Ce protocole décrit un modèle animal composite avec exposition à des particules (PM) qui aggrave l’ischémie myocardique avec athérosclérose.
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Article de méthode
Aggravation de l’ischémie myocardique lors de l’exposition aux particules dans un modèle animal d’athérosclérose
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les problèmes de santé causés par la pollution de l’air (en particulier la pollution particulaire) attirent de plus en plus l’attention, en particulier chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires, ce qui aggrave les troubles compliqués et provoque un mauvais pronostic. Le modèle d’exposition à l’ischémie myocardique simple (IM) ou aux particules (PM) ne convient pas à de telles études de maladies aux causes multiples. Ici, une méthode de construction d’un modèle composite combinant l’exposition aux particules, l’athérosclérose et l’ischémie myocardique a été décrite. Les souris ApoE−/− ont été nourries avec un régime riche en graisses pendant 16 semaines pour développer l’athérosclérose, l’instillation trachéale de suspension standard PM a été effectuée pour simuler l’exposition pulmonaire aux particules et l’artère coronaire descendante antérieure gauche a été ligaturée une semaine après la dernière exposition. L’instillation trachéale de particules peut simuler une exposition pulmonaire aiguë tout en réduisant considérablement le coût de l’expérience; La ligature classique de l’artère descendante antérieure gauche avec intubation trachéale non invasive et un nouveau dispositif d’expansion auxiliaire peuvent assurer le taux de survie de l’animal et réduire la difficulté de l’opération. Ce modèle animal peut raisonnablement simuler les changements pathologiques du patient de l’infarctus du myocarde aggravé par la pollution de l’air et fournir une référence pour la construction de modèles animaux liés à des études impliquant des maladies aux causes multiples.
Introduction
La pollution atmosphérique a été associée à une mortalité élevée toutes causes confondues et a contribué à une charge de morbidité importante plus que la somme de la pollution de l’eau, de la pollution des sols et de l’exposition professionnelle1. Un rapport de l’OMS a révélé que la pollution de l’air extérieur a causé 4,2 millions de décès prématurés dans les villes et les zones rurales du monde entier en 20162. 91% de la population mondiale vit dans des endroits où la qualité de l’air dépasse les limites recommandées par l’OMS2. En outre, les particules fines (PM) (≤2,5 μm de diamètre, PM2,5) sont reconnues comme la menace la plus importante de pollution atmosphérique pour la santé publique mondiale3, en particulier pour les personnes qui vivent dans les villes des pays à faible revenu et à revenu intermédiaire.
Les effets néfastes de la pollution atmosphérique sur les maladies cardiovasculaires méritent plus d’attention. Des études antérieures ont montré que les particules entraînent un risque accru de maladies cardiovasculaires (MCV)4. L’exposition à de fortes concentrations de particules ultrafines pendant plusieurs heures peut entraîner une augmentation de la mortalité par infarctus du myocarde. Pour les personnes ayant des antécédents d’infarctus du myocarde, l’exposition à des particules ultrafines peut augmenter considérablement le risque de récidive5. De plus, il est généralement admis que l’exposition aux particules accélère la progression de l’athérosclérose6.
Pour la recherche médicale, il est crucial de choisir un modèle animal approprié. Les modèles animaux simples d’athérosclérose 7, l’ischémie myocardique modèles animaux 8 et lesmodèles animauxd’exposition aux particules9 existent déjà. ApoE−/− (apolipoprotéine E assommée) souris est un modèle murin traditionnel utilisé dans les études sur l’athérosclérose. La capacité d’éliminer les lipoprotéines plasmatiques chez les souris ApoE−/− est gravement altérée. L’alimentation riche en graisses provoquerait une athérosclérose sévère, ressemblant à la dépendance alimentaire de la cardiopathie athéroscléreuse observée chez l’homme7. La ligature de l’artère coronaire descendante antérieure gauche (DAL) est une méthode classique pour induire l’événement ischémique 8,10. La perfusion trachéale a été utilisée dans de nombreuses recherches et se distingue des modèles d’exposition11,12 en raison de sa meilleure simulation et de son coût inférieur.
