Visualisation de la proximité induite par les caspases inflammatoires dans les macrophages dérivés des monocytes humains

Les caspases sont une famille de protéases d’aspartate de cystéine qui peuvent être regroupées en caspases initiatrices et caspases bourreaux. Les caspases de bourreau comprennent les caspases-3, -6 et -7. Ils se trouvent naturellement dans les cellules sous forme de dimères et sont clivés par les caspases initiatrices pour exécuter l’apoptose¹. Les caspases initiatrices comprennent les caspases humaines-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 et -12. On les trouve sous forme de zymogènes inactifs (pro-caspases) qui sont activés par la dimérisation induite par la proximité et stabilisés par le clivage auto-protéolytique ^2,3. Les caspases inflammatoires sont un sous-ensemble des caspases initiatrices² et englobent les caspases-1, -4, -5 et -12 chez l’homme, et les caspases-1, -11 et -12 chez la souris ^4,5. Plutôt qu’un rôle apoptotique, ils jouent un rôle central dans l’inflammation. Ils intermétrent le traitement protéolytique et la sécrétion de pro-interleukine (IL)-1β et pro-IL-18 ^6,7, qui sont les premières cytokines à être libérées en réponse à des envahisseurs pathogènes ^8,9. Caspase-1 est activé lors du recrutement sur sa plateforme d’activation ; un complexe protéique de grand poids moléculaire appelé inflammasome (Figure 1A)¹⁰. La dimérisation des caspase-4, -5 et -11 se produit indépendamment de ces plates-formes par une voie inflammasome non canonique^11,12.

Les inflammasomes canoniques sont des complexes protéiques multimériques cytosoliques constitués d’une protéine de capteur d’inflammasome, de la protéine adaptatrice ASC (protéine de type mouchette associée à l’apoptose contenant un CARD) et de la protéine effectrice caspase-1¹⁰. Les inflammasomes canoniques les mieux étudiés sont la famille de récepteurs de type NOD contenant un domaine pyrin (NLRP), NLRP1 et NLRP3, la famille NLR contenant un CARD (NLRC), NLRC4 et l’absent dans le mélanome 2 (AIM2). Ils contiennent chacun un domaine pyrine, une CARTE ou les deux domaines. Le domaine CARD sert de médiateur à l’interaction entre les caspases contenant card et leurs activateurs en amont. Par conséquent, la molécule d’échafaudage ASC, qui est composée d’un domaine de pyrine N-terminal (PYD) et ^d’un motif CARD C-terminal ^13,14, est nécessaire pour le recrutement de la caspase-1 dans les inflammasomes NLRP1¹⁰, NLRP3¹⁵ et AIM2¹⁶.

Chaque inflammasome est nommé d’après sa protéine de capteur unique qui reconnaît des stimuli pro-inflammatoires distincts (Figure 1B). Les activateurs de cette voie sont appelés stimuli canoniques. Les inflammasomes servent de capteurs pour les composants microbiens et le stress tissulaire, et s’assemblent pour déclencher une réponse inflammatoire robuste par l’activation des caspases inflammatoires¹⁷. L’assemblage d’inflammasomes initie l’activation de la caspase-1 pour médier la maturation et la sécrétion de ses principaux substrats pro-IL-1β et pro-IL-18. Ce processus se produit via un mécanisme en deux étapes. Tout d’abord, un stimulus d’amorçage régule à la hausse l’expression de certaines protéines inflammasomes et pro-IL-1β par l’activation de la voie NF-κB. Deuxièmement, un stimulus intracellulaire (canonique) induit l’assemblage et le recrutement d’inflammasomes de procaspase-1 ^6,7.

Caspase-4 et caspase-5 sont les orthologues humains de la caspase-11-11 murine. Ils sont activés de manière indépendante de l’inflammasome par le lipopolysaccharide intracellulaire (LPS), une molécule présente dans la membrane externe de la bactérie Gram négatif ^18,19,20, et par l’hème extracellulaire, un produit de l’hémolyse des globules rouges²¹. Il a été proposé que le LPS se lie directement au motif CARD de ces protéines et induit leur oligomérisation²⁰. L’activation de la caspase-4 ou de la caspase-5 favorise la libération d’IL-1β en induisant une forme inflammatoire de mort cellulaire appelée pyroptose par clivage de la protéine formant des pores gasdermine D (GSDMD)^18,19. De plus, l’efflux d’ions potassium résultant de la mort pyroptotique médiée par la caspase-4 et la GSDMD induit l’activation de l’inflammasome NLRP3 et l’activation ultérieure de la caspase-1^22,23. Par conséquent, les caspases-4, -5 et -11 sont considérées comme des capteurs intracellulaires pour le LPS capables d’induire la pyroptose et l’activation de la caspase-1 en réponse à des stimuli spécifiques^11,24.

