Article de méthode

Établissement d’un modèle de pancréatite aiguë sévère chez la souris par injection rétrograde de taurocholate de sodium dans le canal biliopancréatique

DOI :

10.3791/63129

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1 avril 2022

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1Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 2MOE Engineering Center of Hematological Disease, Soochow University, 3Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, 4National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 5MOH Key Lab of Thrombosis and Hemostasis, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Collaborative Innovation Center of Hematology, Soochow University

Dans cet article

Résumé

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Un modèle murin de pancréatite aiguë sévère est décrit ici. La procédure présentée ici est très rapide, simple et accessible, permettant ainsi potentiellement l’étude des mécanismes moléculaires et des différentes interventions thérapeutiques dans la pancréatite aiguë de manière pratique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prévalence de la pancréatite aiguë (PA), en particulier de la pancréatite aiguë sévère (SAP), augmente chaque année dans les groupes d’âge plus jeunes. Cependant, il y a un manque de traitements efficaces dans la pratique clinique actuelle. Avec l’accessibilité facile des souches transgéniques et knockout et leur petite taille, qui permet des doses minimales de médicaments nécessaires à l’évaluation in vivo , un modèle expérimental bien établi chez la souris est préféré pour la recherche sur l’AP. De plus, le SAP induit par le taurocholate de sodium (TC) est actuellement l’un des modèles les plus largement utilisés et les mieux caractérisés. Ce modèle a été étudié pour de nouvelles thérapies et des événements moléculaires possibles au cours du processus d’AP. Ici, nous présentons la génération d’un modèle de souris AP utilisant du taurocholate de sodium et un simple microsyringe fait maison. En outre, nous fournissons également la méthodologie pour les tests histologiques et sérologiques ultérieurs.

Introduction

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La pancréatite aiguë (AP) est une inflammation aiguë du pancréas caractérisée par une obstruction du canal pancréatique principal avec distension canalaire ultérieure et autodigestion du pancréas par ses enzymes anormalement activées. Ses manifestations cliniques comprennent une inflammation locale ou systémique, des douleurs abdominales et une élévation de l’amylase sérique1,2. Selon la classification de gravité3, l’AP peut se présenter sous des formes légères, modérées et sévères, et parmi elles, la pancréatite aiguë sévère (SAP) est la condition la plus préoccupante en raison de son taux de mortalité élevé de plus de 30 %4. Aux États-Unis, l’AP est l’une des raisons les plus courantes d’hospitalisation, touchant plus de 200 000 patients5. De plus, l’AP, en particulier SAP, augmente chaque année et affecte les groupes d’âge plus jeunes6. Cependant, il y a un manque d’options de traitement efficaces dans la pratique clinique actuelle6,7. Par conséquent, il est nécessaire d’explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans l’AP, facilitant ainsi l’amélioration du traitement.

Des modèles animaux expérimentaux bien établis sont nécessaires pour étudier les mécanismes impliqués dans l’AP et évaluer l’efficacité des différentes modalités de traitement. Avec l’accessibilité facile des souches transgéniques et knockout et leur petite taille, qui minimise les doses de médicaments nécessaires à l’évaluation in vivo, les souris sont préférées pour la recherche AP. Par conséquent, plusieurs modèles d’AP ont été développés chez la souris8,9.

Travaillant à partir d’un modèle de rat de pancréatite légère induite par l’administration intraveineuse de caerulein10, Niederau et al. ont développé un modèle murin SAP présenté avec une nécrose à cellules acineuses induite à l’aide du même médicament et de la même voie d’injection11. Bien que ce modèle présente plusieurs avantages, notamment la non-invasivité, l’induction rapide, la reproductibilité étendue et l’applicabilité, l’inconvénient majeur est que seule une forme légère d’AP est développée dans la plupart des cas, limitant ainsi sa pertinence clinique. L’alcool est considéré comme l’un des principaux facteurs étiologiques de l’AP; cependant, Foitzik et coll. ont rapporté qu’il ne cause des lésions pancréatiques que lorsqu’il est associé à d’autres facteurs, comme l’hyperstimulation exocrine12. De plus, bien que des modèles d’AP induits par l’alcool se soient développés par différentes voies d’administration et que des doses de médicaments aient été rapportées13,14,15, leur principal inconvénient est la difficulté de les reproduire. L’administration intrapéritonéale de L-arginine peut également induire l’AP chez la souris16; cependant, sa faible pertinence clinique entrave son application. Le taurocholate, un sel biliaire, a été proposé pour la première fois par Creutzfeld et al. en 1965 pour induire une affection ressemblant à l’AP humaine par perfusion de canal pancréatique17. Bien qu’il existe des controverses quant à sa pertinence clinique en physiopathologie18,19, la pancréatite induite par le taurocholate reste un modèle indispensable pour la SAP.

