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Article de méthode

Ex Vivo Perfusion hépatique à travers la veine porte chez la souris

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DOI :

10.3791/63154

⸱

9 mars 2022

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida

Dans cet article

Résumé

Le protocole décrit une méthode simple de résection d’un foie de souris intact pour des études métaboliques par perfusion veineuse porte.

Résumé

Les maladies métaboliques telles que le diabète, le prédiabète, la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) et la stéatohépatite non alcoolique (NASH) sont de plus en plus courantes. Les perfusions hépatiques ex vivo permettent une analyse complète du métabolisme hépatique à l’aide de la résonance magnétique nucléaire (RMN), dans des conditions nutritionnelles qui peuvent être rigoureusement contrôlées. Comme les simulations in silico restent un moyen principalement théorique d’évaluer les actions hormonales et les effets de l’intervention pharmaceutique, le foie perfusé reste l’un des bancs d’essai les plus précieux pour comprendre le métabolisme hépatique. Comme ces études guident les connaissances de base sur la physiologie hépatique, les résultats doivent être précis et reproductibles. Le plus grand facteur de reproductibilité de la perfusion hépatique ex vivo est la qualité de la chirurgie. Par conséquent, nous avons introduit une méthode organisée et rationalisée pour effectuer des perfusions hépatiques de souris ex vivo dans le contexte d’expériences de RMN in situ . Nous décrivons également une application unique et discutons des problèmes courants rencontrés dans ces études. L’objectif global est de fournir un guide simple d’une technique que nous avons affinée au cours de plusieurs années et que nous considérons comme la norme d’or pour obtenir des résultats reproductibles dans les résections et perfusions hépatiques dans le cadre d’expériences de RMN in situ . La distance au centre du champ pour l’aimant ainsi que l’inaccessibilité du tissu à l’intervention pendant l’expérience RMN rendent nos méthodes nouvelles.

Introduction

Les perfusions ex vivo sont cruciales dans l’étude du métabolisme hépatique, et la perfusion par la veine porte est la norme pour ces études. Afin d’étudier le métabolisme hépatique isolément, le foie doit être réséqué du corps pour éviter les complications découlant du métabolisme dans d’autres organes (c.-à-d. le métabolisme du corps entier) et pour exercer un contrôle sur la disponibilité des hormones (insuline, glucagon, etc.). Cette approche peut être essentielle pour comprendre les effets de maladies telles que le diabète, la NAFLD et la NASH sur le métabolisme hépatique ainsi que les mécanismes d’action des médicaments. Cet article sert de guide pour la résection hépatique et la perfusion. Nous avons développé une procédure simplifiée pour effectuer ces études métaboliques du foie avec suffisamment de rigueur et de reproductibilité. Si la chirurgie n’est pas effectuée correctement, il existe une variabilité prononcée dans les données métaboliques obtenues. Nous décrivons une méthode organisée pour effectuer un cathétérisme de la veine porte et une résection hépatique dans le cadre d’études métaboliques in situ dans un spectromètre à résonance magnétique nucléaire (RMN), comme décrit dans la littérature 1,2,3,4,5.

Actuellement, il n’existe aucune littérature décrivant une perfusion hépatique ex vivo à l’aide d’une colonne de verre dans une RMN. Il n’y a pas non plus de publication vidéo ou textuelle fournissant un exemple clair de la façon d’effectuer la procédure avec le foie de souris, en particulier, démontrant comment cathétériser la veine porte, réséquer un foie, transférer et accrocher le foie à une colonne de verre. Comme la souris génétiquement modifiée est omniprésente pour étudier le métabolisme hépatique, il s’agit d’une procédure essentielle qui mérite une description complète. Les chirurgies de perfusion hépatique ne sont pas nouvelles, mais cet article est une méthode de référence accompagnée d’une vidéo démontrant l’excellence technique décrite dans cet article pour aider toutes les personnes intéressées par cette procédure. La méthode présentée ici serait mieux appliquée au métabolisme en temps réel pour détecter la fonction et le renouvellement des métabolites dans les modèles de maladie.