Figure 1 : Caspases inflammatoires et test de complémentation de fluorescence caspase-bimoléculaire (BiFC). (A) Diagramme montrant le système caspase-BiFC, où deux prodomaines de caspase-1 (C1-pro) liés à chaque fragment non fluorescent de Vénus (Vénus-C ou Vénus-N) sont recrutés sur la plate-forme d’activation NLRP3, forçant Vénus à se replier et à fluorescence. Ce complexe apparaît comme une tache verte au microscope et sert de lecture pour la proximité inflammatoire induite par la caspase, qui est la première étape de l’activation de la caspase initiatrice. (B) Schéma montrant l’organisation du domaine des composants inflammasomes et des caspases inflammatoires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Il est difficile de mesurer l’activation des caspases initiatrices spécifiques, et il n’existe pas beaucoup de méthodes disponibles pour le faire par des approches d’imagerie. La complémentation par fluorescence bimoléculaire de caspase (BiFC) peut être utilisée pour visualiser l’activation inflammatoire de la caspase directement dans les cellules vivantes (Figure 1A)²⁵. Cette technique a été récemment adaptée pour être utilisée dans les macrophages dérivés de monocytes humains (MDM)²¹. Caspase BiFC mesure la première étape de l’activation inflammatoire de la caspase, la proximité induite pour faciliter la dimérisation. L’expression de plasmides codant pour le prodomaine de caspase contenant du CARD fusionné à des fragments non fluorescents de la protéine fluorescente jaune photostable Vénus (Vénus-C [VC]) et Vénus-N [VN]) est utilisée. Lorsque les deux prodomaines de caspase sont recrutés sur leur plate-forme d’activation ou subissent une proximité induite, les deux moitiés de Vénus sont rapprochées et forcées de se replier et de fluorescence (voir Figure 1A, B). Cela fournit une lecture en temps réel de l’activation spécifique de la caspase inflammatoire.

Les MDM humains expriment abondamment les gènes inflammasomes et les récepteurs de reconnaissance de formes qui identifient les signaux de danger et les produits pathogènes. Cela fournit un type de cellule idéal pour l’interrogation des voies inflammatoires de la caspase. En outre, ils peuvent être dérivés du sang périphérique et même d’échantillons de patients pour évaluer l’activation de la caspase inflammatoire dans un état pathologique spécifique. Ce protocole décrit comment introduire les rapporteurs de caspase BiFC dans le MDM en utilisant la nucléofection, une méthode de transfection basée sur l’électroporation, comment traiter les cellules pour induire l’activation inflammatoire de la caspase et comment visualiser les complexes de caspase actifs à l’aide d’approches microscopiques. De plus, cette méthodologie peut être adaptée pour déterminer la composition moléculaire de ces complexes, la localisation subcellulaire, la cinétique et la taille de ces structures hautement ordonnées 25,26,27.

Ce protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine du Baylor College of Medicine pour la manipulation d’échantillons humains. Les échantillons de sang sont manipulés conformément aux directives de sécurité institutionnelles pour les échantillons humains. Les échantillons de sang sont prélevés dans une banque de sang régionale, où ils sont prélevés avec une solution de phosphate de dextrose de citrate (CPD). Cependant, le sang recueilli avec d’autres anticoagulants comme l’héparine de sodium, l’héparine de lithium ou l’EDTA peut également être utilisé pour ce protocole^28,29.

