Article de méthode

Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

DOI :

10.3791/63136

⸱

11 avril 2022

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit une conception simple de puces microfluidiques et une méthodologie de microfabrication utilisées pour cultiver C. elegans en présence d’un approvisionnement alimentaire continu jusqu’à 36 heures. Le dispositif de croissance et d’imagerie permet également une imagerie intermittente à haute résolution à long terme des processus cellulaires et sous-cellulaires pendant le développement pendant plusieurs jours.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) s’est avéré être un système modèle précieux pour l’étude des processus biologiques du développement et cellulaires. La compréhension de ces processus biologiques nécessite souvent une imagerie à long terme et répétée du même animal. Les longs temps de récupération associés aux méthodes d’immobilisation conventionnelles effectuées sur des tampons de gélose ont des effets néfastes sur la santé animale, ce qui rend inapproprié l’imagerie répétée du même animal sur de longues périodes. Cet article décrit une conception de puce microfluidique, une méthode de fabrication, un protocole de culture sur puce de C. elegans et trois exemples d’imagerie à long terme pour étudier les processus de développement chez des animaux individuels. La puce, fabriquée avec du polydiméthylsiloxane et collée sur un verre de couverture, immobilise les animaux sur un substrat de verre à l’aide d’une membrane élastomère déviée à l’aide d’azote gazeux. L’immobilisation complète de C. elegans permet une imagerie accélérée robuste des événements cellulaires et subcellulaires sans anesthésie. Une géométrie de canal avec une grande section transversale permet à l’animal de se déplacer librement dans deux membranes d’isolement partiellement scellées permettant la croissance dans le canal avec un approvisionnement continu en nourriture. À l’aide de cette puce simple, l’imagerie de phénomènes de développement tels que la croissance du processus neuronal, le développement vulvaire et l’arborisation dendritique dans les neurones sensoriels PVD, à mesure que l’animal grandit à l’intérieur du canal, peut être effectuée. La puce de croissance et d’imagerie à long terme fonctionne avec une seule conduite de pression, pas de vannes externes, des consommables fluidiques peu coûteux et utilise des protocoles standard de manipulation des vers qui peuvent facilement être adaptés par d’autres laboratoires utilisant C. elegans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans s’est avéré être un puissant organisme modèle pour étudier la biologie cellulaire, le vieillissement, la biologie du développement et la neurobiologie. Des avantages tels que son corps transparent, son cycle de vie court, son entretien facile, un nombre défini de cellules, son homologie avec plusieurs gènes humains et sa génétique bien étudiée ont permis à C. elegans de devenir un modèle populaire à la fois pour les découvertes en biologie fondamentale et la recherche appliquée 1,2. Comprendre les processus biologiques et développementaux des cellules à partir d’observations répétées à long terme d’animaux individuels peut s’avérer bénéfique. Classiquement, C. elegans est anesthésié sur des tampons de gélose et imagé au microscope. Les effets indésirables des anesthésiques sur la santé des animaux limitent l’utilisation d’animaux anesthésiés pour l’imagerie intermittente à long terme et répétée du même animal 3,4. Les progrès récents des technologies microfluidiques et leur adaptation au piégeage sans anesthésie de C. elegans présentant des risques négligeables pour la santé permettent d’obtenir une imagerie à haute résolution du même animal sur une courte et longue période.

Des puces microfluidiques ont été conçues pour le criblage à haut débit 6,7,8 de C. elegans'5, le piégeage et la distribution9, le criblage de médicaments 10,11, la stimulation neuronale avec imagerie à haute résolution 12 et l’imagerie haute résolution de l’animal 12,13,14. Des feuilles microfluidiques ultra-minces pour l’immobilisation sur lames ont également été développées15. Des études à long terme sur C. elegans ont été réalisées à l’aide d’images à faible résolution d’animaux en culture liquide pour observer la croissance, la dynamique du calcium, les effets des médicaments sur leur comportement16,17,18,19, leur longévité et leur vieillissement20. Des études à long terme utilisant la microscopie à haute résolution ont été menées pour évaluer le développement synaptique21, la régénération neuronale 22 et l’addition mitochondriale23. L’imagerie et le traçage à haute résolution à long terme du devenir et de la différenciation des cellules ont été réalisés dans des dispositifs multicanaux24,25. Plusieurs événements cellulaires et sous-cellulaires se produisent sur des échelles de temps de plusieurs heures et nécessitent de piéger le même individu à différents moments de leur développement pour caractériser toutes les étapes intermédiaires du processus de compréhension de la dynamique cellulaire in vivo. Pour imager des processus biologiques tels que l’organogenèse, le développement neuronal et la migration cellulaire, l’animal doit être immobilisé dans la même orientation à plusieurs moments. Nous avons déjà publié un protocole d’imagerie à haute résolution de C. elegans pendant plus de 36 heures afin de déterminer où les mitochondries sont ajoutées le long des neurones récepteurs tactiles (TRN)23.

