Method Article

Analyse cytométrique en flux de paramètres mitochondriaux multiples dans des cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leurs dérivés neuronaux et gliaux

DOI:

10.3791/63116

⸱

November 8th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude rapporte une nouvelle approche pour mesurer plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux basés sur la cytométrie en flux et la double coloration avec deux rapporteurs fluorescents ou anticorps pour détecter les changements dans le volume mitochondrial, le potentiel de membrane mitochondriale, le niveau d’espèces réactives de l’oxygène, la composition de la chaîne respiratoire mitochondriale et l’ADN mitochondrial.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les mitochondries sont importantes dans la physiopathologie de nombreuses maladies neurodégénératives. Les changements dans le volume mitochondrial, le potentiel de membrane mitochondriale (MMP), la production mitochondriale d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et le nombre de copies d’ADN mitochondrial (ADNmt) sont souvent des caractéristiques de ces processus. Ce rapport détaille une nouvelle approche basée sur la cytométrie en flux pour mesurer plusieurs paramètres mitochondriaux dans différents types de cellules, y compris les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) et les cellules neurales et gliales dérivées des CSPi. Cette stratégie basée sur le flux utilise des cellules vivantes pour mesurer le volume mitochondrial, les niveaux de MMP et de ROS, ainsi que des cellules fixes pour estimer les composants de la chaîne respiratoire mitochondriale (MRC) et les protéines associées à l’ADNmt telles que le facteur de transcription mitochondrial A (TFAM).

En cocolorant avec des rapporteurs fluorescents, y compris MitoTracker Green (MTG), l’ester éthylique de tétraméthylrhodamine (TMRE) et MitoSox Red, les changements dans le volume mitochondrial, la MMP et les ROS mitochondriaux peuvent être quantifiés et liés au contenu mitochondrial. La double coloration avec des anticorps contre les sous-unités complexes MRC et la translocase de la membrane mitochondriale externe 20 (TOMM20) permet d’évaluer l’expression de la sous-unité MRC. Comme la quantité de TFAM est proportionnelle au nombre de copies d’ADNmt, la mesure de TFAM par TOMM20 donne une mesure indirecte de l’ADNmt par volume mitochondrial. L’ensemble du protocole peut être effectué en 2-3 heures. Il est important de noter que ces protocoles permettent la mesure des paramètres mitochondriaux, à la fois au niveau total et au niveau spécifique par volume mitochondrial, en utilisant la cytométrie en flux.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les mitochondries sont des organites essentiels présents dans presque toutes les cellules eucaryotes. Les mitochondries sont responsables de l’approvisionnement en énergie en produisant de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative et agissent comme intermédiaires métaboliques pour la biosynthèse et le métabolisme. Les mitochondries sont profondément impliquées dans de nombreux autres processus cellulaires importants, tels que la génération de ROS, la mort cellulaire et la régulation intracellulaire du Ca2+. Le dysfonctionnement mitochondrial a été associé à diverses maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson (MP), la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Huntington (MH), l’ataxie de Friedreich (FRDA) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)1. On pense également que l’augmentation du dysfonctionnement mitochondrial et l’anomalie de l’ADNmt contribuent au vieillissement humain 2,3.

Divers types de dysfonctionnement mitochondrial se produisent dans les maladies neurodégénératives, et les changements dans le volume mitochondrial, la dépolarisation MMP, la production de ROS et les altérations du nombre de copies d’ADNmt sont courants 4,5,6,7. Par conséquent, la capacité de mesurer ces fonctions et d’autres fonctions mitochondriales est d’une grande importance lors de l’étude des mécanismes de la maladie et du test d’agents thérapeutiques potentiels. De plus, compte tenu du manque de modèles animaux qui reproduisent fidèlement les maladies neurodégénératives humaines, l’établissement de systèmes modèles in vitro appropriés qui récapitulent la maladie humaine dans les cellules cérébrales est une étape importante vers une meilleure compréhension de ces maladies et le développement de nouvelles thérapies 2,3,8,9.

Les CSPi humaines peuvent être utilisées pour générer diverses cellules cérébrales, y compris des cellules neuronales et non neuronales (c.-à-d. cellules gliales), et des dommages mitochondriaux associés à une maladie neurodégénérative ont été trouvés dans les deux types de cellules 3,10,11,12,13. Des méthodes appropriées pour la différenciation des CSPi en lignées neuronales et gliales sont disponibles14,15,16. Ces cellules fournissent une plate-forme humaine / patient unique pour la modélisation in vitro des maladies et le dépistage de médicaments. De plus, comme ils sont dérivés de patients, les neurones dérivés de l’iPSC et les cellules gliales fournissent des modèles de maladie qui reflètent plus précisément ce qui se passe chez l’homme.