1. Isolement des monocytes humains et différenciation en macrophages

1. Obtenez du sang anticoagulé de personnes en bonne santé anonymisées dans une banque de sang régionale et isolez les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) comme indiqué ci-dessous.
   REMARQUE: Effectuez toutes les étapes dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire. Utilisez uniquement des tubes stériles et portez des gants. Ajouter 10 % d’eau de Javel à tous les produits liés au sang lors de l’élimination. PBS stérile (1x) ou DPBS (sans Ca²⁺ et Mg²⁺) peut être utilisé de manière interchangeable.
   1. Préparer le tampon de dilution: Compléter 1x PBS stérile avec 2% FBS et 0,5 mM EDTA.
   2. Préparer le milieu de culture : Supplément RPMI-1640 avec FBS (10 % (v/v)), glutamax (2 mM) et pénicilline/streptomycine (50 UI/50 μg/mL)
   3. Prérefroidissez le tampon de fonctionnement (Table des matériaux) selon le protocole du fabricant.
   4. Diluer le sang total avec deux volumes de tampon de dilution. À l’aide d’une pipette sérologique, transférer 15 mL de sang anticoagulé dans un tube de 50 mL contenant 30 mL de tampon de dilution. Mélanger doucement par inversion.
   5. Pour chaque 10 mL de sang total ou 30 mL de sang dilué, ajouter 15 mL du milieu de gradient de densité à un tube vide de 50 mL.
   6. Superposer le milieu de gradient de densité de l’étape 1.1.5 avec 30 mL de sang dilué lentement et régulièrement à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL. Gardez la pointe de la pipette contre la paroi du tube et le tube à un angle incliné.
   7. Transférez soigneusement les tubes dans une centrifugeuse à godet oscillant. Évitez de perturber les deux phases. Centrifugez les tubes à 400 x g à température ambiante (RT) pendant 25 min avec accélération et décélération réglées à la valeur minimale.
   8. Retirez soigneusement la couche supérieure (transparente) de plasma à l’aide d’un pipot de 10 mL et jetez-la dans un récipient avec de l’eau de Javel (10 %).
   9. Prélever la couche interphasée (blanche) des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC, figure 2) à l’aide d’un tuyau de 10 mL et transférer dans un tube frais de 50 mL. Combinez la couche blanche de différents tubes du même donneur dans un tube de 50 mL jusqu’à 30 mL.
   10. Porter chaque tube à un volume total de 50 mL avec le tampon de dilution de l’étape 1.1.1 et centrifuger à 300 x g et 4 °C pendant 10 min. Retirez le surnageant avec un pipot de 10 ml et jetez-le dans un récipient avec de l’eau de Javel (10%).
   11. Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans 1 mL du tampon de fonctionnement pré-refroidi à partir de l’étape 1.1.3 à l’aide d’une micropipette p1000. Combinez les suspensions cellulaires du même donneur dans un nouveau tube de 15 mL. Porter le volume de chaque tube à 15 mL avec tampon de fonctionnement pré-refroidi et bien mélanger par inversion.
   12. Prendre une aliquote de 20 μL de la suspension cellulaire de l’étape 1.1.11 et préparer une dilution de 1:100 à l’aide de 1x PBS stérile. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   13. Centrifuger la suspension de la cellule de l’étape 1.1.11 à 300 x g et 4 °C pendant 10 min et retirer le surnageant avec un tuyau de 10 mL. Si nécessaire, utilisez une micropipette p200 pour éliminer complètement le surnageant.
   14. Remettez en suspension les PBMC isolés dans 80 μL de tampon de fonctionnement MACS pré-refroidi pour chaque 1 x 10⁷ cellules, en ajoutant jusqu’à un maximum de 800 μL du tampon.
   15. Ajouter 20 μL de microbilles anti-humaines CD14 par 1 x 10⁷ cellules ou jusqu’à 100 μL par échantillon de sang (~100 mL de sang non dilué). Bien mélanger par inversion et placer sur un rotateur tubulaire pendant 20 min avec un mélange continu à 4 °C.
   16. Retirer les échantillons du rotateur du tube, ajouter 10 mL de tampon de fonctionnement pré-refroidi à chaque tube et centrifuger à 300 x g (accélération = 5, décélération = 5) et 4 °C pendant 10 min.
   17. Retirez le surnageant à l’aide d’un pipet de 10 mL et remettez en suspension jusqu’à 1 x 10⁸ cellules dans 500 μL de tampon de fonctionnement pré-refroidi (2 x 10⁸/mL).
   18. Effectuer l’isolation des cellules CD14 positives par tri magnétique des cellules à l’aide d’un système manuel ou automatisé (Table des matériaux) selon les instructions du fabricant.
   19. Prélever une aliquote de 20 μL de la suspension cellulaire de l’étape 1.1.18 après sélection CD14-positive et préparer une dilution 1:100 à l’aide de 1x PBS stérile. Déterminez le nombre de cellules en comptant les cellules sur un hémocytomètre.
   20. Centrifuger les cellules CD14 positives à 300 x g et RT pendant 10 min. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL ou d’un système de vide.
   21. Remettre en suspension la pastille cellulaire de l’étape 1.1.20 dans un milieu de culture préchauffé de l’étape 1.1.2 à une densité cellulaire finale de 1 x 10⁷ cellules/mL.
2. Ensemencez les monocytes CD14 positifs isolés à une densité cellulaire de 5 x 10⁶ cellules.
   1. Sur une boîte de culture tissulaire de 10 cm, ajouter 10 mL de milieu de culture à partir de l’étape 1.1.2 complétée par un facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages de 50 ng/mL (GM-CSF).
   2. Ajouter 0,5 mL de la suspension cellulaire de l’étape 1.1.21 au milieu de culture goutte à goutte et faire tourbillonner doucement la plaque. Incuber des cellules dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % de CO₂) pendant la nuit.
   3. Le lendemain, aspirez le milieu à l’aide d’un système de vide pour éliminer les cellules qui ne se sont pas fixées pendant la nuit. Ajouter 10 mL de milieu de culture frais complété par le GM-CSF (50 ng/mL) et incuber des cellules dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % de CO₂) pendant 7 jours pour permettre une différenciation complète (voir la figure 3A pour l’apparition de monocytes CD14+ à différents stades de différenciation dans le GM-CSF ). Échangez le milieu de culture tous les 2-3 jours et complétez avec du GM-CSF frais (50 ng / mL) à chaque fois.

