral et évaluer l’efficacité thérapeutique in vivo.

Introduction

L’ostéosarcome est le cancer primitif des os le plus fréquent chez les enfants et les adolescents ^1,2, qui s’infiltre principalement dans les tissus environnants et même métastase dans les poumons lorsque les patients sont diagnostiqués. Les métastases pulmonaires sont le principal défi pour le traitement de l’ostéosarcome, et le taux de survie à cinq ans des patients atteints d’ostéosarcome atteints de métastases pulmonaires reste aussi bas que 20% -30%^3,4,5. Cependant, le taux de survie à cinq ans de l’ostéosarcome primaire a été augmenté à environ 70% depuis les années 1970 en raison de l’introduction de la chimiothérapie⁶. Par conséquent, il est urgent de comprendre le mécanisme fondamental de la cancérogenèse de l’ostéosarcome et des métastases pulmonaires pour développer de nouvelles thérapies. L’application de modèles murins qui imitent le mieux la progression de l’ostéosarcome chez l’homme est d’une grande importance⁷.

Les modèles animaux d’ostéosarcome sont générés par le génie génétique spontané et induit, la transplantation et d’autres techniques. Le modèle d’ostéosarcome spontané est rarement utilisé en raison du long temps de formation de la tumeur, du taux d’occurrence tumorale incohérent, de la faible morbidité et de la faible stabilité ^8,9. Bien que le modèle d’ostéosarcome induit soit plus accessible à obtenir que l’ostéosarcome spontané, l’application du modèle d’ostéosarcome induit est limitée car le facteur inducteur affectera le microenvironnement, la pathogenèse et les caractéristiques pathologiques de l’ostéosarcome¹⁰. Les modèles transgéniques aident à comprendre la pathogenèse des cancers puisqu’ils peuvent mieux simuler les environnements physiologiques et pathologiques humains; cependant, les modèles animaux transgéniques ont également leurs limites en raison de la difficulté, du long terme et du coût élevé de la modification transgénique. De plus, même dans les modèles animaux transgéniques les plus largement acceptés générés par la modification du gène p53 et Rb, seulement 13,6% du sarcome s’est produit dans les quatre os des membres^11,12.

La transplantation est l’une des méthodes de production de modèles de cancer métastatique primaire et distant les plus couramment utilisées ces dernières années en raison de sa manœuvre simple, de son taux de formation de tumeurs stable et de sa meilleure homogénéité¹³. La transplantation comprend la transplantation hétérotopique et la transplantation orthotopique selon les sites de transplantation. Dans la transplantation hétérotopique d’ostéosarcome, les cellules d’ostéosarcome sont injectées à l’extérieur des sites primaires d’ostéosarcome (os) des animaux, généralement sous la peau, par voie sous-cutanée¹⁴. Bien que la transplantation hétérotopique soit simple sans qu’il soit nécessaire d’effectuer une intervention chirurgicale chez les animaux, les sites où les cellules d’ostéosarcome sont injectées ne représentent pas le microenvironnement réel de l’ostéosarcome humain. La transplantation orthotopique d’ostéosarcome se produit lorsque les cellules de l’ostéosarcome sont injectées dans les os des animaux, tels que le tibia^15,16. Par rapport aux greffes hétérotopiques, les greffes d’ostéosarcome orthotopique se caractérisent par une courte période d’incubation, une croissance rapide et une forte nature érosive; par conséquent, ce sont des modèles animaux idéaux pour les études liées à l’ostéosarcome¹⁷.

Les animaux les plus couramment utilisés sont les souris, les chiens et les poissons-zèbres^18,19. Le modèle spontané de l’ostéosarcome est généralement utilisé chez les chiens, car l’ostéosarcome est l’une des tumeurs les plus courantes chez les chiens. Cependant, l’application de ce modèle est limitée en raison du long temps de formation de la tumeur, du faible taux de tumorigenèse, de la faible homogénéité et de la stabilité. Les poissons-zèbres sont souvent utilisés pour construire des modèles tumoraux transgéniques ou knockout en raison de leur reproduction rapide²⁰. Mais les gènes du poisson-zèbre sont différents des gènes humains, de sorte que leurs applications sont limitées.

