Test des membres recombinants du poulet pour comprendre la morphogenèse, la modelation et les premières étapes de la différenciation cellulaire

Résumé

Les membres recombinants sont un modèle expérimental puissant qui permet d’étudier le processus de différenciation cellulaire et la génération de motifs sous l’influence de signaux embryonnaires. Ce protocole présente une méthode détaillée pour générer des membres recombinants avec des cellules mésodermiques de membres de poulet, adaptables à d’autres types de cellules obtenues à partir de différents organismes.

Résumé

La différenciation cellulaire est le processus affiné de l’engagement cellulaire conduisant à la formation de différents types de cellules spécialisées lors de l’établissement de tissus et d’organes en développement. Ce processus est activement maintenu à l’âge adulte. La différenciation cellulaire est un processus continu au cours du développement et de l’homéostasie des organes. Comprendre les premières étapes de la différenciation cellulaire est essentiel pour connaître d’autres processus complexes tels que la morphogenèse. Ainsi, les membres de poulet recombinants sont un modèle expérimental qui permet d’étudier la différenciation cellulaire et la génération de motifs sous des signaux de motifs embryonnaires. Ce modèle expérimental imite un environnement in vivo ; il assemble des cellules réagrégées en une couverture ectodermique obtenue à partir d’un bourgeon de membre précoce. Plus tard, les ectodermes sont transférés et implantés dans un récepteur embryonnaire de poussin pour permettre son développement. Ce test a été principalement utilisé pour évaluer les cellules des bourgeons des membres mésodermiques; cependant, il peut être appliqué à d’autres cellules souches ou progénitrices d’autres organismes.

Introduction

Le membre vertébré est un formidable modèle pour étudier la différenciation cellulaire, la prolifération cellulaire, la mort cellulaire, la formation de motifs et la morphogenèse ^1,2. Au cours du développement, les membres émergent sous forme de renflements des cellules dérivées du mésoderme à plaque latérale¹. Les bourgeons des membres sont constitués d’un noyau central de cellules mésodermiques recouvertes d’un ectoderme. De cette structure précoce, un membre entier et bien formé émerge. Après l’apparition du bourgeon du membre, trois axes sont reconnus: (1) l’axe proximo-distal ([] é....

Protocole

Cette recherche a été examinée et approuvée par le Comité d’examen institutionnel pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico, Mexique). Un organigramme schématique des étapes générales de ce protocole est illustré à la figure 1A.

1. Incubation embryonnaire et détermination de la viabilité

1. Incuber des œufs de poule fécondés à 38 °C et 60 % d’humidité relative pendant environ trois jours et demi jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de 22 HH (selon Hamilton et Hamburger, 195....

Résultats

Reconnaître un membre recombinant bien performant
Après la greffe, les embryons manipulés ont été renvoyés dans l’incubateur pour permettre au RL de se développer. Le temps d’incubation était en corrélation avec les exigences de l’expérience. Néanmoins, le RL peut être facilement distingué après 12 h d’implantation. Pour déterminer si l’implantation était adéquate, le LR a été observé comme une protubérance solidement fixée à la paroi mésodermique de l’embryon donneur (figure 2A

Discussion

En général, le protocole RL peut être divisé en cinq étapes: (1) l’incubation d’embryons, (2) l’obtention de cellules mésodermiques de membres pour remplir les ectodermes, (3) l’obtention des ectodermes, (4) l’assemblage de cellules mésodermiques à l’intérieur des couvertures ectodermiques, et (5) la transplantation des ectodermes remplis dans les embryons hôtes. La principale limite de la technique RL est le protocole long et détaillé, qui comporte de nombreux points critiques qui nécessitent de la patience pour fonctio.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Couteau à fente coudé	Alcon	2.75mm DB
Pince émoussée	Fine Science Tools	11052-10
Collagénase type IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Incubateur d’œufs	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Sérum fœtal bovin	Gibco	16000069
Pince chirurgicale fine	Outils scientifiques	fins 9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Microcentrifugeuse	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA	NA Fil
palladium	GoodFellow	7440 05-3
Boîte de Pétri	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stéréomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA Trypsine
porcine	Merck	9002 07-7
Aiguille tungstène	GoodFellow	E74-15096/01

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