Cet article fournit un protocole pour établir une méthodologie basée sur la microfluidique pour l’imagerie répétée à haute résolution. Ce dispositif, avec un seul canal d’écoulement, est le mieux adapté à l’imagerie répétée d’un seul animal par appareil. Pour améliorer le débit et imager plusieurs animaux à la fois, plusieurs appareils pourraient être connectés à la même ligne de pression, mais avec des connecteurs tridirectionnels séparés contrôlant un seul animal dans chaque appareil. La conception est utile pour les études qui nécessitent des images accélérées à haute résolution telles que les processus de développement post-embryonnaire, la migration cellulaire, le transport des organites, les études d’expression génique, etc. La technologie pourrait être limitative pour certaines applications telles que les études sur la durée de vie et le vieillissement qui nécessitent une croissance et une imagerie parallèles de nombreux animaux à un stade avancé. L’élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) a été utilisé pour la fabrication de ce dispositif en raison de sa biostabilité26, de sa biocompatibilité27,28, de sa perméabilité au gazde 29,30 et de son module élastique accordable 31. Ce dispositif à deux couches permet la croissance d’animaux avec un approvisionnement continu en nourriture dans un canal microfluidique et le piégeage de C. elegans individuels via compression membranaire PDMS à l’aide d’azote gazeux. Ce dispositif est une extension du dispositif précédemment publié avec l’avantage de cultiver et d’imager le même animal dans le microcanal sous un approvisionnement alimentaire continu3. Le réseau de membranes d’isolement supplémentaires et une membrane de piégeage de 2 mm de large permettent une immobilisation efficace des animaux en développement. L’appareil a été utilisé pour observer le développement neuronal, le développement vulvaire et l’arborisation dendritique dans les neurones PVD sensoriels. Les animaux grandissent sans effets néfastes sur la santé dans le dispositif et peuvent être immobilisés à plusieurs reprises pour faciliter l’imagerie des événements subcellulaires chez le même animal au cours de son développement.

L’ensemble du protocole est divisé en cinq parties. La partie 1 décrit la fabrication du dispositif pour la puce de croissance et d’imagerie. La partie 2 décrit comment mettre en place un système de pression pour la déviation de la membrane PDMS afin d’immobiliser et d’isoler les individus de C. elegans. La partie 3 décrit comment synchroniser C. elegans sur une plaque de milieu de croissance de nématodes (NGM) pour l’imagerie de dispositifs. La partie 4 décrit comment charger un seul animal dans le dispositif et faire grandir l’animal à l’intérieur du dispositif microfluidique pendant plusieurs jours. La partie 5 décrit comment immobiliser un animal individuel à plusieurs moments, capturer des images haute résolution en utilisant différents objectifs et analyser les images à l’aide de Fidji.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabrication d’un dispositif de croissance et d’imagerie