À ce jour, peu de méthodes pratiques et fiables pour mesurer plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux dans les CSPi, en particulier les neurones vivants et les cellules gliales, sont disponibles. L’utilisation de la cytométrie en flux fournit au scientifique un outil puissant pour mesurer les paramètres biologiques, y compris la fonction mitochondriale, dans des cellules individuelles. Ce protocole fournit des détails sur la génération de différents types de cellules cérébrales, y compris les cellules souches neurales (CSN), les neurones et les astrocytes gliaux à partir de CSPi, ainsi que de nouvelles approches basées sur la cytométrie en flux pour mesurer plusieurs paramètres mitochondriaux dans différents types de cellules, y compris les CSPi et les cellules neurales et gliales dérivées des CSPi. Le protocole fournit également une stratégie de co-coloration pour l’utilisation de la cytométrie en flux pour mesurer le volume mitochondrial, le MMP, le niveau de ROS mitochondrial, les complexes MRC et TFAM. En incorporant des mesures de volume ou de masse mitochondriale, ces protocoles permettent également de mesurer à la fois le niveau total et le niveau spécifique par unité mitochondriale.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux et le tableau supplémentaire S1 pour les recettes de tous les milieux et solutions utilisés dans ce protocole.

1. Différenciation des CSPi humaines en NCS, neurones dopaminergiques (DA) et astrocytes

  1. Préparer des plaques revêtues de matrice.
    1. Décongeler un flacon de 5 mL de matrice sur de la glace pendant la nuit. Diluer 1 mL de matrice avec 99 mL de froid Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 (Advanced DMEM/F12) (concentration finale de 1 %). Fabriquer des aliquotes de 1 mL et les conserver à -20 °C.
    2. Décongeler la solution matricielle à 4 °C (la garder froide) et enduire 6 puits (1 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
    3. Placer la plaque revêtue de matrice dans un incubateur à air humidifié à 5 % de CO2/95 % à 37 °C pendant 1 h. Sortez la plaque de l’incubateur et laissez-la s’équilibrer à température ambiante (RT).
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la plaque dans les 3 jours suivant le revêtement. Cependant, la plaque revêtue peut être conservée jusqu’à 2 semaines à 4 °C. N’oubliez pas de le retirer et de le laisser se réchauffer à RT avant utilisation. Pour un stockage prolongé, ajouter 1 mL de milieu de culture iPSC à la plaque revêtue pour éviter le dessèchement de la matrice.
  2. Décongélation des CSPi
    1. Préchauffer les plaques revêtues de matrice à la RT ou dans l’incubateur à 37 °C pendant 20-30 min. Préchauffer la quantité requise de milieu de culture iPSC à RT.
    2. Mélanger 6 mL de milieu de culture iPSC préchauffé avec 12 μL d’inhibiteur de ROCK Y-27632 pour obtenir une concentration finale de 10 μM.
    3. Décongeler partiellement le flacon congelé de CSPi à 37 °C au bain-marie jusqu’à ce qu’il reste un petit morceau de glace.
    4. Ajouter lentement 1 mL de milieu de culture iPSC préchauffé avec 12 μL d’inhibiteur ROCK goutte à goutte aux cellules. Transférer goutte à goutte le contenu liquide du flacon contenant des CSPi dans un puits d’une plaque précouverte de 6 puits à l’aide d’une pipette de 5 mL.
    5. Déplacez la plaque dans des directions perpendiculaires pour mélanger le contenu du puits et retourner la plaque dans l’incubateur. Changez le milieu de culture iPSC après 24 heures après le lavage avec la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco (1x) (Ca 2+/Mg2+-libre) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
      REMARQUE: N’ajoutez pas d’inhibiteur de ROCK aux tétées suivantes. Changez le milieu de culture iPSC tous les jours.
  3. Sous-culture des CSPi
    1. Préchauffer les plaques revêtues de matrice à la RT ou dans l’incubateur à 37 °C pendant 20-30 min. Préchauffer la quantité requise de milieu de culture iPSC à RT.
    2. Aspirer le milieu de culture des plaques contenant les cellules. Rincer les CSPi avec du DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL par puits dans une plaque à 6 puits).
    3. Ajouter de l’EDTA (0,5 mM) (1 mL par puits dans une plaque de 6 puits). Incuber les plaques à 37 °C jusqu’à ce que les bords des colonies commencent à se soulever du puits (généralement 3-5 min). Aspirer l’EDTA.
    4. Ajouter le milieu de culture iPSC préchauffé (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et détacher de force les colonies de CSPi à l’aide d’une pipette stérile de 10 mL une fois. Ne pipette pas de haut en bas, car cela pourrait briser les amas de cellules en cellules individuelles.
    5. Transférer le contenu de chaque puits dans deux puits individuels dans une plaque à 6 puits revêtue d’une matrice (2 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et incuber à 37 °C. Ne générez pas de bulles dans la suspension pendant le pipetage.
      REMARQUE: Secouez doucement la plaque avant de la conserver dans l’incubateur. Le rapport de division peut être de 1:2 (un puits dans 2 nouveaux puits) à 1:4 (un puits dans 4 nouveaux puits).
    6. Remplacez le milieu quotidiennement jusqu’à ce que les colonies atteignent 60% de confluence avec une bonne taille et des connexions.
  4. Induction neuronale et génération de progéniteurs neuronaux
    1. Préparer 500 mL de milieu chimiquement défini (CDM), 500 mL de milieu d’induction neurale (NIM) et 500 mL de milieu sans sérum de cellules souches neurales (NSC SF).
    2. Rincer les cellules avec DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et ajouter NIM (3 mL par puits dans une plaque de 6 puits). Configuré en tant que Jour 0.
    3. Remplacez le NIM (3 mL par puits dans une plaque à 6 puits) le jour 1, le jour 3 et le jour 4 et observez quotidiennement sous la microscopie.
    4. Le jour 5, détachez les rosettes neurales dans une culture de suspension comme décrit ci-dessous.
      1. Laver une fois doucement avec DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL par puits dans une assiette à 6 puits). Ajouter la collagénase IV (1 mL par puits dans une assiette de 6 puits) et conserver dans un incubateur pendant 1 min. Aspirer la collagénase IV et laver une fois avec DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) doucement.