Cette méthode utilise une colonne de verre gainée d’eau de 100 cm, qui permet au foie de pendre au fond de la canule encapsulée par du perfusat à l’intérieur d’un tube RMN. L’eau chauffée dans la gaine de verre est utilisée pour contrôler la température du perfusate. Un oxygénateur à couche mince est pressurisé avec 95% / 5% O2 / CO2 pour le contrôle du pH. En utilisant trois pompes séparées, la hauteur de la colonne de perfusat est réglée, ce qui fournit une pression constante au foie. Les débits ne sont pas contrôlés au-delà de l’application d’une pression constante (Figure 1). Pour confirmer que le foie fonctionne correctement, des mesures d’oxygène sont prises avec les débits. Entre nos mains, cet ensemble de conditions préalables conduit à des expériences de RMN hautement reproductibles pour l’évaluation de la fonction métabolique du foie.

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Protocole

Les expériences impliquant des souris ont été traitées conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride (numéro de protocole n ° 201909320). La souche de souris utilisée était C57BL/6J; toutes les souris étaient des mâles. Cette méthode est généralement applicable aux études utilisant d’autres souches de souris standard. Cette chirurgie est réalisée de manière optimale par deux personnes travaillant ensemble.

1. Configuration initiale

  1. Perfuser les foies avec du perfusat contenant des électrolytes de Krebs-Henseleit6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM chacun de MgSO4, KH2PO4, et 0,5 mM sodium-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM de lactate de sodium, 0,6 mM de pyruvate de sodium, 0,2 mM [U-13C] propionate de sodium, 10 % (v/v) D2O, et 0,63 mM d’acides gras mélangés (contenant de l’acide palmitique (22,1 % du total), de l’acide palmitoléique (5,2 %), de l’acide stéarique (2,7 %), de l’acide oléique (27 %), de l’acide linoléique (37,7 %), de l’acide γ-linolénique (2,4 %) et de l’acide décosahexanoïque (2,8 %)) ainsi que de 2 % (p/v) d’albumine sérique bovine. Réglez le pH final du perfusat à 7,3 en utilisant HCl (et NaOH, si nécessaire).

2. Mise en place préopératoire

  1. Assemblez deux seringues de 1 mL avec une aiguille 23G de 19,05 mm de long. Remplir une seringue avec 0,01 mL de 1000 unités/mL d’héparine et 0,19 mL de solution saline (0,9 % (p/v) de NaCl dans l’eau; Tableau 1).
  2. Remplissez la deuxième seringue avec 0,2 mL de lidocaïne à 2 % et 0,6 mL de solution saline à 0,9 % (tableau 1). Dans une autre seringue de 1 mL avec une aiguille de 27 G 38,1 mm, remplir avec le perfusat et maintenir à 37 °C.

3. Configuration de la colonne de perfuser

  1. Placez la bouteille en verre contenant 500 mL de perfusat dans le bain-marie (Figure 1B). Allumez le bain-marie et réglez la température à ~42 °C. La température plus élevée dans le bain-marie permet de maintenir 37 °C dans la colonne de perfusion.
  2. Une fois que l’eau chauffe jusqu’à 42 °C, allumez les deux pompes pour faire circuler le perfusat de la bouteille dans l’oxygénateur à couche mince et la colonne de verre de 100 cm recouverte d’eau (Figure 1A-E).
  3. Allumez le gaz oxygénant (95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone) pour pressuriser l’oxygénateur7 (Figure 1C). Ajuster la hauteur de la colonne de perfusat pour atteindre un débit de 8 mL/min avec le cathéter attaché (voir l’étape 9 pour la mesure du débit)5,8,9.
    REMARQUE: Le débit fait référence à la vitesse à laquelle le perfusat est expulsé par le foie.

4. Anesthésie de la souris

  1. Enfilez l’EPI comme l’exigent le protocole de l’IACUC et d’autres directives de sécurité appropriées.
    REMARQUE: Les étapes suivantes ont été optimisées pour les souris âgées de 9 à 13 semaines.
  2. Placez la souris dans la chambre d’isoflurane. Tournez le gaz d’alimentation en oxygène à 100 %, soit un débit de 1 L/min, et l’isoflurane à 2 %10. Attendez que la respiration ralentisse et soit stable.
    REMARQUE: Pour que la souris atteigne un plan chirurgical stable, comme en témoignent une fréquence respiratoire lente et régulière et l’absence de réflexe de pincement des orteils, le débit d’oxygène peut être ajusté à ~ 1,5 L / min à ~ 3 L / min et la concentration d’isoflurane de 1 à 3%. Le taux de livraison du gaz porteur et de la concentration d’isoflurane dépend de l’âge et du poids de l’animal et de facteurs tels que le bruit et la lumière.
  3. Désinfectez l’abdomen avec 70% d’alcool. Administrer de l’héparine par injection sous-cutanée profonde dans la couche de graisse abdominale (Figure 2). Replacez la souris dans la chambre d’anesthésie pendant 10 min.
    REMARQUE: Le rasage n’est pas nécessaire car cette procédure est terminale.