Comme ce modèle est simple à réaliser et est également efficace chez la souris, il est maintenant l’un des modèles AP les plus utilisés pour les études in vivo sur de petits animaux. Perides et al. ont utilisé le taurocholate de sodium (TC) pour induire la SAP chez la souris20, fournissant des informations pour comprendre sa pathologie. Combiné à des techniques de modification génétique, ce modèle nous a permis de confirmer plusieurs gènes spécifiques impliqués dans l’AP. Par exemple, Bicozo et al. ont montré qu’un knockout du gène CD38 protégeait contre un modèle de pancréatite à perfusion de TC et attribuait les mécanismes à des altérations de la signalisation intracellulaire Ca2+21. Fanczal et coll. ont étudié l’implication physiologique de l’expression de TRPM2 dans la membrane plasmique des cellules acineuses et canalaires pancréatiques de souris, et ont démontré une gravité réduite de la SAP induite par TC chez les souris knock-out TRPM22. En outre, ce modèle fournit également un moyen simple et efficace de tester de nombreux nouveaux médicaments in vivo. Par exemple, cette méthode a permis de valider les effets thérapeutiques de la caféine23, de l’acide déshydrocholique24 et de divers antioxydants et anticoagulants25,26. Ces preuves démontrent la polyvalence du modèle SAP induit par TC. Bien que Wittel et coll. aient décrit un modèle murin similaire27, un manque de détails sur les procédures de mise en œuvre pourrait entraîner une incapacité à reproduire les résultats. Dans cet article, nous nous concentrons sur les méthodes utilisant un simple microsyringe fait maison et étudions la SAP induite par TC, fournissant ainsi des conseils possibles non seulement pour une étude plus approfondie de la pathogenèse et du traitement de l’AP, mais également pour une méthode expérimentale parfaitement adaptable pour de nombreuses autres substances.

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Protocole

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Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université Soochow. Toutes les interventions chirurgicales ont été effectuées sous anesthésie complète. Les analgésiques n’ont pas été utilisés pour éviter toute interférence avec l’évolution naturelle de la maladie selon la littérature précédente28,29. L’approbation de l’absence d’analgésie a également été accordée par le Comité d’éthique animale de l’Université Soochow.

1. Préparation

  1. Jeûnez une souris de type sauvage C57BL/6 8-12 h avant la chirurgie.
  2. Préparer une solution de TC à 5 % (p/v) (93 mM) diluée dans du chlorure de sodium à 0,9 %. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm.
  3. Autoclavez les instruments et matériaux chirurgicaux, y compris les pinces, les ciseaux, le porte-lame, le porte-aiguille, le clip hémostatique, les pinces vasculaires et les rideaux stériles, à l’aide d’un stérilisateur à pression à une température de 121 ° C pendant 30 min.
  4. Préparez une microsyringe maison. Pour ce faire, installez manuellement une pointe d’insuline jetable et une pointe de pipette en plastique prolongée sur une seringue Microliter à pointe plate de 25 μL. Stériliser par irradiation.

2. Anesthésie et préparation préopératoire

  1. Peser des souris mâles de type sauvage C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines (environ 21 à 23 g). Induire une anesthésie générale avec une injection intrapéritonéale de solution de pentobarbital sodique à 1% à une dose de 50 mg/ kg.
  2. Fixez la souris en position couchée sur une plaque plate en mousse irrirrayonnée avec le ruban adhésif.
  3. Préparez la région opératoire de chaque animal en retirant sa fourrure avec une crème d’épilation du niveau du processus xiphoïde jusqu’à la ligne de connexion de la colonne iliaque antérieure antérieure bilatérale, avec les côtés gauche et droit parallèles à la ligne axillaire avant.
  4. Préparez un champ chirurgical stérile avec un accent particulier sur la zone chirurgicale, composée de la zone préparée sur l’animal et le devant du chirurgien.
    1. Désinfectez la paillasse.
    2. Nettoyez le site d’incision avec de multiples applications de solution de gommage chirurgical. Essuyez la peau deux à trois fois avec 0,5% d’iodophore et laissez-la sécher pendant 1 à 2 minutes à chaque fois.
    3. Couvrez la souris avec des rideaux stériles.

