Ce protocole décrit un test immuno-enzymatique sandwich pour détecter les sporozoïtes des glandes salivaires chez les moustiques. En utilisant des anticorps monoclonaux facilement disponibles, la méthode permet une détection rentable et à haut débit des moustiques porteurs de Plasmodium falciparum ou de Plasmodium vivax. La méthode convient à la recherche sur la transmission du paludisme, y compris les enquêtes vectorielles.
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Article de méthode
Détection de sporozoïtes de Plasmodium chez les anophèles à l’aide d’un test immuno-enzymatique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les sporozoïtes de Plasmodium sont le stade infectieux des parasites du paludisme qui infectent les humains. Les sporozoïtes résidant dans les glandes salivaires des moustiques anophèles femelles sont transmis à l’homme par les piqûres de moustiques lors de l’alimentation sanguine. La présence de sporozoïtes dans les glandes salivaires des moustiques définit donc l’infectiosité des moustiques. Pour déterminer si un moustique anophèle est porteur de sporozoïtes de Plasmodium, la méthode ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) a été l’outil standard pour détecter la protéine circumsporozoïte de Plasmodium (CSP), la principale protéine de surface des sporozoïtes. Dans cette méthode, la tête et le thorax de chaque moustique sont séparés de l’abdomen, homogénéisés et soumis à un ELISA sandwich pour détecter la présence de CSP spécifique à Plasmodium falciparum et à chacun des deux sous-types, VK210 et VK247, de Plasmodium vivax. Cette méthode a été utilisée pour étudier la transmission du paludisme, y compris la dynamique saisonnière de l’infection par les moustiques et les espèces des principaux vecteurs du paludisme dans les sites d’étude.
Introduction
Les sporozoïtes de Plasmodium sont le stade infectieux des parasites du paludisme chez les moustiques. Les sporozoïtes sont transmis aux humains par les piqûres de moustiques. Chez le moustique, les sporozoïtes se forment d’abord à l’intérieur des oocystes sur la paroi de l’intestin moyen. Une fois prêts, ils sont libérés dans l’hémocèle et se déplacent vers les glandes salivaires des moustiques. Là, ils mûrissent et deviennent prêts à être transmis à l’homme lors de l’alimentation sanguine. Chez l’homme, les sporozoïtes se déposent dans le derme. Ensuite, ils pénètrent dans le vaisseau sanguin et se déplacent le long de la circulation sanguine pour atteindre le foie afin d’établir une infection dans les hépatocytes 1,2.
Trois méthodes différentes ont été utilisées pour déterminer l’infection par les glandes salivaires des moustiques à partir de sporozoïtes. La première méthode est la dissection des glandes salivaires suivie d’un examen direct des sporozoïtes au microscope optique. Cette méthode est l’étalon-or pour détecter et quantifier les sporozoïtes dans les glandes salivaires des moustiques anophèles 3. Cependant, elle nécessite un technicien bien formé à la fois à la dissection et à l’examen microscopique. De plus, il ne peut pas être utilisé pour déterminer l’espèce de Plasmodium et le sous-typage CSP (pour P. vivax)4,5. La deuxième méthode utilise la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour détecter l’ADN de Plasmodium dans la partie supérieure du corps du moustique6. Compte tenu de la spécificité de la PCR, les deux espèces et le sous-typage du parasite sont possibles 7,8,9,10. Bien que la PCR soit de plus en plus utilisée, elle nécessite un équipement relativement coûteux et un personnel bien formé. La dernière méthode, l’ELISA, pour détecter la protéine circumsporozoïte spécifique de Plasmodium (CSP), est le pilier depuis trois décennies 11,12,13. La CSP est présente à la fois dans les sporozoïtes d’oocystes et les sporozoïtes des glandes salivaires12,14. À l’aide d’anticorps spécifiques, cette méthode permet d’identifier les espèces de Plasmodium et de sous-typage CSP des sporozoïtes de P. vivax. La raison d’être de ce test est la nécessité d’un simple test à haut débit pour examiner un grand nombre de moustiques sauvages afin de comprendre la transmission du paludisme (c’est-à-dire de déterminer le taux d’infection par les sporozoïtes).