5. Céliotomie

  1. Transférez la souris de la chambre d’anesthésie à la plate-forme chirurgicale et placez-la en position couchée (Figure 3).
  2. Placez le nez de la souris dans un cône de nez et collez les pattes vers le bas. Veillez à ne pas appliquer de pression sur le cou qui pourrait entraîner une suffocation.
  3. Administrer la lidocaïne par injection sous-cutanée bilatérale dans la région de la crête iliaque antérieure11 (figure 3). Effectuez un test de pincement des orteils pour confirmer l’absence de tous les réflexes de douleur.
  4. Effectuer une céliotomie pour exposer les organes internes (Figure 4). Faites une incision de 3 cm de large (la largeur de tout l’abdomen de la souris).
    REMARQUE: La largeur changera avec l’âge et le régime alimentaire de la souris.
  5. Élargissez l’incision à l’aide d’un hémostat qui tire la traction en serrant le processus xiphoïde (Figure 4).

6. Canulation de la veine porte

  1. Utilisez un applicateur à pointe de coton pour dégager le petit et le gros intestin recouvrant la veine porte. Placez une suture de soie sous l’arche de la veine porte proximale du foie (Figure 4A).
  2. Selon la structure anatomique, placer la deuxième suture de soie proximale ou distale de la veine mésentérique inférieure distale du foie (Figure 4A)12,13. Utilisez une suture 2-0 pour les deux sutures.
  3. Une fois les sutures en place, canulez la veine porte avec un cathéter 22G14 (Figure 4B). Lors de l’insertion du cathéter, maintenez le biseau pointé vers le haut. Entrez dans la veine porte à un angle ne dépassant pas 15°.
  4. Attachez la première suture au-delà du tapper du cathéter. Une fois la veine porte canulée, ancrer le cathéter distal de 2 à 3 mm de la branche de la veine porte avec la suture de soie (Figure 4B).
    REMARQUE: L’assistant doit rouler les épaules et les poignets pour éviter de déloger le cathéter ou de déchirer la veine porte. Chaque suture nécessite deux nœuds.
  5. Ensuite, fixez la partie inférieure du cathéter avec la deuxième suture. Avec l’aide de l’assistant chirurgical, nouez un nœud avec la suture pour fixer le cathéter à la partie distale de la veine porte et au tissu environnant.

7. Résection de la canulation de la veine porteuse du foie

  1. Une fois le cathéter fixé, insérez une seringue de 1 mL avec une aiguille 27G de 38,1 mm de long dans le cathéter pour rincer les bulles de sang et d’air.
    REMARQUE: Il y a généralement un reflux de sang hors du cathéter de la pression.
  2. Utilisez un tube en silicone de 1 mm I.D. x 5 mm O.D. avec un robinet d’arrêt fixe pour coupler la colonne de perfusion (Figure 1A) au cathéter permettant l’écoulement du tampon dans le foie marquant le début de la perfusion. Démarrez une minuterie à ce stade pour marquer le début de la perfusion.
  3. Soulager l’augmentation de la pression vasculaire en faisant une incision, à l’aide de ciseaux, dans la veine cave inférieure.
  4. Confirmez l’écoulement du perfusat dans le foie en observant le changement homogène de la couleur du foie du rose / rouge au jaune pâle. Une fois le débit confirmé, excisez l’estomac, l’intestin grêle, le gros intestin et le rein droit des tissus environnants.
  5. Avec l’aide de l’assistant chirurgical, manœuvrez le foie autour de la cavité abdominale et thoracique pendant que le chirurgien coupe à travers le péritoine pariétal et le tissu thoracique pour réséquer le foie
  6. Enfin, soulevez le foie vers le haut et coupez les tissus conjonctifs restants qui maintiennent le foie en place avec des ciseaux. Manipulez lentement le foie pour faciliter la vue. Retirez toute fourrure qui adhère au foie en rinçant avec du perfusat avant de l’encapsuler dans le tube RMN.
    REMARQUE: Dans cette procédure, seul le foie est enlevé. Tous les autres organes sont laissés dans le corps de l’animal. Le canal biliaire peut être enlevé en fonction du protocole de l’expérience. Bien que pour cette expérience, il a été laissé en place.