Figure 2 : Vue d’ensemble schématique du flux de travail expérimental. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

2. Préparation des composants d’électroporation

REMARQUE: Ce protocole est conçu pour une pointe de néon de 10 μL (table des matériaux). Pour chaque transfection, utilisez 1-2 x 10⁵ cellules. Il est recommandé d’ensemencer les cellules transfectées sur une plaque de 48 puits ou une boîte chambrée à 8 puits (cellules transfectées de 10 μL par puits). 1x DPBS stérile (sans Ca²⁺ et Mg²⁺) peut être utilisé à la place du PBS.

1. Le jour 7, préparez un milieu sans antibiotique en complétant le milieu RPMI-1640 avec FBS (10 % (v/v)) et glutamax (2 mM).
2. Placer le milieu RPMI-1640 sans sérum, la trypsine-EDTA (solution à 0,25%), 1x PBS stérile (sans Ca²⁺ et Mg²⁺) et le milieu de culture complet à partir de l’étape 1.1.2 dans un bain-marie à 37 °C.
3. Si vous utilisez des plats à fond de verre (pour la microscopie confocale), recouvrez les plats de bromhydrate de poly-D-lysine.
   1. Enduire un plat de 8 bien chambrés de 200 μL de bromhydrate de poly-D-lysine (0,1 mg/mL dans 1x PBS stérile) et incuber pendant 5 min à TA.
   2. Aspirer la solution de poly-D-lysine et laver le verre une fois avec 1x PBS stérile. Aspirez le PBS et passez à l’étape 2.4.
4. Ajouter 200 μL de milieu sans antibiotique par puits de la plaque de 48 puits ou de la boîte de 8 puits et pré-incuber dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % de CO 2) jusqu’à ce qu’ils_soient prêts à plaquer les cellules transfectées.

3. Préparation des cellules pour l’électroporation

REMARQUE: Le rendement en MDM d’un plat de 10 cm à la fin de la période de différenciation de 7 jours est d’environ 1,5 x 10⁶ cellules. 1x DPBS stérile (sans Ca²⁺ et Mg²⁺) peut être utilisé à la place du PBS. Ce protocole a été optimisé pour que la plupart des macrophages soient détachés de la plaque avec le maintien de la viabilité et de l’intégrité des cellules. Les MDM sont difficiles à détacher des plaques de culture cellulaire. Par conséquent, il peut être nécessaire d’effectuer les étapes 3.2 et 3.3 deux fois pour dissocier les cellules. Assurez-vous que chaque temps d’incubation avec de la trypsine-EDTA (0,25%) ne dépasse pas 5 min.

1. Aspirer les milieux de macrophages entièrement différenciés sur de la vaisselle de 10 cm et laver la monocouche cellulaire avec un milieu RPMI-1640 chaud sans sérum. Assurez-vous d’enlever complètement le support.
2. Récolter les cellules en ajoutant 2 mL de solution chaude de trypsine-EDTA (0,25%) par plat de 10 cm et incuber dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5% de CO₂) pendant 5 min.
3. Complétez le détachement de la cellule en pipetant doucement la solution de trypsine-EDTA (0,25%) de haut en bas sur toute la zone de la boîte à l’aide d’une micropipette p1000. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de milieu de culture complet chaud de l’étape 1.1.2.
4. Apportez la parabole à un microscope à champ lumineux et vérifiez le détachement des cellules dans divers champs de vision. S’il y a encore une quantité considérable de cellules attachées, répétez les étapes 3.2 à 3.3.
5. Centrifuger la suspension de la cellule à 250 x g pendant 5 min à RT.
6. Aspirer le milieu et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de 1x PBS stérile préchauffé à 37 °C. Prenez une aliquote de 20 μL pour déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
7. Prendre 1-2 x 10⁵ cellules par transfection prévue et placer dans un tube de 15 mL. Porter à un volume final de 15 mL avec 1x PBS stérile préchauffé. Centrifuger à 250 x g pendant 5 min à RT.
8. Aspirer le PBS et centrifuger une fois de plus pendant 1 min à 250 x g. Retirez tout PBS résiduel de la pastille de cellule à l’aide d’une micropipette p200.