La méthode ELISA présente deux avantages clés par rapport à l’examen microscopique. Tout d’abord, il permet aux chercheurs de conserver des échantillons de moustiques jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le traitement des échantillons. Deuxièmement, la méthode ELISA peut être utilisée pour différencier les espèces de Plasmodium à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques à l’espèce. De plus, l’ELISA peut accueillir un plus grand nombre d’échantillons de moustiques, ce qui permet un débit beaucoup plus élevé15. Par rapport à la PCR, qui détecte l’ADN des sporozoïtes, la procédure ELISA prend plus de temps mais coûte moins cher16. Le test ELISA décrit ici a été mis au point pour déterminer l’infectiosité des moustiques et détecter séparément le CSP de P. falciparum et chacun des deux variants du CSP de P. vivax, VK210 et VK247. Cette méthode ELISA a été utilisée dans de nombreuses études pour déterminer la dynamique saisonnière de l’infection par les moustiques et identifier les espèces des principaux vecteurs du paludisme sur le terrain 12,13,17,18. Pour réaliser ce test, un laboratoire standard équipé d’un lecteur de plaques ELISA suffit.
L’approche globale est résumée à la figure 1. Dans cet ELISA sandwich, l’anticorps monoclonal (mAb) primaire (capture) spécifique de chaque espèce/sous-type de Plasmodium est d’abord utilisé pour enrober la plaque ELISA. Chaque plaque est recouverte d’un seul anticorps monoclonal de capture. La fonction de l’anticorps monoclonal est de capturer l’antigène CSP correspondant dans l’homogénat du moustique. Après la capture de l’antigène et le lavage des plaques, un deuxième anticorps spécifique du CSP marqué à la peroxydase est utilisé pour détecter la présence de CSP lié à l’AcM de capture. La réaction chimique catalysée par la peroxydase entraîne le développement de la couleur dans les puits positifs pour la CSP.
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Protocole
1. Préparation des réactifs
REMARQUE : Reportez-vous au tableau des matériaux pour une liste des équipements, réactifs et autres consommables utilisés dans ce protocole et au tableau 1 pour une liste des solutions et de leur composition.
- Anticorps monoclonaux de capture et conjugués à la peroxydase
- Pour reconstituer l’AcM, il faut remettre en suspension l’AcM lyophilisé dans un mélange 1:1 d’eau distillée et de glycérol à 0,5 mg/mL. Faites des aliquotes au besoin pour éviter la congélation-décongélation répétée et conservez-les à -20 °C.
- Tampon de blocage (BB)
- Préparez le tampon de blocage en dissolvant 5 g de caséine de qualité ELISA dans 100 mL de NaOH 0,1 N. Ajouter 900 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (voir le tableau 1) pour porter le volume final à 1,0 L.
- Ajouter 0,02 g de rouge de phénol comme indicateur et ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Conserver BB à 4 °C jusqu’à une semaine, ou aliquote dans 50 mL pour un stockage à long terme à -20 °C.
- Contrôles positifs
- Pour reconstituer les témoins positifs, réhydratez les protéines lyophilisées en ajoutant 1 000 μL de BB. Faites des aliquotes des solutions de contrôle positif de base au besoin et stockez-les à -20 °C.
- Pour la dilution en série, diluer davantage chaque témoin positif jusqu’à la concentration de travail finale en BB comme suit : Pf, 2 pg/μL ; Pv (VK210), 182 (pg/μL) ; Pv (VK247), 89 pg/μL.
REMARQUE : Les concentrations exactes des témoins positifs peuvent varier d’un lot à l’autre. Consultez la fiche d’information du produit pour connaître la concentration exacte nécessaire. Les concentrations des témoins positifs, à partir de la concentration de travail ci-dessus, sont de 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL pour Pf ; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μL pour PV210 ; et 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 pg/μL PV247.
- Contrôles négatifs
REMARQUE : Le contrôle négatif idéal est l’homogénat tête-thorax des moustiques anophèles femelles préparés de la même manière que les échantillons d’essai. Cependant, BB peut également être utilisé comme contrôle négatif.- Avec BB comme contrôle négatif, utilisez le seuil d’absorbance 2 fois pour des lectures positives fiables.