  1. Fabrication de moules SU8
    1. Concevez les modèles 1 (couche d’écoulement) et 2 (couche de contrôle) à l’aide de formes rectangulaires dans un logiciel de traitement de texte (ou un logiciel de CAO de conception assistée par ordinateur) et imprimez les photomasques à l’aide d’un traceur laser d’une taille minimale de 8 μm sur un film à base de polyester (Figure 1).
    2. Coupez les plaquettes de silicium en morceaux de 2,5 cm × 2,5 cm et nettoyez-les avec 20% de KOH pendant 1 min. Rincer les gaufrettes dans de l’eau désionisée (DI). Utilisez une plaquette pour le flux et la couche de contrôle.
      ATTENTION : KOH est corrosif et doit être manipulé avec précaution.
    3. Sécher les morceaux avec de l’azote gazeux comprimé de 14 psi suivi d’une déshydratation sur une plaque chauffante à 120 °C pendant 4 h. Avant de passer à l’étape suivante, refroidissez les deux morceaux à température ambiante.
    4. Prenez l’un des morceaux de silicium et placez-le sur le mandrin d’un enrobage et allumez l’aspirateur pour maintenir la plaquette en place. Sur la pièce de silicium, mettez ~20 μL d’hexaméthyldisilane (HMDS) et enduisez-la à l’aide de l’enrobage à 500 rotations par minute (tr/min) pendant 5 s suivies de 3 000 tr/min pendant 30 s.
      ATTENTION : Cette étape doit être effectuée à la lumière jaune. N’utilisez pas de lumière blanche dans la pièce.
    5. Pour obtenir une épaisseur de résine photosensible uniforme de ~40 μm (spécifique à la couche d’écoulement; adaptée à l’imagerie des animaux des premiers stades larvaires 1 à 3 (L1 - L3)), enduisez la plaquette de silicium de ~1,5 mL de photorésine négative-1 à l’aide d’un enduit de spin à 500 tr / min pendant 5 s suivi de 2 000 tr / min pendant 30 s.
    6. Répétez les étapes 1.1.4 et 1.1.5 avec la deuxième plaquette pour obtenir une épaisseur de résine photosensible uniforme de ~40 μm spécifique à la couche de contrôle.
    7. Alternativement, pour augmenter l’épaisseur de la couche d’écoulement à ~80 μm pour les animaux plus âgés, enduisez les plaquettes de silicium avec ~1,5 mL de photorésine négative-2 en utilisant l’enrobage de spin à 500 tr / min pendant 5 s suivi de 2 000 tr / min pendant 30 s. Cette épaisseur convient aux animaux du stade L3 à des animaux adultes.
      ATTENTION: Tenez les plaquettes de silicium par leurs côtés pour éviter d’endommager les couches enduites de spin. Gardez les lumières blanches éteintes pendant cette étape.
    8. Cuire les morceaux de silicium revêtus de résine photosensible (pour les couches d’écoulement et de contrôle) sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 1 min, puis 95 °C pendant 10 min. Refroidir les morceaux cuits au four à température ambiante.
      REMARQUE: Les morceaux de silicium cuits peuvent être stockés pendant une journée avant de passer à l’étape suivante. Conserver dans l’obscurité et ne pas exposer à la lumière blanche.
    9. Placez des morceaux de silicium cuits mollement sur la platine d’exposition de l’illuminateur UV avec la surface revêtue de résine photosensible face à la lampe UV. Exposez les deux pièces séparément aux UV pendant 15 s, à l’aide d’une lampe de 200 W, à travers un photomasque avec les motifs 1 et 2 pour obtenir les couches de flux et de contrôle, respectivement.
      ATTENTION : Portez des lunettes de sécurité et évitez l’exposition directe aux rayons UV. N’allumez pas la lumière blanche dans la pièce pendant cette étape.
    10. Cuire les deux morceaux de silicium exposés avec la couche enduite vers le haut, à 65 °C suivie de 95 °C pendant 1 min et 10 min respectivement. Refroidissez les morceaux à température ambiante avant de passer à l’étape suivante.
    11. Développer les motifs en trempant les morceaux de silicium dans la solution de révélateur de résine photosensible (dilution 1:3 du révélateur dans l’isopropanol) pendant 20 min. Une fois le motif visible, rincez les morceaux avec de l’alcool isopropylique pur (IPA) et séchez-les doucement à l’azote gazeux (14 psi).
      ATTENTION : Utilisez un environnement bien ventilé pour ce traitement chimique afin d’éviter l’exposition humaine. Utilisez la lumière blanche uniquement après que les caractéristiques ont été développées et rincées avec de l’IPA.
