Nous présentons ici le protocole pour la reconstitution par étapes de cellules synthétiques présentatrices d’antigènes à l’aide de bicouches lipidiques soutenues par des billes et leur utilisation pour interroger la sortie synaptique des cellules T activées.
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Article de méthode
Préparation de bicouches lipidiques soutenues par des perles pour étudier la production de particules des synapses immunitaires des lymphocytes T
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules présentatrices d’antigènes (APC) présentent trois signaux d’activation aux lymphocytes T engagés dans un contact physique : 1) l’antigène, 2) la costimulation/corépression et 3) les cytokines solubles. Les lymphocytes T libèrent deux types de particules effectrices en réponse à l’activation : les vésicules transsysylétiques (vST) et les particules d’attaque supramoléculaires, qui transfèrent respectivement des messagers intercellulaires et médient la cytotoxicité. Ces entités sont rapidement internalisées par les APC engagés dans un contact physique avec les lymphocytes T, ce qui rend leur caractérisation décourageante. Cet article présente le protocole de fabrication et d’utilisation des bicouches lipidiques supportées par des billes (BSLB) en tant que mimétiques de cellules présentatrices d’antigènes (APC) pour capturer et analyser ces particules transsynaptiques. Sont également décrits les protocoles pour les mesures absolues des densités de protéines à la surface des cellules, la reconstitution des BSLB avec de tels niveaux physiologiques et la procédure de cytométrie en flux pour suivre la libération de particules synaptiques par les cellules T. Ce protocole peut être adapté pour étudier les effets de protéines individuelles, de mélanges de ligands complexes, de déterminants de virulence pathogène et de médicaments sur la sortie effectrice des cellules T, y compris les cellules T auxiliaires, les lymphocytes T cytotoxiques, les cellules T régulatrices et les cellules T exprimant les récepteurs de l’antigène chimérique (CART).
Introduction
La synapse immunologique (IS) est une structure moléculaire pivot formée à l’interface des cellules engagées dans un contact physique qui facilite l’échange régulé d’informations sur la juxtracrine. Différents SYSTÈMES ont été décrits dans la littérature, et un nombre croissant de preuves suggère que ces centres moléculaires sont une caractéristique conservée des réseaux cellulaires. Diverses cellules immunitaires, y compris les cellules B, les cellules tueuses naturelles, les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules T, échangent des informations via l’assemblage de contacts de courte durée1. Les études multiomiques font progresse....
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Protocole
1. Mesure des densités de protéines de surface cellulaire par cytométrie quantitative en flux
- Préparer un tampon de cytométrie en flux humain (hFCB) filtré à 0,22 μm en ajoutant de l’EDTA (à une concentration finale de 2 mM) et du sérum AB humain (jusqu’à un final de 10 %) à une solution saline tamponnée stérile au phosphate (PBS), pH 7,4 (voir le tableau 1). Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 μm pour éliminer les impuretés sériques et conserver à 4 °C.
- Récupérer les cellules et les sédimenter par centrifugation à 300 × g pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Lavez les ....
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Résultats
FCM pour la quantification absolue des protéines à la surface de la cellule
La reconstitution des BSLB présentant des densités physiologiques de ligands nécessite l’estimation des densités protéiques totales sur le sous-ensemble cellulaire modélisé. Pour reconstituer les BSLB, inclure tout ligand pertinent censé jouer un rôle dans l’axe de signalisation d’intérêt aux côtés des protéines soutenant l’adhésion et l’interaction fonctionnelle entre BSLB et les cellules, telles que l’ICAM-1 et les molécules.......