      2. Ajouter 2 mL de NSC SF Medium par puits à une plaque de 6 puits. Détacher les cellules en grattant le fond des puits en dessinant des grilles à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
      3. Recueillir la suspension cellulaire de la plaque à 6 puits dans une capsule non adhérente de 10 cm. Porter le volume à 12 ml avec NSC SF Medium.
      4. Secouez la capsule non adhérente à 65-85 tr / min sur un agitateur orbital dans un incubateur pour éviter l’agrégation.
  5. Différenciation des neurones DA
    1. Le jour 7, ajouter 12 mL de MDP additionnés de facteur de croissance des fibroblastes-8b (FGF-8b) de 100 ng/mL et placer la capsule sur l’agitateur orbital dans l’incubateur.
    2. Les jours 8-13, changez le milieu tous les 2 jours et observez sous la microscopie quotidiennement.
    3. Au jour 14, ajouter 12 mL de MDP additionnés de 100 ng/mL de FGF-8b et de 1 μM de purmorphamine (PM). Placez le plat sur le shaker orbital dans l’incubateur.
    4. Les jours 15 à 20, changez le milieu tous les 2 jours et observez quotidiennement les cellules sous la microscopie.
    5. Passez mécaniquement les sphères en utilisant des pointes de 1000 μL pour briser les sphères plus grandes.
      NOTE: Le rapport peut être de 1: 2 (un plat dans 2 nouveaux plats).
  6. Fin de la différenciation
    1. Enduisez une plaque à 6 puits ou des lamelles de couverture avec de la poly-L-ornithine (PLO) et de la laminine comme décrit ci-dessous.
      1. Enduire une plaque de 6 puits de 1 mL de PLO par puits et incuber la plaque à 37 °C pendant 20 min. Aspirez la solution de l’OLP.
      2. Stériliser la plaque sous UV pendant 20 min. Rincer les puits deux fois avec DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
      3. Ajouter 5 μg/mL de solution de laminine (1 mL par puits dans une plaque de 6 puits) au puits et incuber à 37 °C pendant 2 h. Aspirer la laminine et laver brièvement les puits avec DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) une fois avant le placage.
    2. Recueillir toutes les sphères (à partir de l’étape 1.5.5) dans des tubes de 50 ml et compléter avec DPBS (1x). Faire tourner à 300 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
    3. Incuber avec 2 mL de réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 °C au bain-marie suivi d’une trituration douce avec une pipette de 200 μL (20-50 fois selon la taille des sphères, en évitant la formation de bulles).
    4. Neutraliser le réactif de dissociation cellulaire avec 2 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et centrifuger le tube conique de 50 mL contenant les cellules à 300 × g pendant 5 min à TA. Aspirer le surnageant.
    5. Ajouter 1 mL de MDP complété par 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF) pour remettre les granulés cellulaires en pipetant doucement de haut en bas pour obtenir des suspensions unicellulaires.
    6. Aspirer la solution de laminine de la plaque (étape 1.6.1.3), laver brièvement avec du DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque à 6 puits) et ensemencer les cellules (à partir de l’étape 1.6.5) dans les plaques préenduites ou les lamelles de recouvrement dans 3 mL de MDP complétées par 10 ng/mL de BDNF et 10 ng/mL de GDNF. Nourrissez les cellules tous les 4 jours.
      REMARQUE: Les cultures différenciantes peuvent être maintenues pendant plusieurs semaines jusqu’à 3 mois. La morphologie neuronale apparaît généralement après 2 semaines d’arrêt et peut être utilisée pour des analyses en aval à partir de ce point. Le BDNF et le GDNF ne sont pas nécessaires pour la culture pour un entretien plus long (jusqu’à 2 mois).
  7. Génération NSC
    1. Plaques matricielles d’enduit.
    2. Recueillir toutes les sphères neurales (générées à partir de l’étape 1.4) dans des tubes de 50 mL et compléter avec DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free). Faire tourner à 300 × g pendant 5 min. Aspirer les surnageants.
    3. Incuber les pastilles avec 2 mL de réactif de dissociation cellulaire pendant 10 min à 37 °C au bain-marie, puis procéder à une trituration douce avec une pipette de 200 μL (20 à 50 fois selon la taille des sphères, en évitant la formation de bulles).
    4. Neutraliser avec 2 mL de DMEM avec 10% FBS et centrifuger les tubes coniques de 50 mL contenant les cellules à 300 × g pendant 5 min à TA. Aspirer les surnageants. Remettez en suspension les granulés de cellule en pipetant doucement de haut en bas pour obtenir des suspensions unicellulaires.
    5. Aspirer la solution matricielle d’une plaque prérevêtue et ensemencer les cellules dans les plaques prérevêtues dans NSC SF Medium (3 mL par puits dans une plaque à 6 puits). Nourrissez les cellules tous les 2-3 jours et divisez les cellules lorsqu’elles sont confluentes.
      REMARQUE : À partir de ce stade, les CSN peuvent être étendus et gelés.
  8. Différenciation des astrocytes gliaux
    1. Différenciation des astrocytes par rapport aux CSN
      1. Préparer 500 ml de milieu de différenciation des astrocytes.
      2. Semer des NSC sur des plaques/lamelles revêtues de poly-D-lysine (PDL) avec NSC SF Medium.
      3. Le lendemain, rincer les cellules avec du DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-libre) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et ajouter un milieu de différenciation astrocytaire (3 mL par puits dans une plaque de 6 puits). Configuré en tant que Jour 0.
      4. Observez quotidiennement les CSN au microscope et remplacez le milieu de différenciation des astrocytes (3 mL par puits dans une plaque à 6 puits) tous les 2 jours du Jour 1 au Jour 27.
    2. Maturation des astrocytes
      1. Préparer le milieu de maturation des astrocytes.
      2. Le jour 28, rincer les cellules avec du DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et ajouter le milieu de maturation des astrocytes (3 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
      3. À partir du jour 29, observez quotidiennement les cellules au microscope et remplacez le milieu de maturation des astrocytes (3 mL par puits dans une plaque à 6 puits) tous les 2 jours.
      4. Après un mois de maturation, dilatez les cellules et cryopréservez-les à partir de ce stade.
        REMARQUE: Au cours de cette phase, le nombre de cellules augmentera. Lors de la division des cellules, les lamelles de couverture enduites de PDL ne sont pas nécessaires pour la culture.