    12. Gardez les morceaux de silicium dans un dessiccateur avec la surface revêtue vers le haut. Exposez les morceaux aux vapeurs de silane en versant 50 μL de trichloro pur (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane sur un petit gobelet en plastique ou une lame de verre. Placez la tasse / lame à l’intérieur d’un dessiccateur et incuber pendant 2 h.
      ATTENTION : Évitez l’exposition directe à la vapeur de silane. Utilisez toujours une chambre scellée pour le traitement de la vapeur de silane.
      REMARQUE: Si nécessaire, les morceaux de silicium développés peuvent être stockés pendant 1-2 jours avant de passer à l’étape suivante.
  2. Fabrication de puces PDMS
    1. Fabriquez le PDMS dans un gobelet en plastique en mélangeant la base en élastomère avec l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Bien mélanger le contenu en remuant constamment pendant 3 min. Le mélange créera beaucoup de bulles d’air dans le mélange PDMS.
    2. Dégazez le mélange PDMS dans un dessiccateur pendant 30 minutes pour éliminer toutes les bulles d’air.
      ATTENTION : Assurez-vous que les bulles d’air sont retirées du mélange PDMS avant qu’il ne soit versé sur les fonctionnalités, car les bulles peuvent causer des dispositifs défectueux et non fonctionnels.
    3. Placez les plaquettes de silicium avec la couche de contrôle (motif 2) dans une boîte de Pétri. Versez doucement une couche de mélange PDMS de 5 mm d’épaisseur sur la pièce de silicium en évitant toute formation de bulles.
    4. Dégazez le mélange PDMS dans un dessiccateur pour éliminer les bulles supplémentaires qui se forment pendant le processus de coulée PDMS.
    5. Placez la plaquette de silicium avec couche d’écoulement (modèle 1) sur le mandrin de spinner en appliquant une pression de vide de 200 à 500 mTorr pour maintenir la plaquette. Versez ~1 mL de PDMS sur la plaquette de silicium et enduisez-la à l’aide d’un enrobage à 500 tr/min pendant 5 s suivi de 1 000 tr/min pendant 30 s pour obtenir une couche de ~80 μm d’épaisseur.
    6. Cuire les deux plaquettes de silicium avec le PDMS enduit d’essorage et verser les couches de PDMS à 50 °C dans un four à convection à air chaud pendant 6 h. Après la cuisson, attendez que les morceaux refroidissent à température ambiante.
    7. Coupez la couche PDMS de 5 mm d’épaisseur de la pièce de silicium autour de la couche de contrôle (modèle 2) à l’aide d’une lame tranchante et décollez-la du substrat de silicium.
    8. Poinçonner deux trous de ~1 mm de diamètre à l’aide d’un poinçonneur Harris au réservoir du bloc PDMS pour connecter le canal d’immobilisation et les entrées du canal d’isolement aux conduites de gaz pour les déviations de membrane PDMS.
    9. Placez la pièce de silicium avec la couche PDMS revêtue de spin sur le motif 1 (couche d’écoulement), avec la surface revêtue de PDMS vers le haut, sur un plateau en plastique. Gardez le bloc PDMS perforé avec le motif 2 (couche de contrôle) sur le plateau avec le côté moulé vers le haut.
    10. Gardez le plateau en plastique à l’intérieur d’un nettoyeur plasma et exposez les deux surfaces PDMS à un plasma d’air de 18 W pendant 2 min sous vide doux (200-600 mTorr). Appliquez le vide jusqu’à ce que la chambre devienne violet vif. Effectuez cette étape sous une faible luminosité pour voir la couleur du plasma changer.
    11. Retirez les deux blocs traités au plasma et liez-les doucement en pressant les surfaces traitées au plasma des motifs 1 et 2 ensemble. Cuire les motifs collés à 50 °C pendant 2 h dans un four à convection à air chaud.
    12. Sortez l’appareil collé du four. Découpez le dispositif collé dans une tranche de silicium avec les modèles 1 et 2, et percez des trous dans les réservoirs d’entrée et de sortie de la couche d’écoulement à l’aide du perforateur Harris.
    13. Placez le bloc PDMS collé avec la couche d’écoulement vers le haut sur un plateau en plastique. Gardez un verre de couverture propre (#1.5) sur le même plateau. Exposez les blocs et le verre de couverture à un plasma d’air de 18 W pendant 2 min. Ajustez la pression du vide pour voir une chambre violette.
      REMARQUE: Cette étape doit être effectuée en basse lumière pour voir la couleur du plasma changer. Pour nettoyer le verre de couverture, lavez-le avec de l’IPA et séchez-le à l’azote gazeux à 14 psi.
    14. Placer le bloc PDMS exposé au plasma sur le verre de couverture et cuire la structure collée dans une étuve à 50 °C pendant 2 h. Rangez l’appareil dans une chambre propre pour toute expérience future.