8. Suspendre le foie à la colonne

  1. Une fois que le chirurgien remet le foie et le tube à l’assistant, l’assistant déconnecte le tube du cathéter et de la colonne.
  2. Remplissez le cathéter avec du perfusat jusqu’à ce qu’un ménisque se forme sur le dessus du cathéter. Fixez le cathéter à la colonne pour que le foie puisse pendre et perfuser.
    REMARQUE: La perle de perfusat sur le cathéter fournit un volume suffisant pour que le foie fonctionne jusqu’à ce qu’il soit connecté. Le cathéter attaché au foie est pressé au bas de la colonne.
  3. Vissez un tube RMN de 20 mm sur la colonne de verre de 100 cm pour encapsuler le foie (Figure 5). Pour éviter la torsion du foie et de la veine porte, vissez lentement le tube RMN. Si une torsion se produit et que l’écoulement est arrêté, dévissez et revissez le tube RMN. Cela remédiera à l’occlusion et le flux reviendra.
  4. Perfuser le foie pendant 30-60 min en fonction des détails de l’étude.
    REMARQUE: Le temps est basé sur l’expérience de perfusion. Pour cette expérience, le renouvellement métabolique a été mesuré dans les 30 minutes. La perfusion hépatique peut prendre jusqu’à 10 minutes pour atteindre un état d’équilibre. Le temps d’équilibre commence une fois que la veine cave inférieure a été coupée et que le flux hépatique est établi.

9. Mesure du débit

  1. Placez un bateau de pesée sur une balance de chargement supérieure et mettez à zéro la balance. Placez le tube de la pompe à rouleaux tirant le perfusate efférent de la RMN dans le bateau de pesage et démarrez la minuterie.
  2. Peser la masse de liquide accumulée sur 1 min ce qui donne le débit du foie. Replacez le tube dans le conteneur de déchets/de collecte.

10. Mesure de l’oxygène

REMARQUE: Les mesures des compteurs d’oxygène ont été configurées conformément aux instructions du fabricant15.

  1. Placez l’électrode contenant 20 μL de solution saturée de KCl à 50 % sur le dôme de platine et placez cinq gouttes de 10 μL autour de l’anneau de platine inférieur de l’électrode.
  2. Retirez l’adhésif du papier à cigarettes. Posez un morceau de membrane de polytétrafluoroéthylène sur le papier à cigarette.
  3. Placez les deux pièces sur le dessus de l’électrode. Placez un petit joint torique autour du haut de l’électrode. Coupez le papier pour le poser à plat sur l’anneau de platine inférieur de l’électrode.
    REMARQUE: Certains surplombs sont acceptables. Il est essentiel de couvrir l’argent de l’électrode.
  4. Placez le joint torique plus grand sur l’électrode. Couplez l’électrode à la chambre à eau et serrez la base pour maintenir l’électrode en place. Allumez le bain-marie et laissez chauffer jusqu’à 37 °C.
  5. Ouvrez le logiciel de mesure de l’oxygène. Cliquez sur Calibrer > l’eau saturée d’air. Réglez la vitesse de l’agitateur à 75 et la température à 37 °C.
  6. Remplir un flacon de 50 mL à mi-chemin avec de l’eau et agiter vigoureusement pendant 2 min. C’est de l’eau saturée d’air, utilisez-la comme 100% standard. Remplissez la chambre du compteur d’oxygène avec environ 2 mL d’eau et placez le bouchon en deux pièces.
  7. Cliquez sur OK à l’écran et laissez le signal plafonner. Une fois que le signal a atteint un plateau, cliquez sur OK. Jeter le liquide dans la chambre et sécher avec du papier de soie.
  8. Répétez les étapes 10.6-10.7 mais avec 200 mM de sulfite de sodium (0% standard). Cliquez sur Enregistrer l’étalonnage.
    REMARQUE: Aucune agitation vigoureuse n’est nécessaire pour la norme de 0%.
  9. Pendant la perfusion, utilisez deux seringues de 5 mL. Une seringue pour faire circuler le perfusat (oxygène entrant) et la seconde pour le perfusat efférent du tube RMN (oxygène sortant).
  10. Lors de l’élaboration du perfusat pour les mesures d’entrée et de sortie, dessinez 3 à 4 mL à chaque fois.
    REMARQUE: Cette colonne a un tube en verre pour permettre l’accès au tube RMN pour retirer le perfusat qui a coulé dans le foie.
  11. Mesurer le perfusat circulant, d’abord comme l’eau à l’étape 10.6 et éliminer à l’étape 10.7. Répétez les mêmes étapes pour le perfusate efférent.
  12. Effectuez des mesures d’oxygène toutes les 10 minutes.