2. Caractérisation cellulaire par immunocytochimie et coloration par immunofluorescence

  1. À la fin de la période de culture, transférer les lames de couverture avec les cellules dans une plaque de 12 puits.
    Rincer les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (1x) deux fois et incuber pendant 10 minutes dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (0,5 mL par puits dans une plaque de 12 puits) à TA.
    REMARQUE : L’échantillon fixe peut être recouvert de 2 mL de PBS (1x) et conservé à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour l’immunomarquage. Le PFA est toxique et est soupçonné de causer le cancer. Prévenez l’exposition de la peau et des yeux et travaillez sous une hotte chimique.
  2. Bloquer et perméabiliser les cellules et incuber avec un tampon de blocage contenant du PBS (1x), 0,3% de Triton X-100 et 10% de sérum de chèvre normal pendant 1 h à TA.
  3. Incuber avec des anticorps primaires dans le tampon de blocage pendant la nuit à 4 °C: coloration des CSPi avec facteur de transcription anti-octamère 4 (Oct4) et antigène embryonnaire spécifique au stade (SSEA4), CSN avec zone Y anti-sexe (Sox2) et anti-Nestine, sphères neurales avec boîte anti-appariement 6 (Pax6) et anti-Nestine, astrocytes avec protéine acide fibrillaire anti-gliale (GFAP) et protéine de liaison au calcium anti-S100 β (S100β), et neurones DA avec anti-tyrosine hydroxylase (TH), anti-β III Tubuline (Tuj 1), anti-synaptophysine et anti-PSD-95 (0,5 mL de solution d’anticorps primaires par puits dans une plaque de 12 puits; voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
  4. Lavez les échantillons avec du PBS (1x) trois fois pendant 10 minutes chacun en balançant doucement.
  5. Incuber avec une solution d’anticorps secondaires (1:800 dans un tampon de blocage, 0,5 mL de solution d’anticorps secondaires Alexa Fluor par puits dans une plaque de 12 puits) pendant 1 h à TA avec basculement doux.
  6. Incuber les cellules avec Hoechst 33342 (1:5 000, 0,5 mL par puits dans une plaque de 12 puits) dans du PBS (1x) pendant 15 minutes à TA pour marquer les noyaux.
  7. Montez les cellules avec un support de montage et séchez-les pendant la nuit à RT pour l’imagerie sous un microscope à fluorescence dans l’obscurité. Voir la figure supplémentaire S1 pour les réglages et les paramètres du microscope.