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Discussion
Les BSLB sont des outils polyvalents pour étudier la production de particules des lymphocytes T stimulés par des membranes APC modèles. La flexibilité de la méthode permet la reconstitution de compositions membranaires complexes et réductionnistes pour étudier les effets des ligands et de leurs signaux sur la sécrétion de tSV et de particules d’attaque supramoléculaire et leurs composants. Nous avons testé cette technologie sur diverses cellules T, y compris les cellules TH, CTL, Tregs et CART15 p.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants aux membres de notre laboratoire et à la communauté du Kennedy Institute of Rheumatology pour leurs discussions scientifiques constructives, en particulier notre gestionnaire d’installations de cytométrie en flux, Jonathan Webber. Ce travail a été financé par wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, l’ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) et le Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (tous trois à MLD). Le PFCD a été soutenu par embooca Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, en collaboration avec la Commission européenne (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) et Marie Sklodowska-Curie Actions) et une bourse Oxford-Bristol M....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)acide iminodiacétique)succinyl] (sel de nickel) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) dans le chloroforme |
PIPETMAN L Multicanaux P8x200L, 20-200 µ ; L | Gilson | FA10011 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | ; 18:1 (&Delta ; 9-Cis) PC (DOPC) sous chloroforme |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sel de sodium) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE dans le chloroforme |
| 200 & micro ; L embouts jaunes 10 x 96 Embouts, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
| 5 mL tubes en polystyrène à fond rond | Falcon® ; | ||
| 5,00 ± ; 0,05 & micro ; m billes de silice non fonctionnalisées | Bangs Laboratories Inc. | ||
| Plaque de culture cellulaire à 96 puits à fond en U avec couvercle, traitée par culture tissulaire, apyrogène. | Costar® ; | 3799 | Pour la coloration FCM et la co-culture de BSLB et de cellules. |
| Plaque de culture cellulaire à 96 puits à fond en V avec couvercle, traitée par culture tissulaire, apyrogène. | Costar® ; | 3894 | Pour la coloration FCM de cellules ou de billes en suspension. |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (ester de succinimidyle) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&trade ; | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester de succinimidyle) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&trade ; | A37573 et A20006 | |
| Allegra X-12R Centrifugeuse | Beckman Coulter | Pour la coloration normale en tube d’échantillons biologiques pour FCM | |
| Feuille d’aluminium | N’importe quelle marque | Pour protéger les cellules et les BSLB contre la lumière | |
| anti-humaine CD154 (CD40L), clonez 24-31 | BioLegend | 310815 et 310818 | conjugués Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 647, respectivement. |
| CD185 anti-humain (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | Pour l’analyse quantitative FCM des amygdales amygdales comme le montre la Fig. 1E |
| anti-humain CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | Pour l’analyse quantitative FCM des cellules amygdales comme le montre la Fig. 1E |
| CD2 anti-humain, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Etiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-CD2 humain, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | conjugué Brilliant Violet 421. |
| anti-humain CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugué | |
| anti-humain CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-humain CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugué, nous avons trouvé ce clone plus propre que le clone RS38E. |
| CD38 anti-humain, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugué |
| anti-humain CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugué |
| anti-humain CD39, clone A1 | BioLegend | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-humain CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | Pour l’analyse quantitative FCM des amygdales comme le montre la Fig. 1E |
| CD4 anti-humain, le clone A161A1 | BioLegend | 357414 et 357421 | conjugués PerCP/Cyanine5.5 et Alexa Fluor 647, respectivement |
| CD4 anti-humain, clone OKT4 | BioLegend | 317414 et 317422 | conjugués PE/Cy7 et Alexa Fluor 647, respectivement |
| CD40 anti-humain, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-humain CD40, clone G28.5 | BioLegend | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-humain CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 et 368516 | conjugués Alexa Fluor 647 et APC/Cy7 |
| anti-humain CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | conjugué |
| Alexa Fluor 647CD54 anti-humain (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Marqué en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| CD63 anti-humain (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 et 353015 | conjugués PerCP/Cyanine5.5 et Alexa Fluor 647, respectivement |
| anti-CD73 humain, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Marqué en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| CD80 humain, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | conjugué Alexa Fluor 647 |