3. Intervention chirurgicale

REMARQUE: La figure 1 illustre l’anatomie et la morphologie du pancréas de la souris avant et après l’injection rétrograde de TC dans le canal biliopancréatique par micro-injection.

  1. Faites une incision abdominale médiane d’environ 2 à 3 cm de long.
  2. Localisez le duodénum de gauche à droite le long de l’estomac. Retirez doucement le duodénum et vers le côté gauche à l’aide d’une pince chirurgicale et d’un coton-tige imbibé de désinfectant pour exposer le pancréas, le canal biliopancréatique et la papille duodénale. Veillez à ne pas blesser la paroi intestinale ou les vaisseaux connexes.
  3. Utilisez 8-0 sutures pour passer à travers la connexion entre le duodénum et le pancréas autour de la papille, et les tirer vers le côté gauche du corps de la souris pour fixer le duodénum.
  4. Tirez doucement la peau et le bord inférieur du foie de côté. Serrez le canal hépatique commun, en veillant à ne pas serrer la veine porte ou le pancréas. Serrez le canal biliopancréatique proximal.
  5. Percer le micro-injecteur dans le canal biliopancréatique distal rétrogradement. Fixez la pointe de l’aiguille près de la papille duodénale avec une pince. Infuser 10 μL de TC à 5 % dans le canal pancréatique à raison de 5 μL/min.
  6. Gardez le canal biliopancréatique fermé pendant 5 minutes pour obtenir une pression stable. Ensuite, retirez le micro-injecteur et retirez les pinces.
  7. Restaurez le duodénum à la position anatomique d’origine et vérifiez le saignement.
  8. Fermez la plaie avec 6-0 sutures et désinfectez avec 0,5% d’iodophore.

4. Récupération et prise en charge postopératoire

  1. Récupérez les animaux de l’anesthésie sur un coussin thermique à 37 °C. N’envoyez pas les animaux opérés dans la salle postopératoire temporelle tant que tous les animaux ne se sont pas réveillés.
  2. Administrer 0,8 mL de solution saline à 0,9 % par voie sous-cutanée et lentement pour la supplémentation en liquide.
  3. Surveillez les animaux après l’opération pour leur état général et les signes d’infections ou de maladies.

5. Tests sérologiques et évaluation histologique

  1. 24 h après l’opération, anesthésier les souris avec du pentobarbital sodique en utilisant la même dose et la même voie d’injection.
  2. Prélever tout le sang de l’aorte abdominale (environ 0,8 mL par souris) et tourner à 1 500 x g pendant 15 min pour isoler le sérum pour des tests supplémentaires.
  3. Recueillir les tissus du pancréas.
  4. Ouvrez la cavité thoracique pour recueillir les tissus pulmonaires.
  5. Mesurer les indices de fonction biochimique du sérum, y compris l’amylase, la lipase, la fonction hépatique (alanine transaminase (ALT) et aspartate transaminase (AST)) et la fonction rénale (urée et créatine), à l’aide de kits commerciaux conformément aux instructions des fabricants.
  6. Homogénéiser les tissus du poumon et du pancréas et mesurer le niveau de myéloperoxydase (MPO) à l’aide d’un kit commercial selon les instructions du fabricant.
  7. Ouvrez la cavité thoracique et perfuser avec 20 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois, puis collectez le pancréas. Immerger dans une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h. Déshydrater dans une série de concentrations d’alcool et incorporer dans la paraffine.
  8. Utilisez un microtome pour préparer des coupes de tissu pancréatique de 5 μm d’épaisseur.
  9. Effectuer une coloration H & E pour l’évaluation histologique du pancréas.
  10. Évaluer les scores pathologiques selon les critères proposés par Schmidt et al.30.