Cependant, les modèles animaux d’une seule maladie ont des limites importantes dans la recherche scientifique. L’ischémie myocardique induite simplement par la ligature LAD n’est pas simulée dans la situation réelle. À l’état naturel, l’ischémie myocardique est généralement causée par la rupture de la plaque et le blocage des artères coronaires13. Les patients atteints de cardiomyopathie ischémique présentent généralement des lésions basiques athéroscléreuses13. Il existe également un métabolisme lipidique anormal et des réactions inflammatoires dans le corps14. Par conséquent, l’ischémie causée par des facteurs physiques ou dans des conditions naturelles a différentes manifestations pathologiques. Des études existantes ont montré que l’infarctus et l’inflammation dans les modèles d’ischémie myocardique avec athérosclérose sont plus graves15,16. L’exposition aux particules peut aggraver davantage l’athérosclérose et l’ischémie myocardique en induisant une inflammation et un stress oxydatif1. Trois facteurs coexistent généralement à l’état naturel, de sorte que la situation réelle pourrait être mieux simulée en utilisant un modèle composé.
Ce protocole décrit le développement d’un modèle animal d’ischémie myocardique (IM) combinant l’athérosclérose (SA) et l’exposition aiguë aux particules. Les souris ApoE−/− ont été nourries avec un régime riche en graisses pour induire l’athérosclérose. L’exposition pulmonaire aux particules a été imitée par une suspension de particules dégoulinante à travers la trachée. La ligature du LAD chez la souris a été utilisée pour induire une ischémie myocardique. Ces méthodes ont été combinées et optimisées pour mieux simuler l’état de la maladie et améliorer le taux de survie des animaux. Aucune grande unité d’exposition ou machine d’anesthésie gazeuse n’est nécessaire, ce qui rend l’expérience facile à réaliser. Ce modèle peut être utilisé pour étudier l’impact de l’exposition aux particules dans la pollution atmosphérique sur l’athérosclérose et la cardiomyopathie ischémique et mener des recherches sur de nouveaux médicaments développés pour traiter des maladies avec des facteurs aussi complexes.
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Protocole
Toutes les activités animales décrites ici ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Institut de matière médicale chinoise de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises. Des souris mâles ApoE−/− (fond C57BL/6) âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées pour l’étude.
1. Préparation expérimentale
- Préparer des anesthésiques au tribromoéthanol (15 mg/mL) : dissoudre 0,75 g de tribromoéthanol dans 1 mL d’alcool tert-amylique (voir le tableau des matières). Après dissolution complète, diluer à 50 mL avec une solution saline stérile. Conserver la solution à 4 °C dans un récipient stérile et éviter l’exposition à la lumière.
NOTE: Dans ce protocole, le tribromoéthanol a été utilisé en raison du temps de récupération optimal de l’anesthésie et du taux de survie des animaux. Suivez les recommandations du comité d’éthique animale local lors du choix du régime d’anesthésie. - Préparer la suspension de particules : mesurer 5 mg de DPM (particules diesel, voir le tableau des matières) dans des tubes à centrifuger de 10 mL. Ajouter 5 ml de solution saline normale et retourner le tube pour bien mélanger. Utilisez un film de paraffine pour sceller le tube, puis mettez-le dans un nettoyeur à ultrasons pendant 2-3 h (40KHz, 80w) pour la rupture par ultrasons.
NOTA: La suspension doit être homogène et exempte de particules agglomérées. Bien agiter avant utilisation.
2. Induction de l’athérosclérose chez la souris
- Nourrissez les souris avec un régime riche en graisses (poudre de jaune d’œuf 10%, saindoux 10%, stérol 1%, aliment d’entretien 79%, voir tableau des matériaux) pendant 12 semaines.
- Pour estimer la progression de l’athérosclérose, sélectionnez 2-3 souris au hasard et vérifiez s’il y a une plaque dans l’arc aortique par imagerie échographique ou observation anatomique directe17.
