Article de méthode

Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral

DOI :

10.3791/63077

⸱

25 février 2022

 , 
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude des propriétés physiologiques de synapses spécifiques dans le cerveau et de la façon dont elles subissent des changements plastiques est un défi clé dans les neurosciences modernes. Les techniques électrophysiologiques in vitro traditionnelles utilisent la stimulation électrique pour évoquer la transmission synaptique. Un inconvénient majeur de cette méthode est sa nature non spécifique; Tous les axones de la région de l’électrode stimulante seront activés, ce qui rendra difficile l’attribution d’un effet à une connexion afférente particulière. Ce problème peut être surmonté en remplaçant la stimulation électrique par une stimulation optogénétique. Nous décrivons une méthode pour combiner l’optogénétique avec des enregistrements in vitro patch-clamp. Il s’agit d’un outil puissant pour l’étude de la transmission synaptique basale et de la plasticité synaptique des connexions synaptiques anatomiquement définies avec précision et est applicable à presque toutes les voies du cerveau. Ici, nous décrivons la préparation et la manipulation d’un vecteur viral codant pour la protéine channelrhodopsine pour injection chirurgicale dans une région d’intérêt pré-synaptique (cortex préfrontal médial) dans le cerveau des rongeurs et la fabrication de tranches aiguës de régions cibles en aval (cortex entorhinal latéral). Une procédure détaillée pour combiner des enregistrements patch-clamp avec l’activation synaptique par stimulation lumineuse pour étudier la plasticité synaptique à court et à long terme est également présentée. Nous discutons d’exemples d’expériences qui atteignent la spécificité de la voie et de la cellule en combinant l’optogénétique et le marquage cellulaire Cre-dépendant. Enfin, la confirmation histologique de la région d’intérêt pré-synaptique est décrite avec le marquage biocytine de la cellule post-synaptique, afin de permettre une identification plus approfondie de l’emplacement précis et du type de cellule.

Introduction

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Comprendre la physiologie des synapses et comment elles subissent des changements plastiques est fondamental pour comprendre comment les réseaux cérébraux fonctionnent dans le cerveau sain1, et comment ils fonctionnent mal dans les troubles cérébraux. L’utilisation de tranches cérébrales ex vivo aiguës permet d’enregistrer l’activité électrique des synapses à partir de neurones individuels avec un rapport signal sur bruit élevé à l’aide d’enregistrements patch-clamp à cellules entières. Le contrôle du potentiel membranaire et la manipulation pharmacologique directe permettent d’isoler les sous-types de récepteurs. Ces enregistrements p....

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Protocole

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Toutes les procédures sur les animaux ont été menées conformément à la loi britannique sur les procédures scientifiques relatives aux animaux (1986) et aux directives connexes ainsi qu’aux directives institutionnelles locales.

1. Injection virale stéréotaxique

REMARQUE: Le protocole actuel exige une spécificité anatomique, mais pas de type de cellule post-synaptique.

  1. Choisissez l’animal approprié. Des rats à capuchon Lister mâles de type sauvage ont été utilisés dans ce protocole (300-350 g, âgés d’environ 3 mois).
  2. Choisissez la construction virale appropriée. Il y a plusieurs....

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Résultats

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Dans ce protocole, nous décrivons comment étudier la physiologie synaptique et la plasticité à long terme en utilisant l’administration virale de constructions optogénétiques. Le protocole peut être très facilement adapté à l’étude de presque toutes les connexions à longue distance dans le cerveau. À titre d’exemple, nous décrivons l’injection d’AAV codant pour une opsine dans le mPFC du rat, la préparation de tranches aiguës à partir de LEC, les enregistrements patch-clamp à partir de neurones pyramidaux LEC de couche 5.......