| CD81 humain, clone 5A6 | BioLegend | 349512 et 349502 | conjugué PE/Cy7 et étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester succinimidylique), respectivement. |
| CD82 anti-humain, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | conjugué Alexa Fluor 647 |
| CD86 humain, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugué |
| anti-humain CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugué |
| anti-humain CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | conjugué Alexa Fluor 700 |
| anti-humain HLA-A/ B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 et 311402 | conjugué Alexa Fluor 647 et étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-humain HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 et 307622 | conjugués Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 647, respectivement. |
| anti-humain ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-humain ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Hamster Arménien IgG |
| anti-humain ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | conjugué Alexa Fluor 647 |
| anti-humain ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-humain LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produit en interne | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-humain OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | conjugué Alexa Fluor 647 |
| anti-humain-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 et 329902 | Conjugué Alexa Fluor 647 et étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-humain-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-humain-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugué |
| anti-humain-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-TCRab humain, clone IP26 | BioLegend | 306712 et 306714 | conjugués Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 647, respectivement. |
| antti-humain CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
| antti-humain CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugué |
| hamster arménien IgG Alexa Fluor 647 Contrôle de l’isotype, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Étiqueté en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester de succinimidyle) |
| BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson et Société (BD) | 641319 | Performance track des instruments avant quantitatif FCM |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson & Société (BD) | 23-14523-00 | Logiciel d’acquisition |
| Sérum bovin Albumine | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
| CaCl2, Chlorure de calcium | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydre, BioReagent, adapté à la culture cellulaire d’insectes, adapté à la culture de cellules végétales, &ge ; 96,0 % |
| Caséine de lait bovin, adaptée comme substrat pour la protéine kinase (après déphosphorylation), poudre purifiée | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
| DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen&trade ; | 12321D | Pour l’élimination de Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 dans des volumes inférieurs à 2 mL |
| DynaMag&trade ;-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen&trade ; | 12301D | Pour l’enlèvement des Dynabeads et du commerce ; T-Activateur humain CD3/CD28 dans des volumes inférieurs à 15 mL |
| Sérum fœtal bovin qualifié, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Nécessite une inactivation thermique pendant 30 min à 56 oC |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Solution stérile de polysaccharide et de diatrizoate de sodium pour l’isolement des lymphocytes |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | Pour l’exclusion des cellules mortes lors des analyses |
| FlowJo | Becton Dickinson & Société (BD) | Version 10.7.1 | Logiciel d’analyse |
| Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | Pour le mélange de cellules pendant la coloration ou de BSLB pendant le staning ou le chargement de protéines (comme alternative à l’agitation orbitale |
| )HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
| HEPES, acide N-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-N&prime ;-(2-éthanesulfonique), acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | Pour la préparation du tampon HBS/HAS ou HBS/BSA. Certifié BioPerformance, &ge ; 99,5 % (titrage), adapté à la culture cellulaire |
| HERACell 150i Incubateur CO2, 150 L, acier inoxydable électropoli | ThermoFisher Scientific | 51026282 | Pour la culture et l’expansion de lymphocytes T CD4+ et CD8+ purifiés. |
| Hula Mixer® ; Mélangeur d’échantillons | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Mélangeur de laboratoire vertical à angle variable utilisé pour le mélange de BSLB et de mélanges composites, de solutions bloquantes, de mélanges maîtres de protéines et de colorations d’anticorps à petite échelle. |
| Albumine sérique humaine, solution aqueuse à 30 % | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
| Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Solution pour le blocage des récepteurs Fc à partir d’échantillons biologiquement pertinents |
| Innovatis CASY compteur et analyseur TT | Biovendis Products GmbH | Pour le comptage des cellules et la détermination de la taille et du volume des cellules en fonction de l’exclusion du courant électrique. | |