2. Amorçage de membrane PDMS

  1. Prenez l’appareil et mettez-le sur un stéréomicroscope et fixez les tubes. Connectez le tube micro flex (diamètre intérieur ~5 mm, diamètre extérieur ~8 mm) à une conduite d’azote gazeux comprimé à une extrémité. Connectez un connecteur à trois voies à l’autre extrémité. Les tubes 1 et 2 des connecteurs à trois voies seront connectés respectivement au piège et aux membranes isolantes.
  2. Connectez deux tubes micro flex (diamètre intérieur ~1,6 mm, diamètre extérieur ~5 mm) aux deux orifices de sortie du robinet d’arrêt à trois voies. Connectez l’autre extrémité des deux tubes à une aiguille de 18 G de 8 mm de long.
  3. Remplissez la couche d’écoulement avec un tampon M9 à l’aide d’une micropipette à travers l’orifice d’entrée. Remplissez les deux tubes avec de l’eau DI par l’extrémité reliée à l’aiguille. Insérez les deux aiguilles dans les trous perforés, en reliant respectivement la membrane d’isolement et la membrane de piégeage.
  4. Ouvrez le régulateur d’azote gazeux à 14 psi et tournez la vanne à trois voies du tube 1 pour pousser l’eau dans l’appareil à travers les canaux microfluidiques dans les couches de contrôle, à savoir le piège et les membranes d’isolement.
  5. Attendez que l’eau remplisse le canal sans la présence de gouttelettes d’air dans les deux canaux. Une fois que les canaux sont complètement remplis d’eau, les canaux sont considérés comme amorcés.
  6. Relâchez la pression à l’aide du robinet d’arrêt à trois voies une fois que les canaux sont remplis d’eau et amorcés. L’amorçage peut conduire à des bulles dans la couche d’écoulement, éliminer les bulles en faisant circuler des fluides supplémentaires à travers le canal d’écoulement.