4. Nucléofection des composants de la caspase BiFC dans des macrophages dérivés de monocytes humains

REMARQUE: Cette section du protocole est effectuée à l’aide du système de transfection au néon (table des matériaux). Ce protocole décrit les étapes à suivre pour transfecter 1-2 x 10⁵ cellules à l’aide d’une pointe néon de 10 μL (table des matériaux). Si vous utilisez une pointe de néon de 100 μL, augmentez la taille en conséquence. Évitez d’exposer les cellules au tampon de remise en suspension R pendant plus de 15 minutes, car cela pourrait diminuer la viabilité cellulaire et l’efficacité de la transfection.

1. Diluer le plasmide rapporteur (c.-à-d. mCherry ou dsRedmito à 100 ng/μL) dans de l’eau sans nucléase ou un tampon TE 0,5x pour visualiser les cellules transfectées.
2. Diluer les plasmides de caspase BiFC à une concentration appropriée dans de l’eau sans nucléase ou un tampon TE 0,5x, de sorte que le volume total de plasmides ne dépasse pas 30 % du volume total de transfection de 10 μL (c.-à-d. 300 ng/μL de C1 Pro-VC et 300 ng/μL de C1 Pro-VN).
3. Préparer un microtube stérile de 1,5 mL par transfection prévue et ajouter la quantité appropriée de plasmide rapporteur (c.-à-d. 50 ng ou 0,5 μL) et de plasmides BiFC caspase (c.-à-d. 300 ng ou 1 μL de C1 Pro-VC et 300 ng ou 1 μL de fragment C1 Pro-VN). Gardez les microtubes dans le capot en tout temps.
4. Placez la station de pipette, l’appareil, les embouts, les tubes d’électroporation et la pipette dans une hotte à écoulement laminaire stérile.
   REMARQUE: La station de pipette, l’appareil, les embouts, les tubes d’électroporation et la pipette sont inclus dans le système de transfection au néon.
5. Connectez le connecteur haute tension et le connecteur de capteur de la station de pipette aux ports arrière de l’appareil conformément aux instructions du fabricant. Gardez la station de pipette à proximité de l’appareil.
6. Connectez le cordon d’alimentation à l’entrée CA arrière et connectez l’appareil à la prise électrique. Appuyez sur l’interrupteur d’alimentation pour allumer l’appareil.
7. Entrez les paramètres de transfection dans l’écran de démarrage affiché lorsque l’appareil est allumé et correctement connecté. Appuyez sur Tension, entrez 1000 et appuyez sur Terminé pour régler la tension sur 1000 V. Appuyez sur Largeur, entrez 40 et appuyez sur Terminé pour régler la durée de l’impulsion à 40 ms. Enfin, appuyez sur # Pulses, entrez 2 et appuyez sur Terminé pour définir le nombre d’impulsions électriques sur 2.
8. Prenez l’un des tubes d’électroporation (fournis dans le kit) et remplissez-le de 3 mL de tampon électrolytique E (pour les embouts de 10 μL et fournis dans le kit) à RT. Insérez le tube d’électroporation dans le porte-pipette de la station de pipette. Assurez-vous que l’électrode sur le côté du tube est orientée vers l’intérieur et qu’un bruit de clic est entendu lorsque le tube est inséré.
9. Prenez la pastille de cellule de l’étape 3.8 et ajoutez 10 μL de tampon R de remise en suspension préchauffé (fourni dans le kit) pour chaque 1-2 x 10⁵ cellules. Mélanger doucement avec une micropipette p20. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire à chaque tube mis en place à l’étape 4.3 et mélanger doucement avec une micropipette p20.
10. Prenez la pipette et insérez une pointe en appuyant sur le bouton Poussoir jusqu’au deuxième arrêt. Assurez-vous que la pince ramasse complètement la tige de montage du piston dans la pointe et qu’aucun espace n’est observé dans la tête supérieure de la pipette.
11. Pour aspirer l’échantillon, appuyez sur le bouton poussoir de la pipette jusqu’au premier arrêt et plongez dans le premier tube contenant un mélange d’ADN cellulaire/plasmidique. Aspirer lentement le mélange dans l’extrémité de la pipette.