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Résultats

La fonction hépatique est principalement évaluée par la consommation d’oxygène et le débit. Un débit de 4-8 mL/min et une consommation d’oxygène de 1 μmol/min.g sont typiques. Ces mesures varieront en fonction des conditions expérimentales spécifiques et des différences biologiques.

La quantité exacte d’isoflurane utilisée dépendra du type de système d’anesthésie utilisé ainsi que de l’environnement et de l’âge / poids de la souris. Pendant la chirurgie, l’isoflurane et le gaz d’administration...

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Discussion

Cette intervention chirurgicale est difficile et nécessite une pratique approfondie pour obtenir des résultats reproductibles. L’isoflurane et le gaz porteur doivent être ajustés au besoin pour maintenir la viabilité de l’animal pendant la plus grande partie possible de l’intervention chirurgicale. L’environnement, l’heure de la journée, l’âge, le poids et plusieurs autres facteurs affecteront l’anesthésie. Le poids, l’alimentation, la souche de souris et l’âge pourraient affecter la chirurgie car l’accumulation de grais...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude; dans la collecte, l’analyse ou l’interprétation des données; dans la rédaction du manuscrit; ou dans la décision de publier les résultats.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par un financement des National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Une partie de ce travail a été effectuée au McKnight Brain Institute du National High Magnetic Field Laboratory’s Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, qui est soutenu par l’accord de coopération no de la National Science Foundation. DMR-1644779 et l’État de Floride.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 mL Seringue jetable stérile à usage unique Luer-LockN/A/AMarque non spécifique
100 cm Colonne en verre à enveloppe d’eauN/AN/A N/AMade
2-0 Suture en soieBraintree ScientificN/A
Calibre 22 Catherter 1 po. Sans sécuritéTerumoSRFF2225
23 G 0,75 po. Aiguilles HypodémériquesExel International26407
27 G 1,5 po. Aiguilles HypodémériquesExel International26426
4x4 po. Plate-forme chirurgicaleN/AN/A
Lingette à 70 % d’alcoolN/AN/ANon spécifique Marque
Bain d’eau circulanteMS LaudaN/A Modèle n/a N/A N/A
Applicateur à embout en cotonN/A N/Aspécifique Marque
Ciseaux opératoires délicats ; Droit; Tranchant-tranchant ; Longueur de lame de 30 mm ; 4 3/4 "RobozRS-6702
Dumont #5/45 PinceOutils Scientifiques Fins11251-35
Dumont #7 - Pince FineOutils Scientifiques Fins11274-20
HémostatiquesOutils Scientifiques Fins13015-14
Héparine Sodique Injectable 1000 unités/mLRX Génériques71288-0402-02
IsofluranePatterson Veterinary14043-0704-06
Lidocaïne HCl 2 %VEDCO Inc.50989-0417-12
Oxygénateur à membrane à couche minceRadnotiN/A
Ciseaux Metzenbaum ; Courbé; Émoussé; Longueur de lame de 27 mm ; 5 "RobozRS-6013
Hanstech Instruments Ltd.N/A
Solution saline à 0,9 %N/AN/ALa solution saline est fabriquée en laboratoire
EchelleN/AN/ANon spécifique Marque
  ; Systèmes de pompe à console analogique à vitesse variableCole PalmerN/ALes modèles sont personnalisés par application
Peser les bateauxN/AN/Aspécifique Marque
N Custom sur mesure Non Système de mesure d’oxygène Non

Références

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