3. Mesure par cytométrie de flux du volume mitochondrial, de la MMP et des ROS mitochondriaux dans les cellules vivantes

  1. Ensemencer les cellules séparément dans 4 puits dans une plaque de 6 puits jusqu’à ce que les cellules atteignent 50% -60% de confluence. Étiquetez ces quatre puits comme #1, #2, #3 et #4.
  2. À la fin de la période de culture, préparer 5 solutions de coloration individuelles (500 μL par puits dans une plaque de 6 puits) comme suit : #1 seul milieu de culture (au puits #1 contenant uniquement des cellules pour le contrôle); #2-1 contenant FCCP (100 μM); #2-2 contenant FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) en milieu de culture; #3 contenant TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) dans un milieu de culture; #4 contenant MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) dans PBS (1x) avec 10% FBS. Voir la figure 1A, le tableau supplémentaire S2 et le tableau des matériaux pour plus de détails sur ces composés et la configuration de la cytométrie en flux.
    REMARQUE: Utilisez le milieu de culture pour préparer la solution de coloration. Réchauffer le milieu et PBS (1x) à TA avant utilisation. Le FCCP est toxique; Prévenir l’exposition de la peau et des yeux et travailler sous une hotte chimique.
  3. Aspirer le milieu du puits #2 et ajouter la solution #2-1 (FCCP seulement). Incuber les cellules à 37 °C pendant 10 min.
  4. Aspirer le milieu des puits #2 et #3 et ajouter la solution #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) dans le puits #2 et la solution #3 (TMRE + MTG) dans #3. Incuber les cellules à 37 °C pendant 45 min.
  5. Aspirez le milieu du puits #4 et ajoutez la solution #4 (MitoSox Red + MTG). Incuber les cellules à 37 °C pendant 15 min.
  6. Aspirer le milieu de tous les puits. Laver avec du PBS (1x) (4 mL par puits dans une assiette à 6 puits). Détacher les cellules à l’aide de 1 mL de réactif de dissociation cellulaire (1 mL par puits dans une plaque de 6 puits) à 37 °C pendant 5 min. Neutraliser le réactif de dissociation cellulaire dans 1 mL de DMEM avec 10% FBS (2 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
  7. Recueillir le contenu de tous les puits dans des tubes coniques de 15 mL. Centrifuger les tubes à 300 × g pendant 5 min. Lavez les granulés avec du PBS (1x) une ou deux fois.
  8. Aspirer les surnageants, mais laisser environ 100 μL dans les tubes. Remettez en suspension les pastilles de la cellule dans 300 μL de PBS (1x). Transférer les cellules dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL. Gardez les tubes dans l’obscurité à RT.
  9. Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux (avec une configuration laser 3 bleu et 1 rouge). Détectez MTG dans le filtre 1 (FL1) à l’aide d’un filtre passe-bande 530/30, TMRE dans le filtre 2 (FL2) à l’aide du filtre passe-bande 585/40 et MitoSox Red dans le filtre 3 (FL3) à l’aide d’un filtre passe-bande 510/580.

4. Mesure par cytométrie de flux des sous-unités complexes MRC et TFAM dans les cellules fixes

  1. À la fin de la période de culture, détacher les cellules (~106) en ajoutant le réactif de dissociation cellulaire ; Ensuite, pelletez et recueillez les cellules dans un tube de 15 mL. Laver les cellules par centrifugation avec du PBS (1x) deux fois par centrifugation à 300 × g pendant 5 min.
  2. Fixer les cellules dans 1,6 % de PFA (1 mL de 1,6 % de PFA dans un tube de 15 mL) à TA pendant 10 min. Laver les cellules par centrifugation avec du PBS (1x) deux fois par centrifugation à 300 × g pendant 5 min.
  3. Perméabiliser les cellules avec du méthanol glacé à 90 % (1 mL de méthanol à 90 % dans un tube de 15 mL) à -20 °C pendant 20 min.
  4. Bloquer les échantillons dans un tampon de blocage contenant 0,3 M de glycine, 5 % de sérum de chèvre et 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) - fraction V dans du PBS (1x) (1 mL de tampon de blocage dans un tube de 15 mL). Laver les cellules par centrifugation avec du PBS (1x) deux fois (comme à l’étape 3.7).
  5. Incuber les cellules avec les anticorps primaires suivants pendant 30 minutes : anti-NDUFB10 (1:1 000) pour la mesure de la sous-unité complexe I, sous-unité A du complexe flavoprotéine flavoprotéine du complexe anti-succinate déshydrogénase (SDHA, 1:1 000) pour la mesure de la sous-unité complexe II et anti-COX IV (1:1 000) pour la mesure de la sous-unité IV complexe, et anticorps anti-TFAM conjugué avec Alexa Fluor 488 (1:400). Colorer le même nombre de cellules séparément avec l’anticorps anti-TOMM20 conjugué avec Alexa Fluor 488 (1:400) pendant 30 minutes (1 mL de solution d’anticorps primaires dans un tube de 15 mL; voir le Tableau des matériaux pour plus de détails sur les anticorps).
  6. Laver les cellules avec du PBS (1x) une fois avec centrifugation à 300 × g pendant 5 min. Ajouter un anticorps secondaire (1:400) dans des tubes de NDUFB10, SDHA et COX IV et incuber les cellules avec ces solutions pendant 30 minutes.
  7. Laver les cellules avec du PBS (1x) une fois en centrifugeant à 300 × g pendant 5 min. Aspirer les surnageants, en laissant environ 100 μL dans les tubes. Remettez en suspension les pastilles de la cellule dans 300 μL de PBS (1x). Transférer les cellules dans des tubes microcentrifugeux de 1,5 mL conservés dans l’obscurité sur de la glace.
  8. Analysez les cellules sur le cytomètre en flux (avec une configuration laser 3 bleu et 1 rouge). Détectez les signaux dans le filtre 1 (FL1) à l’aide d’un filtre passe-bande 530/30. Voir la figure supplémentaire S2 pour les réglages et les paramètres du microscope.