    REMARQUE: Évitez les bulles d’air car elles peuvent provoquer des arcs électriques pendant l’électroporation et, si elles sont détectées par l’appareil, peuvent empêcher la livraison de l’impulsion électrique. Si des bulles d’air sont observées, libérez le contenu dans le tube et essayez à nouveau d’aspirer.
12. Insérez la pipette avec l’échantillon très soigneusement dans le porte-pipette. Assurez-vous que la pipette clique et qu’elle est correctement placée.
13. Appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile et attendez que les impulsions électriques soient délivrées. Un message à l’écran indiquera l’achèvement.
14. Retirez lentement la pipette de la station et ajoutez immédiatement la suspension cellulaire transfectée dans le puits correspondant avec un milieu sans antibiotique préchauffé à partir de l’étape 2.4 en appuyant lentement sur le bouton-poussoir jusqu’au premier arrêt.
    REMARQUE: Cette pointe peut être réutilisée jusqu’à trois fois pour le même plasmide; sinon, jetez-le dans un conteneur à déchets à risque biologique en appuyant sur le bouton-poussoir jusqu’au deuxième arrêt.
15. Répétez les étapes 4.10 à 4.14 pour chaque tube contenant un mélange d’ADN cellulaire/plasmidique.
16. Bercez doucement la plaque avec des cellules transfectées et incubez pendant 1 à 3 h dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % de CO₂).
17. Ajouter à chaque puits 200 μL de milieu de culture préchauffé (milieu complet) à partir de l’étape 1.1.2. Replacez le plat dans l’incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % de CO₂). Prévoyez au moins 24 heures pour l’expression des gènes.
18. Le lendemain, inspectez la viabilité cellulaire et l’efficacité de la transfection à l’aide d’un microscope à épifluorescence.
    1. Allumez le microscope à épifluorescence et la boîte de source de lumière fluorescente selon les instructions du fabricant et placez la boîte de culture sur la scène du microscope.
    2. Sélectionnez l’objectif 10x ou 20x et le filtre 568 nm (RFP).
    3. Pour estimer la viabilité des cellules, appuyez sur le bouton LED de lumière transmise (TL) pour visualiser toutes les cellules du champ sélectionné. Tout en regardant dans l’oculaire du microscope, tournez le bouton de mise au point jusqu’à ce que les cellules soient observées et vérifiez la fixation des cellules dans le champ sélectionné.
       REMARQUE: Les cellules entièrement attachées représentent les cellules viables tandis que les cellules flottantes représentent les cellules non viables. Si la confluence du puits est élevée, la présence de cellules non attachées pourrait être le résultat d’une surestimation du nombre de cellules et non le résultat d’une faible viabilité. Cependant, une faible confluence accompagnée d’une teneur élevée en cellules flottantes signifie une faible viabilité qui peut résulter d’un arc électrique pendant l’électroporation, d’une toxicité plasmidique ou d’une surexposition au tampon R de remise en suspension. N’utilisez pas de puits qui affichent ce dernier comportement.
    4. Pour estimer l’efficacité de la transfection, concentrez-vous sur les cellules du champ sélectionné sous la lumière transmise comme décrit ci-dessus. Comptez le nombre total de cellules dans le champ sélectionné. Lorsque le voyant de lumière transmise (TL) est éteint, appuyez sur le bouton led de lumière réfléchie (RL) pour l’allumer.
    5. Concentrez-vous finement sur la fluorescence du gène rapporteur (globules rouges) et comptez le nombre total de cellules fluorescentes rouges. Répétez ces étapes (4.18.4-4.18.5) pour au moins deux champs supplémentaires par puits.