Ce travail décrit les procédures détaillées, les précautions et les images représentatives pour produire l’ostéosarcome primaire dans le tibia avec métastases pulmonaires par injection intratibia de cellules d’ostéosarcome chez des souris atymiques. Cette méthode a été appliquée pour créer l’ostéosarcome primaire dans le tibia de la souris pour l’évaluation de l’efficacité thérapeutique, qui a montré une reproductibilité élevée^21,22.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité de bien-être animal de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai. Des souris atymiques BALB/c mâles de quatre semaines ont été acclimatées pendant une semaine avant la chirurgie pour l’injection orthotopique de cellules d’ostéosarcome. Les souris ont été logées dans des cages à souris ventilées individuellement avec cinq souris par cage dans un cycle clair/sombre de 12 heures avec un accès ad libitum à l’alimentation SPF et à l’eau stérile. 1. Préparation des cellules Le jour de l’injection de cellules d’ostéosarcome (143B-Luciférase), lavez 80% à 90% des cellules confluentes cultivées dans un plat de culture cellulaire de 10 cm deux fois avec du PBS (pH 7,4) et essayez avec 1,5 mL de trypsine à 0,25% pendant 3 min. Ensuite, ajoutez 6 mL de milieu MEM contenant 10 % de sérum pour éteindre la trypsine et recueillir les cellules dans un tube centrifuge de 15 mL.REMARQUE: La lignée cellulaire 143B-Luciférase est obtenue à partir du transfect de la lignée cellulaire 143B avec le vecteur pLV-luciférase23. Aspirer 20 μL de suspension cellulaire dans la chambre de la plaque de comptage cellulaire et calculer la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatique (voir Tableau des matériaux). Centrifugez les cellules à 800 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre en suspension la pastille de la cellule dans une matrice de membrane basale de 8,5 mg/mL (voir Tableau des matériaux) jusqu’à une concentration finale de 2 x 107 cellules/mL. En gardant les cellules sur la glace, amenez-les à la salle de chirurgie. Les cellules doivent être utilisées dans les 2 h.REMARQUE: Pour éviter des doses d’injection inexactes (par exemple, en raison de l’espace mort dans les seringues), une suspension cellulaire supplémentaire est préparée (généralement deux fois le volume requis de suspension cellulaire). La matrice de la membrane basale est maintenue sur la glace tout le temps car elle a une propriété de coagulation supérieure à la température ambiante24. 2. Chirurgie pour injection orthotopique des cellules d’ostéosarcome REMARQUE : Les outils chirurgicaux sont illustrés à la figure 1. Les souris ont été élevées dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes. Toutes les procédures ont été effectuées dans une armoire aseptique avec des outils stériles. Anesthésier les souris en les exposant à 2% d’isoflurane et 98% d’oxygène (débit d’oxygène, 2 L/min). Appliquez une petite quantité de pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.REMARQUE: Effectuez toute la procédure dans un endroit bien ventilé. Avant l’injection de cellules d’ostéosarcome, assurez-vous que chaque souris est sous anesthésie profonde par un pincement d’orteil; si la souris a encore des réponses, telles que twitch ou jerk, attendez longtemps jusqu’à ce que les réponses ci-dessus disparaissent. Gardez chaque souris en position couchée. Tenez la cheville de la souris à l’aide du pouce et de l’index et désinfectez le site d’injection du tibia avec un écouvillon à 70% d’éthanol.REMARQUE: Pour tenir fermement la cheville de la souris, le bout des doigts du pouce et de l’index est d’une grande importance pour les procédures ultérieures. Faites pivoter l’articulation de la cheville de chaque souris vers l’extérieur pour déplacer le tibia et le péroné, et pliez l’articulation du genou dans une position appropriée jusqu’à ce que le plateau du tibia proximal (le haut du tibia) soit clairement visible à travers la peau (Figure 2A). Fixez l’aiguille à une seringue de 1 mL et pointez la pointe de l’aiguille vers le site d’injection. Assurez-vous que l’aiguille de la seringue est parallèle au long axe du tibia. Insérer par voie percutanée l’aiguille à travers ou à côté du ligament rotulien lorsqu’elle traverse la peau / capsule articulaire; th0en, faire pivoter la seringue (1/2 à 3/4 cercle) pour percer un trou à travers la plate-forme du tibia vers l’extrémité distale du tibia (cavité médullaire) pour l’injection de cellules d’ostéosarcome avec une seringue à micro-volume (Figure 2B, C).REMARQUE: La rotation simultanée du tibia peut être ressentie lors du perçage si la pointe de l’aiguille est précise. Assurez-vous que l’aiguillette avance avec la rotation de la seringue plutôt que d’être directement poussée vers l’avant jusqu’à ce qu’environ la moitié de l’aiguille soit dans le tibia. Vérifiez si l’aiguille de la seringue a fait un mouvement proéminent dans le canal médullaire pour assurer le succès du forage.REMARQUE: Effectuez un examen aux rayons X (voir tableau des matériaux) pour confirmer la position correcte de l’aiguille et recueillir les images. Chargez la suspension de cellules d’ostéosarcome 143B (à partir de l’étape 1.5) dans une seringue à micro-volume et remplacez la seringue de 1 mL dans le tibia par la seringue à micro-volume de 143B chargée de cellules (Figure 2D). Injecter lentement ~10 μL (ignorer la solution préexistante dans l’aiguille) de suspension de cellules 143B dans le tibia de chaque souris athymique (environ 2 x 105 cellules) sans appliquer de pression élevée. Appuyez sur le site d’injection avec un coton-tige pendant 20 à 30 s lorsque la seringue en micro-volume est retirée. Remettez chaque souris dans une cage propre et surveillez de près jusqu’à ce que la souris soit complètement remise de l’anesthésie (environ 10 min). Surveiller la croissance tumorale in vivo à l’aide d’un système d’imagerie par rayons X. Mesurez le diamètre plus long (a) et le diamètre court (b) de la masse cancéreuse chaque semaine avec un étrier pour le calcul du volume tumoral (V): V = 1/2 x a x b2.REMARQUE: Anesthésiez les souris en les exposant à 2% d’isoflurane et à 98% d’oxygène. Les souris ont été anesthésiées pour l’imagerie par rayons X. L’injection intratibia de cellules d’ostéosarcome marquées par des protéines luciférases ou fluorescentes permet de suivre les lésions primaires et métastatiques de l’ostéosarcome.REMARQUE: Les critères d’évaluation sans cruauté des souris atteintes d’ostéosarcome dû à la croissance tumorale du genou et des métastases pulmonaires étaient basés sur les critères suivants: (1) score d’état corporel, (2) seuil de perte de poids de 20%, (3) diamètre maximal moyen des tumeurs de 2 cm ou (4) comportement animal sévèrement limité. 3. Examen pathologique (prélèvement d’un échantillon d’ostéosarcome métastatique primaire et pulmonaire pour analyse) Six semaines après l’injection de cellules d’ostéosarcome, sacrifier les souris par luxation cervicale après les avoir exposées à l’inhalation de CO2 . Gardez la souris en position couchée et étirez les deux membres postérieurs. Séparez toutes les jambes porteuses d’ostéosarcome de la région inguinale.REMARQUE: Assurez-vous que toutes les jambes sont séparées du même site anatomique. Préparer l’échantillon histologique de jambes porteuses d’ostéosarcome en enlevant la peau, les muscles et les pieds, puis fixer l’échantillon de chaque souris dans un tube de 50 mL avec une solution de formol de 20 mL (10%) pendant 24 h, suivie d’une décalcification dans une solution d’EDTA à 10% pendant 14 jours avec un changement occasionnel de tampon. Incorporer l’échantillon dans de la paraffine et préparer des sections pour l’examen histologique à la suite de travaux publiés précédemment25. Séparez doucement les poumons et mettez-les dans un tube de 50 mL rempli de 20 mL de solution de formol (10%). Après 24 h, transférer les poumons de chaque souris dans un tube de 15 mL contenant de l’éthanol à 70 %. Incorporer les poumons dans la paraffine pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) et le test d’immunohistochimie25.