3. Maintenance et synchronisation de C. elegans

NOTE: Souches de C. elegans: L’étude a utilisé les transgènes suivants PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) pour le développement vulvaire 32, jsIs609 (mec7p::MLS(mitochondrial matrix localization signal)::GFP)33 pour le développement des neurones récepteurs tactiles (TRN) et l’imagerie du transport des mitochondries, et wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) pour suivre le développement PVD 34. Le protocole de culture et d’entretien standard de C. elegans a été suivi35.

  1. Cultiver C. elegans sur les plaques de Petri du milieu de croissance des nématodes (NGM) avec E. coli OP50 comme source de nourriture à 22 °C. Entretenez les souches de C. elegans en transférant à plusieurs reprises quelques hermaphrodites ou en morcelant une petite quantité de gélose avec quelques animaux dans une nouvelle plaque NGM avec une pelouse OP50.
  2. Après 3-5 jours, vérifiez la plaque NGM pour la croissance des animaux et les œufs de C. elegans. Recueillir et transférer environ 30 œufs d’une assiette vers une assiette NGM fraîche avec pelouse OP50.
  3. Pour synchroniser les animaux à des fins d’imagerie, transférer tous les œufs non éclos de l’assiette toutes les 2 heures dans une assiette fraîche et les maintenir à 22 °C. Environ 15 à 20 œufs éclosent dans chaque assiette.
  4. Cueillir les animaux entre 14-16 h et 28-30 h après l’éclosion pour les stades larvaire 2 (L2) et larvaire 3 (L3), respectivement. Transférer les animaux dans le dispositif microfluidique pour l’imagerie. Ajoutez de la nourriture comme décrit dans la section suivante pour maintenir l’animal à l’intérieur de l’appareil pour une croissance à long terme et des expériences d’imagerie.

4. Croissance de C. elegans à l’intérieur du dispositif microfluidique de croissance et d’imagerie

  1. Montez un dispositif microfluidique de croissance et d’imagerie sur un microscope inversé et observez le modèle 2, après avoir connecté les membranes d’isolement et la membrane d’immobilisation, à faible grossissement (4x ou 10x). Assurez-vous que les canaux sont remplis d’eau distillée propre.
  2. Préparer une solution fraîche de 1 L de milieu S en utilisant 10 mL de citrate de potassium 1 M pH 6,0, 10 mL de solution de métaux traces, 3 mL de 1 M CaCl2, 3 mL de 1 M MgSO4. Préparer la solution dans des conditions stériles. Ne pas autoclaver le milieu S.
  3. Remplir le canal d’écoulement avec un milieu de croissance (milieu S) 10 min avant l’expérience. Évitez les bulles d’air dans le canal d’écoulement. Écoulez du fluide supplémentaire si nécessaire pour éliminer les bulles d’air.
  4. Prélever un seul animal au stade de développement requis dans une plaque de NGM dans 10 μL de milieu S à l’aide d’une micropipette et pousser l’animal dans le canal d’écoulement à travers le trou d’entrée.
  5. Surveillez la position de l’animal dans le canal d’écoulement à l’aide d’un objectif de faible grossissement. Écoulez un fluide supplémentaire à travers l’entrée ou la sortie pour pousser l’animal et positionnez-le dans le canal d’écoulement restreint entre les deux membranes d’isolement.
  6. Ouvrez le robinet d’arrêt à trois voies pour appliquer une pression de 14 psi dans les canaux d’isolement et pousser les membranes vers le bas dans le canal d’écoulement.
    REMARQUE : La membrane scelle partiellement le canal d’écoulement et restreint le mouvement des animaux à la région située entre les deux membranes d’isolement.
  7. Utiliser une seule colonie d’E. coli OP50 dans une plaque striée pour inoculer 250 mL de bouillon L (2,5 g de bacto-tryptone, 1,25 g de levure bacto, 1,25 g de NaCl dansH2O). Cultiver la culture inoculée pendant la nuit à 37 °C.
  8. Aliquote 500 μL de culture OP50 dans des tubes centrifugés stériles de 1,5 mL et conserver le stock et l’aliquote pendant 2 semaines à 4 °C.
  9. Enduire la culture OP50 par centrifugation à 1,3 x g pendant 5 min. Dissoudre la pastille avec 1 mL de milieu S frais (dilution 0,5x) et la conserver à température ambiante pendant 3-4 jours. Utilisez cet OP50 dilué pour nourrir C. elegans à l’intérieur de dispositifs microfluidiques.
  10. Laisser une goutte de milieu S au-dessus des réservoirs d’entrée et de sortie pour réduire l’évaporation du milieu S dans le canal d’écoulement.
  11. Prendre la solution diluée d’OP50 dans une micropipette de 10 μL. Retirez la micropointe remplie de la solution OP50 de la pipette et appuyez sur l’embout dans le réservoir d’admission. Placez ensuite une autre pointe de micropipette avec 10 μL de solution alimentaire et insérez-la dans le réservoir de sortie.
  12. Scellez la tête de pointe en appliquant une pression à l’aide d’un doigt pour assurer la continuité des solutions alimentaires sans entrefer d’air. Changez l’embout de la micropipette avec la solution OP50 tous les jours qui ne datent pas de plus de 3-4 jours.
  13. Remplissez 20 à 30 μL supplémentaires de solution alimentaire dans les deux pointes. Ajouter ou retirer la solution alimentaire à l’extrémité de la micropipette pour ajuster le gradient pour pousser l’animal dans le canal d’écoulement et pour ajuster la position de l’animal sous la membrane de piégeage pour l’imagerie.
  14. Surveillez le flux de bactéries pour vous assurer qu’il est continu à travers les membranes d’isolement partiellement fermées dans le canal d’écoulement à l’aide d’images en fond clair.
    REMARQUE: En l’absence de flux de bactéries, les animaux peuvent manger les bactéries disponibles dans le canal d’écoulement entre les deux membranes d’isolement. En cas d’absence de bactéries ou d’écoulement dans le canal, remplacez les deux embouts de micropipette à l’entrée et à la sortie par de nouveaux embouts de pipette remplis de denrées fraîchement préparées.