NOTE : Pour l’observation anatomique, les animaux ont été sélectionnés par échantillonnage aléatoire et euthanasiés après anesthésie. Ensuite, leur cavité thoracique a été ouverte et les vaisseaux sanguins ont été directement visualisés. L’observation anatomique est généralement plus fiable parce que l’imagerie par ultrasons peut ne pas détecter toutes les plaques. - Une fois que l’athérosclérose a jugé formé, préparez les souris pour l’étape suivante.
3. Intubation orotrachéale et exposition aiguë aux particules
REMARQUE: PM sera exposé une fois par semaine pendant 4 semaines après 12 semaines d’alimentation riche en graisses et continuellement donné un régime riche en graisses.
- Préparez une planche de dissection (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un élastique fixé à 1,5 cm du bord supérieur. Fixez la planche de dissection à un angle de 60° par rapport au plan de la table.
- Anesthésier la souris à l’aide d’un anesthésique au tribromoéthanol par injection intrapéritonéale (0,1 mL pour 10 g de poids corporel). Après 2-3 min, tournez la souris pour vérifier s’il y a un réflexe de redressement. Effectuez un pincement des orteils pour confirmer la sédation. Laisser tomber un lubrifiant stérile sur les yeux.
- Désinfectez la planche de dissection avec des lingettes imbibées d’alcool.
- Placez la souris anesthésiée en décubitus dorsal sur la planche et accrochez les incisives supérieures à l’élastique.
- Utilisez un petit projecteur LED (voir le tableau des matériaux) avec un tuyau flexible. Concentrez la lumière sur la trachée, qui se trouve autour du point médian de la ligne axillaire.
- Mettez un petit coton-tige stérile dans la bouche de la souris, puis roulez l’écouvillon pour sortir la langue.
- Tenez la langue et tirez-la doucement vers le haut pour faire la cavité buccale, le pharynx et la trachée dans la même direction longitudinale. La glotte, qui est l’entrée de la trachée, sera montrée comme un point lumineux, qui s’ouvre et se ferme à chaque respiration.
- Continuez à tenir la langue doucement. Insérez la canule (22 G) dans la trachée de la souris en visant la glotte, en tirant le noyau de l’aiguille après l’insertion de la canule dans la trachée.
- Utilisez un pistolet à pipette avec une petite quantité de solution saline normale pour vérifier si le tube est correctement dans la belette. Si le tube est à la bonne position, la colonne de liquide dans le pistolet à pipette rebondira à chaque respiration.
- Déposer 50 μL de suspension DPM (préparée à l’étape 1.2) dans le tube à l’aide d’un pistolet à pipette. La suspension sera naturellement inhalée dans les poumons de la souris lorsqu’elle respire.
REMARQUE: Pour assurer une respiration en douceur, il est préférable de donner à la souris deux fois la suspension DPM (25 μL pour une fois), à 10 s d’intervalle. - Retirez l’aiguille à demeure de l’animal après une exposition aux particules. Attendez que la souris reste sur les coussins chauffants jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience (10-20 min), puis replacez-la dans la cage de la maison.
4. Ligature des artères coronaires
REMARQUE: L’opération de modélisation de l’ischémie myocardique (ligature de l’artère coronaire) est effectuée à la 16ème semaine.
- Préparer les instruments chirurgicaux. Après l’autoclavage, rangez tous les outils chirurgicaux dans une boîte à instruments scellée. Trempez-les dans de l’alcool à 75% pendant 20-30 minutes avant la chirurgie.
- Construire la plateforme chirurgicale. Pour obtenir la pente appropriée de la plate-forme, utilisez un couvercle de boîte de culture cellulaire (150 mm x 25 mm). Pliez la soie 0-0 (longueur 10-15 cm) en deux et fixez les extrémités du fil au sommet de la plate-forme inclinée à l’aide de ruban adhésif pour créer une boucle de suspension.
- Anesthésier les souris en suivant la procédure décrite à l’étape 3.2.