Representative Results

Le succès de l’ostéosarcome orthotopique (primaire) et des modèles pulmonaires métastatiques dépend de l’injection orthotopique précise de cellules d’ostéosarcome. Ici, un modèle d’ostéosarcome orthotopique (primaire) par injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome a été développé avec succès. La figure 3A montre une souris représentative porteuse d’ostéosarcome orthotopique (primaire), et la figure 3B montre un ostéo…

Discussion

L’injection orthotopique de cellules d’ostéosarcome est un modèle idéal pour étudier la fonction et le mécanisme de facteurs spécifiques dans la cancérogenèse et le développement de l’ostéosarcome afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Pour éviter les différences dans la croissance tumorale, la plupart des cellules actives d’ostéosarcome à 80% -90% confluent avec le même nombre sont soigneusement injectées dans le tibia de chaque souris, et le temps de trypsinisation cellulaire est stri…

Materials

Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	/	animal
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Bioluminescence imaging system	Shanghai Baitai Technology Co., Ltd	Vieworks	tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	 430790, Corning	Centrifuge the cells
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
MEM media	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Cell culture medium
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
1ml syringes	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	20200411	drilling
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells
Trypan blue	Beyotime Biotechnology	ST798	Staining cells to assess activity
vector (pLV-luciferase)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	VL3613	Plasmid
Lipofectamine 2000	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	11668027,Thermo fisher	Plasmid transfection reagent
X-ray imaging system	Brook (Beijing) Technology Co., Ltd	FX PRO	X-ray images were obtained to detect tumor growth