2. Préparation de l’échantillon de moustique
- Séparez la tête et le thorax de chaque moustique adulte collecté de l’abdomen avec une lame de rasoir stérile. Placez la tête et le thorax dans un tube de broyage centrifuge pré-étiqueté de 1,5 ml. Têtes de piscine et thoraces de jusqu’à 10 moustiques si vous le souhaitez.
REMARQUE : Pour la préparation de l’échantillon, généralement, la glande salivaire d’un moustique infecté sera disséquée et soumise à CS-ELISA. Cependant, la tête et le thorax des moustiques collectés peuvent également être utilisés pour effectuer directement des CS-ELISA (sans dissection des glandes salivaires)12,13,19. - Ajoutez 50 μL de tampon de broyage (GB) dans chaque tube et homogénéisez l’échantillon avec un pilon propre (lavé au savon). Rincez le pilon usagé avec 250 μL de GB dans le tube contenant le(s) moustique(s) homogénéisé(s) jusqu’à un volume final de ~300 μL.
- Conservez l’échantillon dans un congélateur (-20 °C) jusqu’à ce qu’il soit utilisé ou procédez immédiatement à l’exécution de l’ELISA.
3. ELISA de sporozoïte
- Remplissez la feuille de travail ELISA pour les sporozoïtes (voir le matériel supplémentaire 1). Préparez une plaque ELISA pour chaque CSP (Pf, Pv-210 ou Pv-247).
- Préparez la solution de travail de capture d’AcM en dissolvant l’anticorps dans du PBS : 4 μg/mL Pf ; 2 μg/mL de Pv-210 ; 2 μg/mL de Pv-247. Calculer les volumes requis en fonction de l’ajout de 5 mL par plaque. Vortex la solution doucement.
- Pipeter 50 μL de chaque solution d’anticorps monoclonaux de travail de l’étape 3.2 dans chaque puits de la plaque ELISA. Couvrez l’assiette avec un couvercle en plastique et laissez incuber pendant 30 minutes ou toute la nuit à température ambiante.
- Aspirez le contenu du puits et tapotez l’assiette à l’envers sur du papier absorbant au moins 5 fois pour enlever tout le liquide.
REMARQUE : Si un système d’aspiration (aspiration sous vide multicanaux connectée à des pointes propres) n’est pas disponible, videz les anticorps dans l’évier, puis tapotez l’assiette sur des serviettes en papier. - Ajouter 200 μL de BB pour remplir tous les puits de la plaque. Couvrez l’assiette avec un couvercle en plastique. Incuber la plaque pendant 1 h à température ambiante. Aspirez ou videz le contenu du puits. Tapotez l’assiette à l’envers sur du papier absorbant 5 fois pour enlever tout le liquide.
- Chargez l’homogénat de moustiques et la commande sur la plaque comme suit.
- Ajouter 50 μL du témoin positif dans les puits H1 et H2.
- Ajouter 50 μL de BB dans les puits des colonnes 1 et 2 de la rangée C à G. Ensuite, ajoutez 50 μL du témoin positif dans les puits G1 et G2. Effectuez une dilution en série du témoin positif en commençant par G1 et G2 suivi de F1 et F2 jusqu’à C1 et C2.
REMARQUE : Tous les puits de contrôle positif doivent contenir 50 μL. - Ajoutez 50 μL de BB (témoin négatif) dans les puits A1, A2, B1 et B2.
- Ajouter 50 μL de chaque échantillon d’homogénat dans un puits inconnu (Unk).
- Couvrez la plaque et laissez incuber pendant 2 h à température ambiante.
- Après environ 2 h, commencez à préparer les substrats. Pour le kit de substrat ABTS à 2 composants, mélangez le substrat A et le substrat B dans un rapport de 1:1.
