Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Summary

Le protocole décrit une conception simple de puces microfluidiques et une méthodologie de microfabrication utilisées pour cultiver C. elegans en présence d’un approvisionnement alimentaire continu jusqu’à 36 heures. Le dispositif de croissance et d’imagerie permet également une imagerie intermittente à haute résolution à long terme des processus cellulaires et sous-cellulaires pendant le développement pendant plusieurs jours.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) s’est avéré être un système modèle précieux pour l’étude des processus biologiques du développement et cellulaires. La compréhension de ces processus biologiques nécessite souvent une imagerie à long terme et répétée du même animal. Les longs temps de récupération associés aux méthodes d’immobilisation conventionnelles effectuées sur des tampons de gélose ont des effets néfastes sur la santé animale, ce qui rend inapproprié l’imagerie répétée du même animal sur de longues périodes. Cet article décrit une conception de puce microfluidique, une méthode de fabrication, un protocole de culture sur puce de C. elegans et trois exemples d’imagerie à long terme pour étudier les processus de développement chez des animaux individuels. La puce, fabriquée avec du polydiméthylsiloxane et collée sur un verre de couverture, immobilise les animaux sur un substrat de verre à l’aide d’une membrane élastomère déviée à l’aide d’azote gazeux. L’immobilisation complète de C. elegans permet une imagerie accélérée robuste des événements cellulaires et subcellulaires sans anesthésie. Une géométrie de canal avec une grande section transversale permet à l’animal de se déplacer librement dans deux membranes d’isolement partiellement scellées permettant la croissance dans le canal avec un approvisionnement continu en nourriture. À l’aide de cette puce simple, l’imagerie de phénomènes de développement tels que la croissance du processus neuronal, le développement vulvaire et l’arborisation dendritique dans les neurones sensoriels PVD, à mesure que l’animal grandit à l’intérieur du canal, peut être effectuée. La puce de croissance et d’imagerie à long terme fonctionne avec une seule conduite de pression, pas de vannes externes, des consommables fluidiques peu coûteux et utilise des protocoles standard de manipulation des vers qui peuvent facilement être adaptés par d’autres laboratoires utilisant C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans s’est avéré être un puissant organisme modèle pour étudier la biologie cellulaire, le vieillissement, la biologie du développement et la neurobiologie. Des avantages tels que son corps transparent, son cycle de vie court, son entretien facile, un nombre défini de cellules, son homologie avec plusieurs gènes humains et sa génétique bien étudiée ont permis à C. elegans de devenir un modèle populaire à la fois pour les découvertes en biologie fondamentale et la recherche appliquée ^1,2. Comprendre les processus biologiques et développementaux des cellules à partir d’observa....

Protocol

1. Fabrication d’un dispositif de croissance et d’imagerie

1. Fabrication de moules SU8
   1. Concevez les modèles 1 (couche d’écoulement) et 2 (couche de contrôle) à l’aide de formes rectangulaires dans un logiciel de traitement de texte (ou un logiciel de CAO de conception assistée par ordinateur) et imprimez les photomasques à l’aide d’un traceur laser d’une taille minimale de 8 μm sur un film à base de polyester (Figure 1).
   2. Coupez les plaquettes de silicium en morceaux de 2,5 cm × 2,5 cm et nettoyez-les avec 20% de KOH pendant 1 min. Rincer les gaufrettes dans de l’eau désionisée (DI). Utilisez une ....

Results

Caractérisation de l’appareil : Le dispositif de croissance et d’imagerie se compose de deux couches PDMS liées ensemble (Figure 1) à l’aide d’une liaison plasma irréversible. La couche d’écoulement (modèle 1) de 10 mm de longueur et de 40 μm ou 80 μm de hauteur nous permet de cultiver l’animal en culture liquide (Figure 1A). La couche de piégeage (motif 2) a une membrane de 2 mm de large (Figure 1B) pour immobilis.......

Discussion

Dans cet article, un protocole pour la fabrication et l’utilisation d’un dispositif microfluidique simple pour la croissance de C. elegans avec un approvisionnement constant en nourriture et une imagerie à haute résolution d’un seul animal au cours de son développement a été décrit. Ce processus de fabrication est simple et peut être effectué dans un environnement non stérile. Un environnement sans poussière est essentiel pendant les étapes de fabrication. La présence de particules de poussière entraînerait un c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aiguilles 18 G	Sigma-Aldrich, Bangalore, Inde	Jauge 18
Robinet d’arrêt à 3 voies	Cole-Parmer	WW-30600-02	Raccord Masterflex avec
caméra CCD	Technologie Andor	EMCCD C9100-13no
Film de carte de circuit imprimé	Fine Line Imaging, Colorado, États-Unis		Les motifs sont imprimés avec 65 024 points par pouce (DPI)
Four à convection	Meta-Lab Scientific Industries, Inde	MSI-5
Lamelles Verre		de couverture microscopique Blue stat	22mm x 10Gms
Ethanol	Hi media
Harris uni-core puncher 1mm	Qiagen	Z708801
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich, Bangalore, Inde	440191
Plaque	chauffante  ; IKA	RCT B S 22
Isopropanol	Fisher Scientific	26895
KOH	Fisher Scientific
Microscope à balayage laser	ZEISS	LSM 5 LIVE
Pointes de micropipette	Tarsons		0.5-10 µ ; Les pointes de micropipette L sont utilisées pour l’approvisionnement alimentaire
Photoresist-1	Microchem	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2	Microchem	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Azote gazeux	Fournisseur local Azote	gazeux Commercial	Volume de la bouteille de 7 mètres cubes
PDMS (solution de durcissement)	Dow Corning Corporation, MI, États-Unis	; Solution de durcissement Sylgard	Agent de durcissement
Plaques de Petri	Praveen Scientific Corporation
Nettoyeur de plasma	Harrick Plasma, NY, États-Unis	; PDC-32G
Rasoir et lames Lame	chirurgicale Lister Élastomère
de silicium (base)	Dow Corning Corporation, MI, États-Unis	Sylgard 184	base base en élastomère
Tubes en silicone	Fisher Scientific		Tubes en plastique d’un diamètre intérieur de 1,59 mm et d’un diamètre extérieur de 3,18 mm
Plaquette de silicium	University Wafer, MA, États-Unis	[100] orientation, 4 pouces	De petits morceaux (2 mm & times ; 2 mm) ont été découpés dans des plaquettes de 100 mm de diamètre
Spin Coater	SPS-Europe B.V., Pays-Bas	SPIN 150
Microscope à disque rotatif	Perkin Elmer ultra-view VOX system	CSU-X1-A3 N	Le système a été équipé de quatre lasers (405/488/561/640 nm) et contrôlé par le progiciel Volocity.
Développeur SU8	Microchem, MA, États-Unis		SU8
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane	Sigma-Aldrich, Bangalore, Inde	448931	La vapeur de silane trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) est toxique
Lampe UV	Oriel Instruments, Bangalore, Inde		200 Watt et source de lumière UV collimatée
Logiciel de volocité	Perkin-Elmer		Image analyse