5. Immobilisation et imagerie de C. elegans

  1. Immobilisation de C. elegans sous la membrane de piégeage
    1. Localisez un seul animal dans le canal de croissance à faible grossissement. Ajustez les hauteurs de la solution alimentaire dans les deux pointes de micropipettes reliées aux réservoirs d’entrée et de sortie. Poussez l’animal dans la direction requise en utilisant les différences de pression hydrostatique dans le canal d’écoulement.
    2. Placez l’animal au centre de la membrane de piégeage et surveillez son comportement de nage à l’aide d’un objectif de faible grossissement (4x).
    3. Tournez le robinet d’arrêt à trois voies pour augmenter lentement la pression dans le canal de piège. Immobiliser l’animal sous la membrane du piège dans une posture droite le long de la paroi du canal de croissance.
      ATTENTION : Évitez de piéger l’animal à travers le canal d’écoulement en position de courbure Z ou U. Cela provoque une pression accrue sur le corps de l’animal et provoque des dommages permanents à sa santé.
  2. Imagerie et libération de C. elegans à partir de la membrane
    1. Transportez et chargez l’appareil sur une platine de microscope. Installez un microscope inversé aux paramètres d’imagerie souhaités avec tous les composants optiques nécessaires (objectif, source lumineuse, filtres de fluorescence et détecteur) pour un champ lumineux à haute résolution, un contraste d’imagerie différentiel (DIC) ou une imagerie par fluorescence (Figure supplémentaire 1).
    2. Acquérir une ou plusieurs images de fluorescence time-lapse pour capturer les événements cellulaires et subcellulaires.
    3. Acquérir des images de fluorescence des neurones de C. elegans en fonction de leur développement à l’aide d’un objectif 60x, 1,4 ouverture numérique (NA), d’un laser de longueur d’onde de 488 nm avec une puissance laser de 7% à 10%, d’une caméra CCD, sur un microscope à disque rotatif. Effectuez des images accélérées à l’aide du logiciel fourni avec le microscope et obtenez des images à une vitesse de 4 images par seconde (Figure supplémentaire 1).
    4. Après l’acquisition des images, relâchez la pression de piégeage et surveillez la locomotion de l’animal à faible grossissement - 4x et 10x. Garder l’animal restreint dans la région définie par des membranes isolantes (maintenues en dessous de 14 psi tout au long de l’expérience).
    5. Ajustez le volume de solution alimentaire dans les deux pointes de micropipette pour poursuivre un flux alimentaire lent entraîné par gravité dans le canal de croissance. Ce flux alimentaire est obtenu en ajustant les niveaux des solutions alimentaires dans des micropipettes à l’entrée et à la sortie (généralement 1-5 mm de différence de hauteur).
    6. Visualisez l’écoulement sous un champ lumineux à partir du schéma d’écoulement des bactéries dans le canal de croissance.
      REMARQUE: En l’absence de flux, l’animal mange les bactéries OP50 disponibles, le canal semble dégagé et l’animal meurt de faim en quelques heures. Un animal affamé développe généralement une autofluorescence élevée, facilement observable lors de l’acquisition d’images de fluorescence accélérées. De tels événements ont des effets néfastes sur la physiologie animale et ont été évités dans les expériences.
    7. Répétez les étapes 5.2.1 à 5.2.3 après un intervalle de temps prédéterminé pour acquérir des images de fluorescence/CIV/champ clair du même individu à plusieurs points temporels.
    8. Une fois que les images sont acquises à plusieurs points temporels souhaités du même animal, relâchez la pression d’isolement et de piégeage. Rincez le canal avec un tampon M9 et poussez l’animal à travers le réservoir d’entrée. Récupérez l’animal du réservoir et placez-le sur une plaque NGM fraîche pour une surveillance plus poussée de la santé.
    9. Rincez le canal avec un tampon M9 plusieurs fois pour éliminer les bactéries. Rincer le canal d’écoulement avec de l’alcool éthylique à 70% (dilué dans de l’eau distillée). Sécher les canaux en poussant l’air à l’aide d’une seringue. Conservez l’appareil dans un endroit sec et exempt de poussière pour une utilisation répétée à l’avenir.
  3. Analyse d’images et statistiques
    1. Utilisez le logiciel FIJI ImageJ pour l’analyse d’images tiff. Ouvrez les images tiff des images accélérées PVD des animaux wdIs51 dans Fiji ImageJ. Extrayez les meilleurs plans de la pile de z-planes montrant les processus principaux en sélectionnant l’onglet Image > Stacks > Z project.
    2. Examinez toute la série d’images et trouvez des cadres d’images spécifiques qui couvrent avec succès l’ensemble des processus neuronaux en utilisant des sections qui se chevauchent des cadres d’images d’animaux. Sélectionnez Plugin > Analyze > Cell Counter dans la barre d’outils FIJI. Cela ouvrira une fenêtre pour numéroter les différentes branches et garder un compte de chaque neurone sélectionné.
    3. Sélectionnez Initialiser > compteurs > Type1, puis marquez les branches secondaires. Sélectionnez ensuite Type 2 et marquez Quaternaire, cliquez sur Fenêtre Résultats affichant le nombre de toutes les branches (Figure supplémentaire 2). Cette méthode affichera les branches déjà comptées.
    4. Ouvrez l’image qui se chevauche ensuite et comptez les branches restantes. Ce processus permettra d’éviter le double comptage et de s’assurer que chaque processus est compté. Identifier et compter le nombre total de branches primaires présentes dans les premiers stades larvaires de C. elegans. Effectuer une analyse similaire pour les images des processus secondaires et quaternaires chez les animaux plus âgés.
      REMARQUE: Les adultes montrent de nombreux processus qui innervent les muscles de la paroi corporelle et peuvent être difficiles à compter. Assurez-vous que chaque processus n’est compté qu’une seule fois.
    5. Calculer la distance entre les corps cellulaires PVD chez les animaux wdIs51 en traçant une ligne segmentée du corps cellulaire PVD (CB) au PVC CB. Pour les animaux au stade larvaire 4 (L4), les corps cellulaires sont éloignés les uns des autres et ne sont pas dans le même cadre lorsqu’ils sont imagés avec un objectif 60x.
    6. Sélectionnez les images qui se chevauchent dans la pile pour couvrir toute la longueur de l’animal de la tête à la queue à l’aide de l’onglet Image > du projet Piles > Z d’ImageJ. Tracez des lignes segmentées le long du processus neuronal entre les CB PVD et PVC.
    7. Mesurez les longueurs de toutes les lignes segmentées à l’aide d’ImageJ > Analyser > mesurer. Additionnez les longueurs de tous les segments pour calculer la distance totale entre PVD et PVC CB pour chaque point temporel.
    8. Pour la longueur des neurones des NRT chez les animaux jsIs609 , chargez les images aux Fidji. Tracez une ligne segmentée le long des microtubules latéraux postérieurs (PLM; visibles avec la GFP soluble) du corps cellulaire au centroïde de la première mitochondrie. Calculez la longueur de la ligne pour la première valeur de distance.
    9. Tracez une ligne segmentée du centre de la première à la deuxième mitochondrie. Répétez ce processus pour chaque paire de mitochondries jusqu’à la fin de la longueur du processus neuronal. Additionnez toutes les longueurs pour calculer la longueur totale du processus neuronal.
    10. Pour l’analyse de la lignée cellulaire, chargez toutes les images vulvaires aux Fidji et extrayez la meilleure image de mise au point des cellules à partir des images accélérées de plusieurs plans z.
    11. Représenter les données sous forme de moyenne ± d’erreur-type de la moyenne (MEB). Calculer la signification statistique à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle pour plus de deux échantillons ou d’un test t à deux échantillons pour une paire d’échantillons. Indiquer la signification par une valeur de p < 0,05 (*), une valeur de p < 0,005 (**) et une valeur de p > 0,05 (ns, non significatif).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caractérisation de l’appareil : Le dispositif de croissance et d’imagerie se compose de deux couches PDMS liées ensemble (Figure 1) à l’aide d’une liaison plasma irréversible. La couche d’écoulement (modèle 1) de 10 mm de longueur et de 40 μm ou 80 μm de hauteur nous permet de cultiver l’animal en culture liquide (Figure 1A). La couche de piégeage (motif 2) a une membrane de 2 mm de large (Figure 1B) pour immobilis...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cet article, un protocole pour la fabrication et l’utilisation d’un dispositif microfluidique simple pour la croissance de C. elegans avec un approvisionnement constant en nourriture et une imagerie à haute résolution d’un seul animal au cours de son développement a été décrit. Ce processus de fabrication est simple et peut être effectué dans un environnement non stérile. Un environnement sans poussière est essentiel pendant les étapes de fabrication. La présence de particules de poussière entraînerait un c...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. et S.P.K. sont les auteurs d’un brevet en instance sur le dispositif de croissance microfluidique et d’imagerie (demande numéro de brevet 640/CHE/2011).