5. Acquisition et analyse de la cytométrie en flux

  1. Utilisez le tube témoin non coloré pour définir les diagrammes de dispersion de la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) et de la zone de diffusion latérale (SSC-A) en fonction de la taille et de la complexité de la population cellulaire analysée. Voir la figure supplémentaire S2 pour les réglages et les paramètres du microscope.
    Remarque : Configurez des contrôles non colorés pour des types de cellules individuels.
  2. Utilisez les tubes de contrôle sans tache pour sélectionner les portes positives et utilisez des tubes de contrôle unicolores pour compenser le chevauchement spectral de fluorescence entre MTG (fluorophore-1 [FL-1]) et TMRE (FL-2) en cytométrie en flux multicolore. Utiliser le contrôle d’isotype pour le contrôle négatif afin de surveiller la coloration de fond dans les échantillons MRC et TFAM. Utilisez le tube FCCP comme contrôle de dépolarisation pour la coloration TMRE.
  3. Retirez les débris étrangers pour sélectionner les cellules vivantes et le point de contrôle principal à partir du tracé de dispersion avant et latéral (figure 2A). Sortez les doublets à l’aide d’un diagramme de densité de hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) par rapport à (vs.) FSC-A pour exclure les doublets et également construire un diagramme de hauteur de diffusion latérale (SSC-H) par rapport à SSC-A (Figure 2A).
  4. Acquisition de données (cytomètre en flux)
    1. En utilisant les échantillons non colorés ou d’isotype comme témoin négatif, créer une porte au-dessus de la population principale des événements unicellulaires tout en observant SSC-A et les divers filtres (FL1, FL2, FL3, FL4) (Figure 1B et Figure 2B).
  5. Analyse des données (logiciel CFlow)
    1. Copiez la position des portes sur les échantillons de cellules colorées et notez la quantité de cellules colorées positivement pour la coloration positive.
    2. Pour chaque sous-population cellulaire, sélectionnez un histogramme et analysez l’intensité médiane de fluorescence (ICM) des différents canaux filtrants (FL1, FL2, FL3, FL4) (axe des x).
      1. Calculer les niveaux d’EMTC en soustrayant l’IMF du FL2 des cellules traitées par FCCP #2 de l’IMF du FL2 des échantillons colorés au TMRE #3 dans un histogramme, comme dans Eq (1) ci-dessous.
        TMRE levels = MFI of FL2 from #3 TMRE-scolored samples - MFI of FL2 of #2 FCCP-treated cells (1)
      2. Calculer les valeurs spécifiques pour MMP et ROS mitochondrial par MFI en TMRE ou MitoSox Red, en divisant l’indicateur de volume mitochondrial MTG.
      3. Calculez la valeur spécifique pour la sous-unité complexe et TFAM en utilisant MFI en expression complexe ou TFAM, en divisant l’indicateur de volume mitochondrial TOMM20.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une description schématique de la méthode de différenciation et des stratégies de cytométrie en flux est présentée à la figure 3. Les CSPi humaines sont différenciées en rosettes neurales, puis soulevées dans une culture de suspension pour la différenciation en sphères neuronales. Les sphères neuronales sont davantage différenciées et mûries en neurones DA. Les sphères neurales sont dissociées en cellules uniques pour générer des astrocytes gliaux, replaquées en monocouches en tant que CSN, ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voici des protocoles pour générer des neurones et des astrocytes dérivés de l’iPSC et évaluer de multiples aspects de la fonction mitochondriale à l’aide de la cytométrie en flux. Ces protocoles permettent une conversion efficace des CSPi humaines en neurones et astrocytes gliaux et la caractérisation détaillée de la fonction mitochondriale, principalement dans les cellules vivantes. Les protocoles fournissent également une stratégie basée sur la cytométrie de flux de co-coloration pour l’acquisition et l’analyse de mult...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Centre d’imagerie moléculaire et le Centre central de cytométrie en flux de l’Université de Bergen en Norvège. Ce travail a été financé par le Conseil norvégien de la recherche (numéro de subvention : 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat et le China Scholarship Council (numéro de projet : 201906220275).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857, RRID :AB_445175Anticorps primaire ; à utiliser comme 1:100, 10 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser Alexa Fluor ® ; 488 chèvre anti-lapin IgG  ; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11008) comme anticorps secondaire.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID :AB_778073Anticorps primaire ; à utiliser comme 1:100, 10 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser Alexa Fluor ® ; 594 IgG anti-souris de chèvre (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11005) comme anticorps secondaire.