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Résultats

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En suivant attentivement les instructions ci-dessus, nous avons obtenu une durée moyenne de chirurgie d’environ 40 min. Les souris étaient légèrement inactives et avaient perdu environ 0,5 à 1,75 g, 0,85 à 1,85 g et 0,5 à 4,73 g de poids à 24 h, 48 h et 72 h après l’opération, respectivement (figure 2).

À partir de la fin de la chirurgie jusqu’à 24 heures après l’opération, au fur et à mesure que la maladie se développait, les souris sont devenues inactives et ont...

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Discussion

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Le modèle SAP induit par TC est un excellent outil de recherche. Comme le montre cette étude, ce modèle est très facilement réalisé dans les laboratoires généraux sans utiliser d’appareils spécifiques. Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec l’histologie et l’analyse biochimique, il fournit une approche rentable (réactifs peu coûteux) et rapide (fenêtre de temps de 24 heures) pour induire et évaluer l’AP. L’ajustement de la concentration de TC offre également la possibilité de produire des AP légères et modérées. Perid...

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Remerciements

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Nous sommes reconnaissants du soutien des subventions suivantes: une subvention de recherche translationnelle de NCRCH [2020WSA01], une subvention scientifique KJXW de la Commission de la santé de Suzhou pour les jeunes chercheurs [KJXW2020002], un plan scientifique et technologique de la ville de Suzhou (SKY2021038 et SKJY2021050), une subvention du programme académique prioritaire de développement des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD) et un plan de recherche et de développement social primaire de la province du Jiangsu (BE2018659).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Iodophor 0,5 %Shanghai Likang Désinfectant3101024 mL/souris
Chlorure de sodium 0,9 %Sinopharm Group Co., Ltd.100193180,8 mL/souris
1 % Pentobarbital sodiqueSigmaP37610,2 -0,25 mL/souris
25 &mu ; L seringue Microliter à embout platGaoge, ShanghaiA124019
4 % ParaformaldéhydeBeyotime, Nantong, ChineP0099-500ml
5 % taurocholate de sodium (TC)AladdinS100834-5g10 &mu ; Souris L/SAP
6-0 Microsuture stérile en nylon avec aiguille filetée (1/2 cercle)Cheng-He20093
75 % d’alcoolSinopharm Group Co., Ltd.100092184 mL/souris
8-0 Microsuture stérile en nylon avec aiguille filetée (cercle 3/8)Cheng-He19064
ALT Kit de dosage d’activitéEPNK, Anhui, ChineALT0012
Kit de dosage de l’amylaseEPNK, Anhui, ChineAMY0012
Pince coudée pour petit bouledogue avec mâchoire de 12 mm (3 cm)Copeaux de tremble Cheng-HeHC-X022
déchiquetage pour la litière de sourisBeijing Vital River Laboratory Animal TechnologyVR03015
AST Activity Assay KitEPNK, Anhui, ChineAST0012
Blood Urea Nitrogen (BUN) Kit de dosageEPNK, Anhui, ChineBUN0011
souris C57BL / 6Beijing Vital River Laboratory Animal Technology213
Kit de dosage de créatineEPNK, Anhui, Chine
Lame de microtomeBeyotime, Nantong, ChineE0994
Pince hémostatique (9,5 cm, incurvée)JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.JC3901
Kit de dosage de lipaseJiancheng, Nanjing, ChineA054-2-1
MicrotomeLeica biosystem, AllemagneRM2245
Analyseur de biochimie MindrayMindray, Shenzhen, ChineBS-420
Kit de dosage MPOJiancheng, Nanjing, ChineA044-1-1
Souris normale chowTrophic, Nantong, ChineLAD 1000
Solution saline tamponnée au phosphateBeyotime, Nantong, ChineC0221A
Pince micro-bouledogue droite avec mâchoire de 5 mm (1,5 cm)JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.W40130
Pince droite ou courbe (11.0 cm)Cheng-HeHC-X091A ou HC-X090A
Ciseaux droits (10.0 cm)Cheng-He, Ningbo, ChineHC-J039102
Thermo Scientific CentrifugeuseThermo Scientific, USAMultifuge X1R
ou CRE0012

Références

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