NOTE: Un intervalle de 1 semaine doit être assuré entre chaque administration de tribromoéthanol. - Désinfectez la plate-forme avec des lingettes alcoolisées.
- Placer la souris en décubitus dorsal sur la plate-forme d’intubation et accrocher les incisives supérieures à la boucle de suspension décrite à l’étape 4.2. Scotchez la queue, les membres et les moustaches.
- Enlevez les poils de la poitrine gauche et une partie de la poitrine droite adjacente avec une crème dépilatoire avant la chirurgie.
- Effectuer une intubation orotrachéale chez la souris en suivant la procédure décrite aux étapes 3.4-3.8.
- Reliez l’aiguille à demeure de l’animal à un ventilateur pour animaux (voir le tableau des matériaux). Réglage du ventilateur: fréquence respiratoire - 120 fois / min; rapport inhalation/respiration - 1:1,1; volume courant - 1,7 mL.
- Essuyez la peau avec de l’iodophor et de l’alcool pour désinfecter.
- Exposez le cœur. Faites une coupe de peau de 0,5 à 1 cm à l’aide de ciseaux ophtalmiques et attachez les muscles (muscle superficiel pectoral et muscle serratus antérieur) pour exposer les côtes. Serrez la côte avec une pince ophtalmique (avec des crochets), puis faites une petite incision au troisième espace intercostal (voir Tableau des matériaux). Faites une fenêtre d’opération avec des outils d’ouverture de coffre faits maison.
REMARQUE: La coupe de la peau est située à environ un tiers du processus xiphoïde et de la ligne d’aisselle. - Déchirez les membranes péricardiques. Ensuite, il est possible de ligaturer LAD en suivant les étapes 4.11-4.14.
REMARQUE: Si les lobes pulmonaires bloquent la vue, poussez-le derrière le cœur à l’aide d’un petit coton-tige stérile. - Dans un premier temps, localisez le DAL.
- Tenez la suture de soie stérile 6-0 avec une aiguille à l’aide d’une pince hémostatique microvasculaire (voir le tableau des matériaux). Passez la soie à travers une largeur de myocarde de 2 mm dans la zone où se trouve l’artère coronaire.
REMARQUE: N’essayez pas de ligaturer le LAD seulement, ce qui peut provoquer une hémorragie peropératoire majeure. - Placez un court morceau de soie stérile 5-0 entre la ligature et les tissus myocardiques pour éviter la rupture des tissus.
- Attachez fermement le DAL et le petit faisceau de myocarde qui l’entoure. La ligature est considérée comme réussie lorsque la paroi antérieure du ventricule gauche (VG) devient pâle; L’élévation du segment ST peut être observée simultanément si un appareil d’électrocardiogramme est connecté.
- Pressez doucement l’air de la poitrine. Suture des muscles intercostaux et de la peau séquentiellement avec de la soie stérile 5-0.
REMARQUE: Pour presser l’air de la poitrine, fermez la poitrine au moment de l’expansion pulmonaire et utilisez l’index et le majeur pour presser doucement la cage thoracique au milieu et permettre à l’air de s’échapper au-delà de la dernière maille. Les seringues peuvent également être utilisées pour extraire le gaz thoracique.
REMARQUE: Une simple suture interrompue est recommandée, car les souris peuvent ronger la soie lorsqu’elles sont éveillées.
5. Récupération
- Nettoyez toutes les taches de sang après la chirurgie, sinon la souris serait attaquée par d’autres.
- Placez la souris sur un coussin chauffant en position couchée latérale. Surveillez continuellement les signes de la souris pendant 5 à 20 minutes jusqu’à ce qu’elle se rétablisse de l’anesthésie. Le temps de surveillance dépend de l’état du corps.
REMARQUE: Les souris respirent plus facilement en position couchée latérale. - Une fois le réflexe de redressement récupéré, transférez les souris dans des cages de récupération propres sur un coussin chauffant avec de la nourriture et une bouteille d’eau. Continuez à surveiller pendant 15-30 min pour assurer la survie de la souris. Gardez la souris à l’écart des autres avant qu’elle ne puisse se déplacer de manière entièrement autonome.