anti-Sox2Abcamab97959, RRID :AB_2341193Anticorps primaire ; à utiliser comme 1:100, 10 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser Alexa Fluor ® ; 488 chèvre anti-lapin IgG  ; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11008) comme anticorps secondaire.
anticorps anti-Pax6Abcam ab5790, RRID :AB_305110Anticorps primaire ; à utiliser sous forme de 1:100, 10 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser Alexa Fluor ® ; 488 chèvre anti-lapin IgG  ; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11008) comme anticorps secondaire.
anti-NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID :AB_627994Anticorps primaire ; utilisation sous forme de 1:50, 20 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser Alexa Fluor ® ; 594 IgG anti-souris de chèvre (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11005) comme anticorps secondaire.
anticorps anti-GFAPAbcamab4674, RRID :AB_304558Anticorps primaire ; à utiliser comme 1:100, 10 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ;   ; utiliser Alexa Fluor ® ; 594 IgG anti-poulet de chèvre (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11042) comme anticorps secondaire.
anti-S100&beta ;   ; conjugué avec Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID :AB_2722596Anticorps primaire ; utilisation en tant que 1:400, 2.5 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ;
anticorps anti-THAbcam ab75875, RRID :AB_1310786Anticorps primaire ; utilisation en tant que 1:100, 10 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser Alexa Fluor ® ; 488 chèvre anti-lapin IgG  ; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11008) comme anticorps secondaire.
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID :AB_2256751Anticorps primaire ; à utiliser comme 1:1000, 1 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser Alexa Fluor ® ; 594 IgG anti-souris de chèvre (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11005) comme anticorps secondaire.
anticorps anti-synaptophysineAbcamab32127, RRID :AB_2286949Anticorps primaire ; utilisation en tant que 1:100, 10 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser Alexa Fluor ® ; 488 chèvre anti-lapin IgG  ; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11008) comme anticorps secondaire.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID :AB_303248Anticorps primaire ; à utiliser comme 1:100, 10 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ;   ; utiliser Alexa Fluor ® ; 594 IgG anti-poulet de chèvre (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11042) comme anticorps secondaire.
anti-TFAM conjugué avec Alexa Fluor 488Abcamab198308Anticorps primaire ; utilisation en tant que 1:400, 2.5 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser des IgG2b monoclonaux de souris  ; Alexa Fluor® ; 488 en tant que contrôle d’isotype.
anti-TOMM20 conjugué avec Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID :AB_628381Anticorps primaire ; utilisation en tant que 1:400, 2.5 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser des IgG2a monoclonales de souris  ; Alexa Fluor® ; 488 en tant que contrôle d’isotype.
anticorps anti-NDUFB10Abcamab196019Anticorps primaire ; à utiliser sous forme de 1:1000, 1 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utiliser Alexa Fluor ® ; 488 chèvre anti-lapin IgG  ; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11008) comme anticorps secondaire ; utiliser les IgG monoclonales de lapin comme contrôle isotype.
anticorps primaire anti-SDHAAbcamab137040; à utiliser comme 1:1000, 1 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ;   ; utiliser Alexa Fluor ® ; 488 chèvre anti-lapin IgG  ; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11008) comme anticorps secondaire ; utiliser les IgG monoclonales de lapin comme contrôle isotype.
anticorps anti-COX IVAbcamab14744, RRID :AB_301443Anticorps primaire ; à utiliser comme 1:1000, 1 &mu ; L sur 1000 &mu ; L solution de coloration ; utilisation  ; Alexa Fluor ® ; 488 chèvre anti-souris IgG  ; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11001) comme anticorps secondaire ; utiliser des IgG monoclonales de souris comme contrôle d’isotype.
Activin APeproTech120-14EMilieu de différenciation des astrocytes
ingrédient ABM Milieu basalLonzaCC-3187Milieu basal pour la culture d’astrocytes
AGM SingleQuots Supplement PackLonzaCC-4123Supplément pour culture d’astrocytes
Antibiotique-AntimycosiqueThermo Fisher Scientific15240062CDM
ingrédient Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010Milieu basal pour dilution Geltrex