REMARQUE : Une plaque complète de 96 puits nécessite 5 ml de substrat A et 5 mL de substrat B. - Préparez les solutions de travail d’anticorps monoclonaux marqués à la peroxydase pour Pf, Pv-210 et Pv-247 en ajoutant BB à l’anticorps monoclonal conjugué reconstitué pour obtenir une concentration de travail de 1 μg/mL.
- Calculer les volumes requis en fonction de l’ajout de 5 mL de solution conjuguée d’AcM par plaque.
- Testez l’activité de la peroxydase en mélangeant 5 μL de l’AcM marqué à la peroxydase fabriqué à l’étape 3.8 avec 100 μL du substrat fabriqué à l’étape 3.7 dans un tube séparé de 1,5 mL. Vortex doucement.
REMARQUE : Il devrait y avoir un changement rapide de couleur du clair au vert, indiquant que l’enzyme peroxydase et les substrats fonctionnent.
- Aspirez ou videz le contenu du puits et tapotez l’assiette à l’envers sur des serviettes en papier 5 fois pour enlever tout le liquide.
- Lavez les puits deux fois avec 200 μL de PBS-Tween, aspirez le contenu du puits et tapotez la plaque 5 fois chacun.
- Ajouter 50 μL d’anticorps monoclonaux marqués à la peroxydase effectués à l’étape 3.8 dans chaque puits. Couvrez l’assiette et laissez incuber 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Aspirez ou videz le contenu du puits et tapotez l’assiette à l’envers sur une serviette en papier 5 fois.
- Lavez les puits 3 fois avec 200 μL de PBS-Tween, aspirez le contenu du puits et tapotez la plaque 5 fois chacun.
- Ajouter 100 μL de la solution de substrat préparée à l’étape 3.7 dans chaque puits. Couvrez l’assiette et laissez incuber 30 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Après 30 min, lire l’absorbance à 405-414 nm à l’aide d’un lecteur de plaques ELISA.
REMARQUE : Suivez les instructions spécifiques pour le lecteur de plaque ELISA utilisé. Pour plus de détails sur les instructions du logiciel utilisé pour ce protocole, reportez-vous au matériel supplémentaire S2. Il devrait y avoir un changement de couleur notable du clair au vert dans les puits de contrôle positif.
4. Analyse
- Détection d’échantillons positifs.
- Étiquetez les échantillons dont les valeurs d’absorbance sont supérieures au seuil (deux fois la valeur d’absorbance moyenne des échantillons négatifs) comme étant positifs.
- Quantification du CSP
- Estimez la concentration de CSP dans l’échantillon à l’aide de la courbe standard construite à partir de la série de dilutions témoins, comme suit.
- Créez la courbe standard en traçant les valeurs d’absorbance (axe y) des témoins dilués en série par rapport à leurs concentrations (axe x).
- Effectuez une régression linéaire pour déterminer le meilleur ajustement à l’aide de y = A + Bx, où A et B sont des paramètres libres.
- Déterminez la concentration de CSP pour chaque échantillon positif en résolvant l’équation d’une valeur d’absorbance donnée.
- Estimez la concentration de CSP dans l’échantillon à l’aide de la courbe standard construite à partir de la série de dilutions témoins, comme suit.
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Résultats
Les résultats ELISA représentatifs sont présentés à la figure 2. Dans cette expérience, l’ELISA de P. falciparum a détecté une infection par des sporozoïtes dans le puits A7. Le puits positif a pu être détecté visuellement par sa faible couleur verte (Figure 2A). La valeur d’absorbance de ce puits était supérieure au seuil de coupure (deux fois la valeur moyenne des quatre puits de contrôle négatifs) (figure 2B). La distrib...
