Spectroscopie CD pour étudier les interactions ADN-protéine

Résumé

L’interaction d’un remodeleur de chromatine dépendant de l’ATP avec un ligand d’ADN est décrite à l’aide de la spectroscopie CD. Les changements conformationnels induits sur un promoteur de gène analysés par les pics générés peuvent être utilisés pour comprendre le mécanisme de régulation transcriptionnelle.

Résumé

La spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) est une méthode simple et pratique pour étudier la structure secondaire et les interactions des biomolécules. Les progrès récents de la spectroscopie CD ont permis d’étudier en détail les interactions ADN-protéine et la dynamique conformationnelle de l’ADN dans différents microenvironnements pour une meilleure compréhension de la régulation transcriptionnelle in vivo. La zone autour d’une zone de transcription potentielle doit être déroulée pour que la transcription se produise. Il s’agit d’un processus complexe nécessitant la coordination des modifications des histones, la liaison du facteur de transcription à l’ADN et d’autres activités de remodelage de la chromatine. En utilisant la spectroscopie CD, il est possible d’étudier les changements conformationnels dans la région promotrice causés par les protéines régulatrices, telles que les remodeleurs de chromatine dépendants de l’ATP, pour favoriser la transcription. Les changements conformationnels qui se produisent dans la protéine peuvent également être surveillés. En outre, les questions concernant l’affinité de la protéine pour son ADN cible et la spécificité de la séquence peuvent être traitées en incorporant des mutations dans l’ADN cible. En bref, la compréhension unique de cette méthode sensible et peu coûteuse peut prédire les changements dans la dynamique de la chromatine, améliorant ainsi la compréhension de la régulation transcriptionnelle.

Introduction

Le dichroïsme circulaire (CD) est une technique spectroscopique qui repose sur la chiralité inhérente des macromolécules biologiques qui conduit à l’absorption différentielle de la lumière polarisée circulairement pour droitiers et gauchers. Cette absorption différentielle est connue sous le nom de dichroïsme circulaire. La technique peut donc être utilisée pour délimiter la conformation des macromolécules biologiques, telles que les protéines et l’ADN, qui contiennent toutes deux des centres ^chiraux1,2.

Les ondes électromagnétiques contiennent à la fois des composants électriques e....

Protocole

1. Concentration en fonction des composants de la réaction

1. Préparer à nouveau les concentrations de travail des tampons pour la MC et d’autres composants de réaction (voir tableau 1) et les maintenir à 4 °C avant de mettre en place les réactions.
   REMARQUE: Pour les réactions CD décrites dans le présent article, les concentrations de travail des composants sont les suivantes: tampon phosphate de sodium (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, ADN 500 nM, protéine 1 μM, _MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. Activité ATPase

1. Avant la spectroscopie CD, établissez l’ac....

Résultats

ADAAD stabilise une structure en forme de boucle de tige sur le promoteur MYC
Des preuves expérimentales antérieures ont montré que SMARCAL1 est un régulateur négatif de MYC29. L’analyse de la région promotrice de 159 pb de long du gène MYC par le cartographe QGRS a montré que le brin avant avait le potentiel de former un G-quadruplex (tableau 2). Mfold a montré que les deux brins de l’ADN MYC

Discussion

Le but de cet article est d’introduire la technique de spectroscopie CD comme une approche pour étudier les changements conformationnels se produisant dans l’ADN en présence de protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP et de lier ces changements conformationnels à l’expression des gènes. La spectroscopie CD fournit une méthode rapide et facilement accessible pour étudier les changements conformationnels dans l’ADN.

Un point crucial à considérer pour cette technique .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Mercaptoethanol	Fisher scientific	O3446I-100
Adénosine 5&prime ;-triphosphate disodium sel hydraté	Sigmaaldrich	A2383
CD Quartz Cuvette	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 Spectromètre CD	Photophysique appliquée	Non disponible
EDTA Sel disodique Dihydrate	SRL	43272
Glutathion Sépharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	Chromatographie d’affinité au glutathion
Solution de nettoyage Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
L-Lactic déshydrogénase	Sigmaaldrich	; L2625
Acétate de magnésium tétrahydraté	Fisher scientific	BP215-500
Chlorure de magnésium hexahydraté	Fisher scientific	M33-500
Sel disodique NADH	Sigmaaldrich	10107735001
Phosphoenolpyruvate Sel de monocyclohexylammonium	SRL	40083
Acétate de potassium	Fisher scientific	P178-3
Pyruvate kinase	Sigmaaldrich	P1506
Phosphate de sodium dibasique Anhydre	Fisher scientific	S374-500
Phosphate de sodium monobasique Monohydraté	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT lecteur de microplaques	BioTek	Non disponible
Tris Base	Fisher scientific	BP152-500