- Pour prévenir l’infection de la plaie, injectez de la pénicilline sodique par voie intramusculaire selon la dose souhaitée (1 00 000-1 50 000 U/kg). Pour plus de détails, veuillez vous référer à l’étiquetage du médicament pour la conversion de dosage.
- Replacez la souris dans la cage d’accueil. Continuez à surveiller pendant les prochaines 24 heures avant le prélèvement de l’échantillon. Administrer des analgésiques pour des expériences à long terme.
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Résultats
Les souris ont été euthanasiées 24 heures après la ligature de l’artère coronaire et le sang a été prélevé après l’anesthésie. Les souris ont été anesthésiées au tribromoéthanol (conformément à l’étape 3.2) et l’échantillon de sang a été prélevé dans le sinus rétroorbitaire. Le cœur a été récolté et le degré d’ischémie a été examiné par coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) (figure 1). Les tissus normaux deviennent rouges lorsque le TTC réagit avec la su...
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Discussion
L’établissement d’un modèle animal composite est légèrement différent du modèle d’IM unique. Le maintien d’un taux de survie élevé est difficile dans le développement du modèle composite. La gravité de l’athérosclérose chez les souris ApoE−/− deviendra plus sévère avec l’allongement du temps d’alimentation riche en graisses7, et la faiblesse des souris entraîne une mortalité accrue. Par conséquent, il est nécessaire de surveiller continuellement l’état des souris pendant l’expérience et...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à déclarer.
Remerciements
Ce modèle a été développé avec le soutien de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81673640, 81841001 et 81803814) et du Major National Science and Technology Program of China for Innovative Drug (2017ZX09301012002 et 2017ZX09101002001-001-3).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoéthanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 75 % d’alcool | |||
| Ventilateur pour animaux | Shanghai Alcott Biotech | ALC-V8S | |
| Cotons-tiges | Stériles | ||
| Cotons-tiges pour bébés | Stériles , Environ 3 mm de diamètre | ||
| Plat | de cultureCorning | 430597 | 150 mm x 25 mm |
| Diesel Particulate Matter | National Institute of Standards Technology | 1650b | |
| Panneau | Environ 25 x 17 cm. La planche de dissection peut être remplacée par une planche en bois de la même taille | ||
| Régime riche en graisses pour souris | Prescription : poudre de jaune d’œuf 10 %, saindoux 10 %, stérol 1 %, alimentation d’entretien 79 % | ||
| Iodophor | |||
| désinfectant LED projecteur | V, 3 W, avec tuyaux et pinces | ||
| Boule de fil de soie médicale | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 0-0 |
| Ruban médical | 3M | 1527C-0 | |
| Pince hémostatique microvasculaire | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | W40350 | |
| Porte-aiguilles | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JC32010 | |
| Saline | |||
| normaleCiseaux ophtalmiques | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | Y00040 | |
| Pince à épiler ophtalmique, 10cm, incurvée, avec crochets | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JD1080 | |
| Pince à épiler ophtalmique, 10cm, incurvée, avec dents | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JD1060 | |
| Embouts de pipette | Axygen | T-200-Y-R-S | 0-200 &mu ; L |
| Pipette | eppendorf | 3121000074 | 100 uL |
| Goupille | Environ 4,5 cm de longueur, pour la fabrication d’outils d’ouverture thoracique | ||
| Canules I.V. pour petits animaux | Baayen healthcare suzhou | BAAN-322025 | I.V CATHETER 22FG x 25 MM |
| Aiguille de suture avec fil | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 6-0, Fil de nylon |
| Aiguille de suture avec fil | JinHuan Medical | F503 | 5-0 |
| Seringue | 1 mL | ||
| Tert-amylique | |||
| Zoom-stéréomicroscope | Mshot | MZ62 |
Références
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Réimpressions et autorisations