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Discussion
Le CSP-ELISA fournit une méthode très spécifique et rentable pour détecter le CSP de Plasmodium. Il permet la discrimination entre les sporozoïtes de P. falciparum et de P. vivax ainsi qu’entre les deux sous-types, VK210 et VK247, de P vivax 11,13,14,15. Certains points critiques doivent être pris en compte pour obtenir des résultats fiables et reproductibles...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous remercions M. Kirakorn Kiatibutr, MVRU, pour sa formation et ses conseils. Nous remercions également Mme Pinyapat Kongngen, MVRU, pour son aide technique dans la préparation de la figure 2. Ces travaux ont été soutenus par une subvention de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses et de l’Institut national de la santé (U19 AI089672).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lecteur de plaques ELISA | BioTek Instrument, Inc. | Synergy H1 | L’absorbance est mesurée à l’aide du mode de détection d’absorbance UV-VIS |
| Pilon broyeur | Axygen | PES-15-B-SI | Pour l’homogénéisation de la tête de moustique/du thorax |
| Réactifs | |||
| ABTS Substrat 2 composants | KPL | 50-62-00 | Pour la détection induite par la peroxydase |
| Tampon de blocage (BB) | Remarque : solution | ||
| Capture et anticorps monoclonaux (mAbs) conjugués à la peroxydaseRemarque | : Les mAbs peuvent être obtenus sous forme lyophilisée dans le cadre des kits de réactifs ELISA de sporozoïte (MRA-890 pour P. falciparum et MRA-1028K pour P. vivax) auprès de BEI Resources (https://www.beiresources.org.) | ||
| Caséine | Sigma aldrich | 9000-71-9 | Pour la préparation du tampon |
| de blocage Tampon de broyage (GB) | Remarque : solution | ||
| Igepal CA-630 | Sigma aldrich | 9002-93-1 | Pour la préparation du tampon de broyage |
| KCl | Sigma aldrich | 7447-40-7 | Pour la préparation du tampon salin |
| phosphate KH2PO4 | Sigma aldrich | 7778-77-0 | Pour la préparation de solution saline tampon |
| phosphate Na2HPO4 | Sigma aldrich | 7558-79-4 | tampon salin |
| phosphate NaCl | Sigma aldrich | 7647-14-5 | tampon salin |
| phosphate NaOH | Sigma aldrich | 1310-73-2 | tampon de blocage |
| PBS-Tween | |||
| Pf capture mAb | CDC | Pf-CAP | Pour la capture de la protéine circumsporozoïte Pf |
| Pf peroxydase mAb | CDC | Pf-HRP | Pour la détection de la protéine circumsporozoïte |
| Pf contrôle positif | CDC | Pf-PC | Pf contrôle positif |
| Phenol red | Sigma aldrich | 143-74-8 | Pour la préparation du tampon de blocage |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Remarque : solution | ||
| Témoins | Remarque : solution | ||
| Pv210 capture mAb | CDC | Pv210-CAP | Pour la capture de la protéine circumsporozoïte Pv210 |
| Pv210 peroxydase | mAb CDC | Pv210-HRP | Pour la détection de la protéine circumsporozoïte Pv210 |
| Pv210 contrôle positif | CDC | Pv210-PC | Pv210 contrôle positif |
| Pv247 capture mAb | CDC | Pv247-CAP | Pour la capture de la protéine circumsporozoïte Pv247 |
| Pv247 peroxydase mAb | CDC | Pv247-HRP | Pour la détection de la protéine circumsporozoïte Pv247 |
| Contrôle positif Pv247 | CDC | Pv247-PC | Pv247 contrôle positif |
| Tween20 | Sigma aldrich | 9005-64-5 | Pour la préparation PBS-Tween |
| Consommables | |||
| Réservoirs de pipetage jetables | Générique | Pour les réactifs de travail | |
| Plaques ELISA : 96 puits transparent à fond rond PVS | Corning Life Science | 2797 | Pour ELISA |
| Gants : gants jetables et gants de congélation | Générique | Pour la protection individuelle | |
| Blouse de laboratoire | Générique | pour la protection individuelle | |
| Pipette multicanaux P30-300 | Générique | Pour le transfert de solution | |
| Set de pipettes, P2, P20, P200 et P1000 | Générique | Pour le transfert de solution | |
| Pointes de pipette 10 & micro ; L, 200 et micro ; L, et 1000 µ ; L | Générique | Pour le transfert de solution | |
| Pipettes sérologiques 5 mL, 10 mL | Générique | Pour le transfert de solution | |
| Pipettes de transfert | Générique | Pour le transfert de solution |
Références
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Réimpressions et autorisations