| KCl, Chlorure | de potassium Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Poudre, BioRéactif, adapté à la culture cellulaire |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
| MgCl2, Chlorure de magessium | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioRéactif, adapté à la culture cellulaire, adapté à la culture cellulaire d’insectes |
| Insert de microtubes pour 24 x 1,5/2,0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Insert de microtube pour Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
| Mini Incubateur | Labnet International ; | I5110A-230V | Pour l’incubation (co-culture) de la BSLB et des cellules en l’absence de CO2 |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
| Contrôle des anticorps polyclonaux IgG de souris | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Utilisé comme témoin positif pour la mesure des anticorps liés aux étalons |
| de capture des billes de capture des IgG de sourisSouris IgG1, isotype k, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 et 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 et Brilliant Violet 785, respectivement. |
| Souris IgG1, isotype k, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | conjugué Brilliant Violet 421. |
| Souris IgG1, &kappa ; Contrôle des isotypes, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Marqué en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester succinimidylique) |
| Souris IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugué |
| souris IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 et 400355 | conjugués Alexa Fluor 647 et Brilliant Violet 785, respectivement |
| Multiwell 6 puits Culture tissulaire traitée au plasma | gazeux sous vide Falcon | 353046 | Pour la culture et l’expansion de cellules T CD4+ et CD8+. |
| Na2HPO4, Phosphate disodique | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl, Chlorure de sodium | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, adapté à la culture cellulaire, adapté à la culture cellulaire d’insectes, adapté à la culture cellulaire végétale, &ge ; 99 % |
| NiSO4, sulfate de nickel(II) | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | Pour saturer les sites NTA ; ajouté pendant le processus de blocage |
| Pénicilline Streptomycine [+]10 000 unités Pénicilline ; [+] 10 000 et micro ; g/mL Streptomycine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Saline tamponnée au phosphate pH 7,4, stérile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | Sans Ca2+ ou Mg2+ ajouté |
| Unité de filtration en polyéthersulfone (PES) Thermo | Scientific Nalgene | ; UY-06730-43 | membrane PES hydrophile à faible liaison protéique facilite le filtrage des solutions à haute teneur en protéines |
| PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | Pour la protection des stocks lipidiques stockés à +4 º ;C. |
| Streptavidine purifiée | BioLegend | 280302 | |
| Quantum Alexa Fluor 488 Perles MESF | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Perles de référence pour l’interpolation de molécules Alexa Fluor 488 liées à des cellules et/ou des |
| billes BSLB Quantum Alexa Fluor 647 MESF | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Perles de référence pour l’interpolation de molécules Alexa Fluor 647 liées à des cellules et/ou à des cellules IgG |
| Kappa anti-souris BSLB Rat, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Marqué en interne avec Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Humain recombinant IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
| RMPI Medium 1640 (1x) ; [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
| Rosette Cocktail d’enrichissement des lymphocytes B humains | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolement des lymphocytes B pour mesurer les densités de protéines dans les populations de cellules purifiées |
| Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | Technologies 15022C.1 | |
| Rosette Human CD4+CD127low T Cell Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pré-enrichissement des lymphocytes T CD4+ CD127Low pour l’isolement en aval des Tregs par FACS. |
| Rosette humaine CD8+ Cocktail d’enrichissement des lymphocytes T | STEMCELL Technologies | 15063 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) ; [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | Pour l’incubation (co-culture) de BSLB et de cellules en l’absence de CO2. Les milieux sans rouge de phénol réduisent l’autofluorescence des cellules lors des mesures basées sur la cytométrie en flux et la microscopie. |
| Pyruvate de sodium (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
| Mini centrifugeuse Sprout | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Microcentrifugeuse de paillasse utilisée pour laver les billes de silice et les BSLB dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL. |
| Tubes stériles à fond rond en polystyrène de 5 mL | Falcon | 352058 | |
| UltraComp eBeads Perles de compensation | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
| Colonnes de dessalage Zeba Spin 7K | MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&trade ; | Référence 89882 |
Références
- Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
- Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological syna....
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Réimpressions et autorisations