5. Traitement de l’acquisition de données MDM et caspase BiFC transfectées

REMARQUE: Si vous envisagez d’imager les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou confocal, un traitement par qVD-OPh (20 μM) pendant 1 h de traitement antérieur avec le stimulus choisi est conseillé pour prévenir la mort cellulaire dépendante de la caspase (principalement l’apoptose). Ceci est utilisé en imagerie pour empêcher les cellules de décoller en raison de l’apoptose, ce qui les rend très difficiles à imager lorsqu’elles sortent du plan focal. Notez que le recrutement de la caspase sur la plateforme d’activation et la caspase BiFC associée ne dépend pas de l’activité catalytique de la caspase, et par conséquent, l’inhibition de la caspase n’affectera pas cette étape.

1. Traiter avec le stimulus choisi environ 24 heures après la transfection et incuber aussi longtemps que nécessaire pour chaque médicament.
   1. Préparer le milieu imageur en complétant le milieu de culture de l’étape 1.1.2 avec de l’hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) et du 2-mercaptoéthanol (55 μM).
   2. Ajouter la concentration de stimulus souhaitée au milieu d’imagerie préchauffé et mélanger doucement.
   3. Retirez soigneusement le milieu des cellules à l’aide d’une micropipette p1000 et ajoutez 500 μL de la solution de stimulus de l’étape 5.1.2 sur le côté du puits.
   4. Pour faire fonctionner des puits de contrôle non traités, ajoutez un milieu d’imagerie sans le stimulus.
   5. Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % de CO₂) aussi longtemps que prévu pour chaque traitement.
2. Visualisez les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou confocale.
   1. Allumez le microscope et la source de lumière fluorescente en suivant les instructions du fabricant.
   2. Sélectionnez l’objectif 10x ou 20x et placez la boîte de culture sur la scène du microscope.
   3. À l’aide de l’oculaire du microscope, trouvez des cellules sous le filtre de 568 nm et concentrez-vous sur les cellules exprimant le rapporteur dsRedmito/mCherry (globules rouges).
   4. Comptez tous les globules rouges dans le champ visuel et enregistrez le nombre.
   5. Dans le même champ visuel, passez au filtre 488 ou 512 (GFP ou YFP), comptez le nombre de globules rouges qui sont également verts (Vénus positive ou BiFC positive) et enregistrez le nombre.
   6. Compter au moins 100 cellules dsRedmito/mCherry-positives à partir d’un minimum de trois champs visuels individuels.
   7. Calculez le pourcentage de cellules transfectées vénus-positives par champ visuel et faites la moyenne des pourcentages résultants pour chaque traitement (puits) pour obtenir l’écart-type.
3. Imagez les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou confocal
   REMARQUE: Pour acquérir des images confocales à l’aide d’un objectif 20x ou d’un grossissement supérieur, les cellules doivent être plaquées sur des paraboles en verre, sauf si le microscope est équipé d’un objectif à passe longue.
   1. Suivez les étapes 5.2.1 à 5.2.3. Si vous utilisez un microscope confocal avec l’objectif d’huile 40x, 60x ou 63x, placez une goutte d’huile sur l’objectif.
   2. Visualisez l’image en direct des cellules sur l’écran de l’ordinateur telle qu’acquise par la caméra. Utilisez la source de lumière d’épifluorescence pour les images fluorescentes ou passez la source lumineuse aux lasers pour les images confocales.
   3. Affinez la mise au point et la position des cellules à l’aide de la commande du joystick et de la molette de mise au point.
   4. Réglez le pourcentage de puissance laser et de temps d’exposition pour les lasers 512 nm ou 488 nm (YFP ou GFP) et 568 nm (RFP) afin que le signal de l’image soit beau et n’atteigne pas la saturation.
   5. Activez la capture en direct et examinez l’image résultante. Assurez-vous qu’un pic distinct est vu pour chaque fluor dans les histogrammes d’affichage pour les deux canaux.
   6. Ajustez la puissance du laser et le temps d’exposition si nécessaire. Gardez ces valeurs aussi basses que possible tout en étant capable de détecter les deux signaux fluorescents (RFP et GFP/YFP).
   7. Lors de la visualisation de l’image en direct des cellules, prenez plusieurs images représentatives d’un champ qui contient une ou plusieurs cellules exprimant le rapporteur mCherry/dsRedmito pour chaque puits de la plaque et enregistrez les données.

Le schéma illustré à la figure 2 donne un aperçu de la façon d’obtenir, de transfecter et d’imager le MDM humain. Après l’incubation des monocytes CD14+ sélectionnés avec GM-CSF pendant 7 jours, la morphologie cellulaire change au cours de la période de différenciation (figure 3A), passant des cellules de suspension sphériques à des cellules en suspension filiformes et complètement attachées (jours 3 et 4), et enfin à plus de cellules étalées lorsqu’elles sont complètement différenciées (jour 7). Les cellules entièrement différenciées sont ensuite détachées de la plaque et transfectées avec les paires biFC de caspase (VC et VN) avec le plasmide rapporteur (par exemple, dsRedmito, un plasmide codant pour une protéine fluorescente rouge ciblée sur les mitochondries), qui est utilisé pour marquer les cellules transfectées (Figure 3B) et utilisé pour évaluer l’efficacité de la transfection après 24 h. Figures 3B-D montrer un exemple de résultats BiFC utilisant les cellules transfectées caspase-1 pro BiFC traitées pendant 20 h avec de la nigericine (5 μM), un stimulus pro-inflammatoire connu qui déclenche l’assemblage de l’inflammasome NLRP3 30,31. Les cellules non traitées ne montrent aucune fluorescence de Vénus (Figure 3B), et dans les cellules traitées à la nigéricine, la caspase-1 BiFC apparaît comme un seul punctum avec la forme typique des taches ASC 32,33,25 (Figure 3C). La figure 3D montre un exemple de quantification du MDM positif à Vénus. Le pourcentage le plus élevé de caspase-1 BiFC est observé dans le groupe de traitement LPS + nigericine (figure 3D). Ce résultat est cohérent avec l’activation d’un inflammasome canonique, où un signal d’amorçage (LPS) et un signal intracellulaire (nigericine) sont nécessaires pour l’activation de capase-1.