Albumine sérique bovine EuropaBioproductsEQBAH62-1000Agent bloquant pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps dans les tests d’immunocoloration et l’ingrédient CDM
BDNFPeproTech450-02Neurones DA ingrédient moyen
B-27 SupplémentThermo Fisher Scientific17504044Ingrédient moyen de différenciation astrocytaire Cytomètre
en flux BD Accuri C6 PlusBD Biosciences, États-Unis
Concentré de lipides chimiquement définis ThermoFisher Scientific11905031Ingrédient CDM
Collagénase IVThermo Fisher Scientific17104019Réactif pour la dissociation en douceur des iPSC humaines
Caméra microscope CCD Leica DFC3000 GLeica Microsystèmes, Allemagne
Boîtes de culture non traitées CorningSigma-AldrichCLS430589Culture en suspension
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Utilisé pour une variété de lavage de culture cellulaire
DMEM/F-12, supplément GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018Différenciation des astrocytes basal Medium
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Réactif pour la dissociation en douceur des iPSC humaines
Essential 8 Basal Medium ThermoFisher ScientificA1516901Medium basal pour la culture d’iPSC
Essential 8 Supplement (50X)ThermoFisher ScientificSupplement pour la culture d’iPSC
EGF Recombinant Human ProteinThermo Fisher ScientificPHG0314 Supplement pour la culture de NSC
FGF-basic (AA 10&ndash ; 155) Protéine humaine recombinanteThermo Fisher ScientificPHG0024 Supplément pour la culture NSC
Sérum de veau fœtalSigma-Aldrich12103CIngrédient moyen
FGF-basicPeproTech100-18BDifférenciation des astrocytes Ingrédient moyen
FCCPAbcamab120081Élimine le potentiel de membrane mitochondriale et la coloration TMRE
Système d’aspiration de fluide Contrôle BVCVacuubrand, Allemagne
Formaldéhyde (PFA) 16 %Thermo Fisher Scientific28908Fixation cellulaire
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302Utilisé pour la fixation et l’entretien des iPSC humaines
Supplément GlutaMAX ThermoFisher Scientific35050061Supplément pour culture NSC
GDNFPeprotech450-10DA neurones moyen ingrédient
GlycineSigma-AldrichG8898Utilisé pour bloquer
le tampon Mélange nutritif F-12 de HamThermo Fisher Scientific31765027Milieu de base pour CDM
Heregulin bêta-1 humainSigma-AldrichSRP3055Ingrédient du milieu de différenciation des astrocytes
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Coloration des noyaux pour l’image confocale
Incubateurs de CO2 Heracell 150iFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Milieu basal pour
CDM InsulineRoche1376497CDM ingrédient
InSolution Inhibiteurde l’AMPK Sigma-Aldrich171261Milieu d’induction neurale ingrédient
Facteur de croissance analogue à l’insuline-I humainSigma-AldrichI3769Ingrédient du milieu de différenciation des astrocytes KnockOut
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660012Milieu basal pour la culture NSC
LamininSigma-AldrichL2020Favorise l’attachement et la croissance des cellules neurales in vitro
Leica TCS SP8 STED microscope confocalLeica Microsystems, Allemagne
MonothioglycérolSigma-AldrichM6145CDM ingrédient
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514Utilisé pour l’indicateur de volume mitochondrial
MitoSox Red ThermoFisher ScientificM36008Utilisé pour l’indicateur ROS mitochondrial
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250Neural Ingrédient moyen d’induction
N-2 SupplémentThermo Fisher Scientific17502048Ingrédient moyen de différenciation astrocytaire
Sérum de chèvre normalThermo Fisher ScientificPCN5000Utilisé pour bloquer le tampon
Agitateurs orbitaux - SSM1Stuart Equipment, UK
Solution de poly-L-ornithineSigma-AldrichP4957Favorise l’attachement et la croissance des cellules neurales in vitro
Poly-D-lysine hydromyureSigma-AldrichP7405Favorise l’attachement et la croissance des cellules neurales in vitro
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Favorise la différenciation des neurones DA
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Montage de la lamelle pour l’image
confocalePBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Utilisé pour une variété de
protéines recombinantes humaines/souris FGF-8b R& D Systems423-F8-025/CFFavorise la différenciation des neurones DA
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement ThermoFisher ScientificA10508-01Supplement for NSCs
TrypLE Express Enzyme ThermoFisher Scientific12604013Réactif de dissociation cellulaire
TransfertrineRoche652202Ingrédient CDM
TRITON X-100VWR International9002-93-1Utilisé pour la perméabilisation cellulaire dans les tests d’immunomarquage
TMREAbcamab113852Utilisé pour la coloration potentielle de la membrane mitochondriale
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, États-Unis
A1517101

References

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