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Discussion

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Le protocole présenté ici décrit une méthode pour explorer des projections synaptiques à longue distance très spécifiques en utilisant une combinaison de chirurgie stéréotaxique pour délivrer des AAV codant pour des constructions optogénétiques et d’électrophysiologie dans des coupes cérébrales aiguës (Figure 1). Ensemble, ces techniques offrent des outils pour caractériser la physiologie et la plasticité des circuits cérébraux avec une grande précision dans des voies à longue portée et anat.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail est soutenu par la subvention Wellcome 206401/Z/17/Z. Nous tenons à remercier Zafar Bashir pour son mentorat expert et le Dr Clair Booth pour son assistance technique et ses commentaires sur le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 0,2 mLFisher Scientific Ltd12134102
10 & micro ; Pipette LGilsonFD10001
24 puitsplaque SARSTEDT83.3922
Valve Luer 3 voiesCole-ParmerWZ-30600-02
Substrat 3,3&prime ;-Diaminobenzidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-4105
Objectif 40xOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopyridineHello BioHB1073
Objectif 4xOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Titre viral : 3.3x1013
Lentille achromatiqueEdmund Optics49363Focalise le spectre visuel et le proche infrarouge
Microcentrifugeuse de paillasseBenchmark ScientificC1005*
BiocytineSigma-AldrichB4261
Capillaire en verre borosilliquéWarner InstrumentsG150F-6
BurrOutils scientifiques fins19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Caméra - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Gommage chirurgical à la chlorhexidineVetaseptXHG008
ClippersAndis22445AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation lentille de condenseurThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Colle cyanoacrylateRapid Electronics Ltd84-4557
Dispositif d’acquisition de donnéesNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glucoseSigma-AldrichG8270
Miroir dichroïque 500 nm passe-longEdmund Optics69899
Miroir dichroïque 600 nm passe-longEdmund Optics69901
Miroir dichroïque cubeThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore324626
Porte-électrode avec port latéralHEKA895150
Filtre d’émissionChroma59022m
Filtre d’excitationChromaET570/20x
Gel pour les yeuxDechraLubrithal
Pinceau finFournitures de laboratoire scientifiqueBRU2052
GuillotineWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Solution de peroxyde d’hydrogèneSigma-AldrichH100930 % (p/p)
IsofluraneHenry Schein988-3245
IsopentaneSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-gluconateSigma-AldrichG4500
Cube de filtre de fluorescence cinématiqueThorLabsDFM1T1
Pilote de LEDThorLabsLEDD1B
Pommade à la lidocaïneTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro-perceuseHarvard Apparatus75-1887
Extracteur de microélectrodesSutter instrumentsP-87
Seringue de micro-injectionHamilton7634-01/00
Aiguille de seringue de micro-injectionHamilton7803-05Spécification personnalisée : jauge 33, longueur 15mm, style de pointe 4 - 12° ;
Pousse-seringue de micro-injectionWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
Monté bleu LEDThorLabsM470L5
Monté vert LEDThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550Utilisé pour l’imagerie IR réfractée de tranches, l’optique à contraste interférentiel différentiel (DIC) est une autre méthode couramment utilisée
OCT moyenVWR InternationalRAYLLAMB/OCTTempérature de coupe optimale milieu
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148
Amplificateur de pince de patchDispositifs moléculaires700A
Pompe péristaltiqueWorld Precision InstrumentsMinistar
Lames de microscope recouvertes de poly-L-lysineFisher Scientific Ltd23-769-310
Chambre d’enregistrementWarner InstrumentsRC-26G
Lame de scalpelSwann Morton#24
Ancre à trancheWarner InstrumentsSHD-26-GH/15
Cadre stéréotaxiqueKopfModèle 902
Support stéréotaxique pour micro-foretHarvard Apparatus75-1874
SucroseSigma-AldrichS0389
Microscope chirurgicalCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
Filtre à seringue pour enregistrement intracellulaire solutionThermo Scientific Nalgene171-0020
Citrate de tétrodotoxineHello BioHB1035
Pipettes de transfertFisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Microscope à fluorescence droitLeicaDM6 B
VECTASHIELD Milieu de montage anti-effraction avec DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
VECTASTAIN Kit ABC-HRP VectorLaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/Version 2.32Logiciel d’acquisition de données
Solution
aCSF
de coupe de saccharose
PFA
intracellulaire ?
solution

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nico....

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Mots-clés

Stimulation optog n tiqueenregistrement en patch clampplasticit synaptiqueinjection viralecoupes c r brales aigu sexpression de la channelrhodopsinemarquage la biocytine

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