Figure 3 : Différenciation des monocytes CD14 et transfection de MDM humaine. (A) Images représentatives en champ lumineux de monocytes CD14+ du sang périphérique exposés au GM-CSF aux jours 1, 3, 4 et 7 de différenciation (barre d’échelle, 100 μm). (B-C) Le MDM humain a été transfecté avec des paires BiFC pro caspase-1 et le rapporteur de transfection dsRedmito (50 ng, rouge). 24 h plus tard, les cellules ont été amorcées avec et sans LPS (100 ng/mL) pendant 3 h et traitées avec de la nigericine (5 μM) dans un milieu imageur pendant 20 h. Des images confocales représentatives de cellules non traitées et traitées à la nigéricine sont montrées (barre d’échelle, 10 μm). Le BiFC est affiché en vert. (D) Les cellules de (C) ont été évaluées pour le pourcentage de cellules dsRedmito-positives (rouges, cellules transfectées) qui étaient positives à Vénus (vert, complexe BiFC caspase-1) à 20 h. Les barres d’erreur représentent un DD d’au moins deux comptes indépendants par puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Un exemple de titrage plasmidique est illustré à la figure 4, où des quantités croissantes de chaque plasmide BiFC sont transfectées. Cela permet de sélectionner la dose optimale de plasmide, ce qui donne un signal spécifique et un arrière-plan minimal. La figure 4A montre les résultats du MDM humain transfecté avec des concentrations croissantes des paires biFC pro caspase-1, -4 et -5 (VC et VN) traitées avec de l’hème, une molécule hautement pro-inflammatoire qui résulte de la destruction des globules rouges34. Le pourcentage le plus élevé de cellules Vénus positives pour les paires biFC pro caspase-1, -4 et -5 résulte de 400 ng, 500 ng et 1000 ng de plasmide transfecté, respectivement. Cependant, l’utilisation de la plus grande quantité de plasmide risque également d’augmenter le fond non spécifique (figure 4B). Par exemple, la transfection de 1000 ng de la paire caspase-5 pro BiFC entraîne près de 40% d’arrière-plan non spécifique. Par conséquent, l’utilisation de la quantité inférieure de 700 ng est considérée comme optimale pour cette paire de plasmides (Figure 4B). Dans la figure 4C, des images confocales représentatives obtenues avec un objectif 20x d’un champ de cellules 24 h après la transfection sont montrées. Dans cette image, on peut voir que les cellules transfectées non traitées sont viables en fonction de l’apparence des mitochondries (les mitochondries dans les cellules mortes sont très fragmentées) et de la morphologie des cellules (les cellules apoptotiques sont rétrécies). Après traitement par hème, le complexe caspase-1 apparaît comme un seul punctum vert similaire à celui induit par la nigericine sur la figure 3C, et son apparition s’est accompagnée d’un rétrécissement cellulaire.

Figure 4 : MDM humain transfecté avec différentes quantités de paires de caspase inflammatoire pro BiFC. (A) Titrage de la caspase-1 pro ; caspase-4 pro; ou des paires BiFC caspase-5 pro. Le MDM humain a été transfecté avec les quantités indiquées de caspase pro BiFC paires avec dsRedmito comme rapporteur de transfection (50 ng) et incubé pendant la nuit. Le lendemain, le milieu de culture a été retiré de tous les puits et les cellules ont été traitées avec et sans hème (50 μM) dans un milieu FBS à 0,1 %. Après 1 h, une quantité égale de milieu complet a été ajoutée à tous les puits pour reconstituer la concentration de FBS à 5% et empêcher l’hème de tuer les cellules. Après un traitement total de 20 h, les cellules ont été évaluées pour le pourcentage de cellules transfectées dsRedmito-positives qui étaient positives à Vénus, déterminées à partir d’un minimum de 300 cellules par puits. Les barres d’erreur représentent un DD d’au moins trois comptes indépendants par puits. (B) Le MDM humain a été transfecté avec des quantités sélectionnées de caspase-1 pro; caspase-4 pro; ou des paires BiFC caspase-5 pro, avec dsRedmito (50 ng) comme rapporteur pour la transfection. 24 heures après la transfection, les cellules ont été traitées avec ou sans hème (50 μM) dans 0,1% FBS. Après 1 h, fbs a été reconstitué à 5% pour inhiber l’hème extracellulaire. Les cellules ont été évaluées pour le pourcentage de cellules dsRedmito-positives (rouges, cellules transfectées) qui étaient positives à Vénus (vert, complexe BiFC caspase) à 20 h déterminé à partir d’un minimum de 300 cellules par puits. Les résultats sont représentés en pourcentage de cellules Vénus positives. Les barres d’erreur représentent un DD d’au moins trois comptes indépendants par puits. (C) Images confocales représentatives obtenues avec un objectif 20x d’un champ de cellules 24 h après la transfection et traitées avec et sans hème comme décrit au point B). Rouge: cellules dsRedmito-positives; Vert: cellules Vénus positives; Barre d’échelle, 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.