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le centre d’imagerie CIFF, NCBS pour l’utilisation des microscopes confocaux soutenus par le DST - Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005). Nous remercions le financement de la recherche de DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), disque rotatif soutenu par DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK et Gautam Menon), et HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK). Les souches HB101, PS3239 et wdIs51 ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center (CGC), financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. a fabriqué jsIs609 dans le laboratoire de Mike Nonet.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguilles 18 GSigma-Aldrich, Bangalore, IndeJauge 18
Robinet d’arrêt à 3 voiesCole-ParmerWW-30600-02Raccord Masterflex avec
caméra CCDTechnologie AndorEMCCD C9100-13no
Film de carte de circuit impriméFine Line Imaging, Colorado, États-UnisLes motifs sont imprimés avec 65 024 points par pouce (DPI)
Four à convectionMeta-Lab Scientific Industries, IndeMSI-5
Lamelles Verrede couverture microscopique Blue stat22mm x 10Gms
EthanolHi media
Harris uni-core puncher 1mmQiagenZ708801
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich, Bangalore, Inde440191
Plaquechauffante  ; IKARCT B S 22
IsopropanolFisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
Microscope à balayage laserZEISSLSM 5 LIVE
Pointes de micropipetteTarsons0.5-10 µ ; Les pointes de micropipette L sont utilisées pour l’approvisionnement alimentaire
Photoresist-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2MicrochemSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Azote gazeuxFournisseur local Azotegazeux CommercialVolume de la bouteille de 7 mètres cubes
PDMS (solution de durcissement)Dow Corning Corporation, MI, États-Unis  ; Solution de durcissement SylgardAgent de durcissement
Plaques de PetriPraveen Scientific Corporation
Nettoyeur de plasmaHarrick Plasma, NY, États-Unis  ; PDC-32G
Rasoir et lames Lamechirurgicale Lister Élastomère
de silicium (base)Dow Corning Corporation, MI, États-UnisSylgard 184base base en élastomère
Tubes en siliconeFisher ScientificTubes en plastique d’un diamètre intérieur de 1,59 mm et d’un diamètre extérieur de 3,18 mm
Plaquette de siliciumUniversity Wafer, MA, États-Unis[100] orientation, 4 pouces De petits morceaux (2 mm & times ; 2 mm) ont été découpés dans des plaquettes de 100 mm de diamètre
Spin CoaterSPS-Europe B.V., Pays-BasSPIN 150
Microscope à disque rotatifPerkin Elmer ultra-view VOX systemCSU-X1-A3 NLe système a été équipé de quatre lasers (405/488/561/640 nm) et contrôlé par le progiciel Volocity.
Développeur SU8Microchem, MA, États-UnisSU8
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silaneSigma-Aldrich, Bangalore, Inde448931La vapeur de silane trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) est toxique
Lampe UVOriel Instruments, Bangalore, Inde200 Watt et source de lumière UV collimatée
Logiciel de volocitéPerkin-ElmerImage analyse
Luer lock Développeur

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037(2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023(2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530(2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192(2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500(2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499(2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938(2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Long Term ImagingWorm ImmobilizationPDMS DeviceNeuronal Process GrowthDendritic ArborizationNitrogen Gas ImmobilizationTime Lapse ImagingDevelopmental Biology

Articles connexes